李 皓，陳 滸，朱 峰2，*，梁瀅瀅，梁曉棠，陳佳珊，曾玉環(huán)

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528225；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院佛山市活性天然產(chǎn)物與功能化學(xué)品工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528000；3.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，廣東 佛山 528000）

從禿馬勃屬Calvatia sp.真菌已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多具有重要生物活性的化學(xué)成分［1］，例如從粟粒皮禿馬勃C.boninensis 分離到一個(gè)具有轉(zhuǎn)譯抑制、抗增值、抗有絲分裂活性的新蛋白calcaelin［2-3］，從頭狀禿馬勃C.craniiformis［4］和紅黃禿馬勃C.rubro-flava［5］發(fā)現(xiàn)了系列對(duì)羥基苯基重氮甲酰胺衍生物和甾體化合物，從杯形禿馬勃C.cyathiformis 分離獲得系列新的甾體化合物［6-8］，從大禿馬勃C.gigantea 發(fā)現(xiàn)了抗腫瘤物質(zhì)馬勃菌素calvacin［9］，從紫色禿馬勃C.lilacina［10-11］和頭狀禿馬勃C.craniiformis［12］中分離到抗細(xì)菌和抗真菌馬勃酸。特別是，BENTLEY 等［13］研究表明大禿馬勃C.gigantea 脂肪酸成分主要是棕櫚酸、油酸和亞油酸。藥食兩用禿馬勃屬Calvatia sp.高等真菌白禿馬勃Calvatia candida（Rostk.）Hollós，喜生于草地上，在我國分布廣泛，常用于消炎、解熱、利喉、止血等作用［14］，但罕見白禿馬勃C.candida 化學(xué)成分的研究報(bào)道。前期研究［15］表明，白禿馬勃甲醇粗提物具有有效的抗氧化活性，含有生物堿、甾體和萜類化學(xué)成分。本文進(jìn)一步對(duì)該菌粗脂肪化學(xué)成分進(jìn)行研究，旨在為白禿馬勃的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Bruker AV-400 核磁共振波譜儀（瑞士Bruker Corporation，溶劑CDCl3，內(nèi)標(biāo)TMS）；Esquire HCT-Agilent 1200 型質(zhì)譜儀（德國Bruker 公司）；450 型氣相色譜串聯(lián)320 型四級(jí)桿質(zhì)譜儀（德國Bruker公司）；BioTek Elx800 酶標(biāo)儀（美國賽默飛公司）。所用試劑均為市售分析純和色譜純?cè)噭?/p>

白禿馬勃菌于2017 年7 月30 日采自廣東省佛山市千燈湖景區(qū)草坪，經(jīng)佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院盧衛(wèi)紅副教授鑒定為白禿馬勃真菌Calvatia candida（Rostk.）Hollós。

1.2 白禿馬勃粗脂肪的制備

參照國標(biāo)GB5009168-2016［16］制備白禿馬勃粗脂肪。將采摘的新鮮野生菌子實(shí)體剪碎風(fēng)干，稱取500 g 干燥子實(shí)體用乙醚連續(xù)滲漉回流提取24 h。乙醚提取液用50 ℃水浴加熱蒸餾回收乙醚得粗脂肪47.45 g，提取率9.49%。

1.3 白禿馬勃粗脂肪化學(xué)成分分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定

將白禿馬勃粗脂肪用硅膠拌樣，通過硅膠柱色譜進(jìn)行分離純化，先用正己烷-乙酸乙酯（90∶10，v/v）混合溶劑洗脫得到白禿馬勃菌油1.40 g，再繼續(xù)用正己烷-乙酸乙酯（80∶20，v/v）混合溶劑洗脫，先后得到化合物MB1（80 mg）和MB2（50 mg），通過ESI-MS、1D NMR 和2D NMR 對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.4 白禿馬勃菌油脂肪酸組成分析

甲酯化：參照國標(biāo)［16］，稱取白禿馬勃菌油100 mg，加入石油醚-苯（1∶1，v/v）混合溶劑4 mL，震蕩溶解后加入0.4 mol/L 氫氧化鉀的甲醇溶液4 mL，振蕩3 min，在4 000 r/min 下離心10 min，取上清液進(jìn)行GC-MS 分析。

色譜條件：色譜柱采用DB-5MS 石英毛細(xì)管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；升溫程序設(shè)置起始溫度50 ℃，以5 ℃/min 速度升溫至150 ℃后，再以15 ℃/min 速度升溫至300 ℃，保持20 min；進(jìn)樣口溫度280 ℃，進(jìn)樣量1 μL；分流比1∶10；載氣為氦氣，載氣流速1.0 mL/min。

質(zhì)譜條件：EI 離子源，電離源能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z 35～600。

1.5 白禿馬勃菌油DPPH 自由基清除試驗(yàn)

改進(jìn)文獻(xiàn)［17］方法，采用96 孔板測(cè)定樣品對(duì)DPPH 自由基的清除活性。白禿馬勃菌油用無水乙醇稀釋成30.0 mg/mL 的樣品溶液。準(zhǔn)確吸取一定體積樣品溶液依次加入到96 微孔板中，然后加入無水乙醇至每孔體積100 μL，使得每孔菌油濃度依次為3～30 mg/mL，再各加入100 μL 新鮮配制的DPPH 乙醇溶液（0.2 mmol/L），蓋上板蓋置于酶標(biāo)儀中震蕩均勻，然后于25 ℃恒溫避光反應(yīng)30 min 后，取出板蓋，以無水乙醇為空白對(duì)照，在510 nm 波長(zhǎng)讀取各孔吸光度值并計(jì)算自由基清除率（%RSA）。半數(shù)清除濃度（IC50）定義為自由基清除率為50%時(shí)所需樣品的濃度。試驗(yàn)平行測(cè)定3 次?？箟难釣閰⒄?。自由基清除率計(jì)算公式為：%RSA=［1－（Ai－A）j/Ao］×100。其中：Ai為100 μL 樣品和100 μL DPPH 混合物的吸光度值，Aj為100 μL 樣品和100 μL 無水乙醇混合物的吸光度值，Ao為100 μL DPPH 和100 μL無水乙醇混合物的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 白禿馬勃菌油脂肪酸組成及含量

從500 g 白禿馬勃中獲得菌油1.40 g，菌油產(chǎn)率為0.28%，說明菌油在干燥白禿馬勃子實(shí)體中占比較低。其脂肪酸組成分析結(jié)果見表1。脂肪酸組成分析結(jié)果說明，白禿馬勃菌油以不飽和脂肪酸為主，含量占71.60%，其中多不飽和脂肪酸亞油酸含量占44.11%，單不飽和脂肪酸油酸含量占27.49%，而飽和脂肪酸中，以棕櫚酸為主，含量占17.60%。

表1 白禿馬勃菌油脂肪酸組成和含量

2.2 白禿馬勃菌油清除DPPH 活性

以白禿馬勃菌油濃度為橫坐標(biāo)，DPPH 自由基清除率為縱坐標(biāo)，得到白禿馬勃菌油清除DPPH 自由基活性圖，見圖1。

從圖1 可以看出，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，白禿馬勃菌油具有一定的清除DPPH 自由基抗氧化活性，而且其活性呈濃度依賴關(guān)系，菌油DPPH自由基清除能力隨著菌油濃度增大而相應(yīng)增強(qiáng)。通過多項(xiàng)式擬合計(jì)算得到半數(shù)清除濃度IC50值為26.61 mg/mL。

圖1 白禿馬勃菌油清除DPPH 自由基活性

2.3 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

從白禿馬勃粗脂肪分離純化得到的2 個(gè)化合物MB1 和MB2 均為無色針狀結(jié)晶。ESI-MS 譜提示化合物MB1 的準(zhǔn)分子離子峰在m/z 493.5［M+Na］+。綜合1H NMR、13C NMR 和DEPT 譜得知該化合物含有30 個(gè)碳原子和46 個(gè)質(zhì)子，從而推測(cè)其分子式為C30H46O4，不飽和度為8。NMR 譜圖顯示典型的麥角甾類化合物特征。18 位和19 位的2 個(gè)角甲基的碳譜和氫譜信號(hào)分別在13.01（q，C-18）和0.81（s，H-18）以及18.20（q,C-19）和0.90（s,H-19），17 位支鏈的4 個(gè)甲基的碳譜和氫譜信號(hào)分別在21-CH（319.77和0.82）、26-CH3（20.09 和0.83）、27-CH3（21.01 和1.00）以及28-CH3（17.71 和0.91）。麥角甾類化合物3 位連氧原子次甲基的碳譜和氫譜特征信號(hào)在69.62（d，C-3）和4.98（m，H-3）。另外，在135.21（d，C-6）和6.23（d，H-6）以及131.04（d，C-7）和6.51（d，H-7）給出一組環(huán)內(nèi)雙鍵特征，在132.43（d，C-22）和5.22（dd，H-22）以及135.33（d，C-23）和5.14（dd，H-23）給出一組環(huán)外雙鍵特征。特別是，在170.26（s）以及21.46（q）和2.02（s）還給出一組乙?；盘?hào)。通過HSQC 對(duì)化合物MB1 的碳譜和氫譜化學(xué)位移進(jìn)行歸屬，結(jié)果見表2。綜合解析1H NMR、13C NMR、DEPT、gCOSY、HSQC 和HMBC 譜，并與文獻(xiàn)［18］對(duì)比，鑒定該化合物為麥角甾-5，8-表二氧-6，22-二烯-3-乙酸酯，結(jié)構(gòu)式見圖2。

圖2 化合物MB1 和MB2 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

ESI-MS 譜提示化合物MB2 的準(zhǔn)分子離子峰在m/z 451.4［M+Na］+，比化合物MB1 少42。綜合1H NMR、13C NMR 和DEPT 譜得知該化合物含有28 個(gè)碳原子和44 個(gè)質(zhì)子，從而推測(cè)其分子式為C28H44O3，不飽和度為7。其氫譜和碳譜特征與化合物MB1 的非常相似，不同點(diǎn)在于少了一個(gè)乙酰基信號(hào)特征。通過HSQC 對(duì)化合物MB2 的碳譜和氫譜化學(xué)位移進(jìn)行歸屬，結(jié)果見表2。綜合解析1H NMR、13C NMR、DEPT、gCOSY、HSQC 和HMBC 譜，并與文獻(xiàn)［19］對(duì)比，鑒定該化合物為麥角甾-5，8-表二氧-6，22-二烯-3-醇，結(jié)構(gòu)式見圖2。

表2 化合物MB1 和MB2 的NMR 數(shù)據(jù)

3 討論與結(jié)論

脂類是食用菌中研究最少的成分，因?yàn)樗鼈冊(cè)谝阎秤镁械目偤繋缀醪怀^干重的6%～8%。然而低脂含量則是食用菌作為營養(yǎng)食品的優(yōu)勢(shì)之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白禿馬勃菌油在其干燥子實(shí)體中含量甚微，僅占0.28%。GC-MS 分析表明該菌油以亞油酸、油酸和棕櫚酸為主。自由基清除試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌油在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)具有一定的清除DPPH 自由基活性，IC50值為26.61 mg/mL，并且自由基清除活性呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系。白禿馬勃菌油中高含量不飽和脂肪酸的存在以及它具有一定的自由基清除活性，展現(xiàn)出白禿馬勃菌油作為新型保健菌油的開發(fā)應(yīng)用前景。

NMR 技術(shù)在鑒定化合物結(jié)構(gòu)中具有重要的作用［20］。從白禿馬勃粗脂肪還分離純化得到2 個(gè)化合物，通過綜合解析ESI-MS 譜和NMR 譜，確定它們分別為麥角甾-5，8-表二氧-6，22-二烯-3-乙酸酯（MB1）和麥角甾-5，8-表二氧-6，22-二烯-3-醇（MB2）。作為天然產(chǎn)物，麥角甾-5，8-表二氧-6，22-二烯-3-乙酸酯最早發(fā)現(xiàn)于海綿附生真菌Talaromyces trachyspermus（KUFA 0021），在高濃度256 μg/mL 時(shí)對(duì)受試革蘭氏陽性細(xì)菌（Staphylococcus aureus ATCC 25923 和Bacillus subtilis ATCC 6633）和革蘭氏陰性細(xì)菌（Escherichia coli ATCC 25922 和Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853）以及真菌Candida albicans 均不敏感［18］。而化合物麥角甾-5，8-表二氧-6，22-二烯-3-醇是常見真菌甾醇。但是這2 個(gè)化合物均是首次從白禿馬勃中分離得到。