羅俊霞，趙建波，張 剛，賈 冬，申戰(zhàn)賓，段鹿梅

（1.鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)流通中心，河南 鄭州 450006；2.鄭州市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，河南 鄭州 450006；3.河南恒晟檢測(cè)技術(shù)有限公司，河南 新鄭 451100）

中國(guó)是農(nóng)藥生產(chǎn)和使用的大國(guó)，其中有機(jī)磷、氨基甲酸酯類農(nóng)藥由于價(jià)格低、殺蟲譜廣等特性，被廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，且殘留超標(biāo)情況仍遠(yuǎn)高于其他農(nóng)藥品種［1］。目前在農(nóng)產(chǎn)品安全品質(zhì)監(jiān)管工作中應(yīng)用較廣泛的農(nóng)殘速測(cè)試劑盒是依據(jù)膽堿酯酶的抑制原理而開發(fā)的速測(cè)卡或者酶抑制-比色試劑盒［1-5］，但酶抑制法檢測(cè)農(nóng)藥殘留的靈敏度與使用的酶、反應(yīng)時(shí)間、溫度以及酶的來源等有密切關(guān)系［6］，該技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中還存在諸如酶源的選擇、假陽(yáng)性、假陰性之類的很多問題［6］，很多學(xué)者在這方面開展了諸多研究，如：劉洋等［7］利用4 種有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)檢測(cè)用植物酯酶進(jìn)行了篩選，楊莉等［8］利用5 種有機(jī)磷和5 種氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)來源于動(dòng)物的豬肝酯酶進(jìn)行了敏感性測(cè)定，蘇鶴等［9］利用商品化的酶抑制-比色法快檢試劑盒測(cè)定了10 種有機(jī)磷農(nóng)藥，羅俊霞等［10］利用5 種有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)商品化的酶抑制-比色法快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留試劑盒進(jìn)行了比對(duì)，張瑜等［11］對(duì)酶抑制法快檢蔬菜農(nóng)藥殘留假陰性進(jìn)行了研究，葉雪珠等［12］對(duì)酶抑制法檢測(cè)蔬菜農(nóng)藥殘留的效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。但是對(duì)商品化的酶抑制-比色法試劑盒的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)、比對(duì)的文獻(xiàn)較少，筆者利用6 個(gè)品牌的酶抑制-比色法快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留的試劑盒對(duì)5種氨基甲酸酯類的農(nóng)藥進(jìn)行了比較測(cè)定，以期對(duì)使用者在選擇該類試劑盒時(shí)起到借鑒作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

（1）儀器：16 通道的農(nóng)殘速測(cè)儀：CL-BIII 型，上海博納新技術(shù)研究所、上海復(fù)博農(nóng)業(yè)科技有限公司；電熱恒溫水浴鍋：HH.W21-Cr 420 型，北京三二八科學(xué)儀器有限公司；漩渦混合器：WH-861 型，上?？等A儀器儀表廠；雙重恒溫水浴振蕩器：SHA-C 型，杰瑞爾電器有限公司；移液槍：5 mL、200 μL，美國(guó)Thermo 公司。

（2）試劑：樂果、伏殺硫磷、馬拉硫磷、丙溴磷、甲基異柳磷標(biāo)準(zhǔn)溶液：濃度均為1 000 mg／L，農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)研究所；試劑盒編號(hào)：A、F（深圳）、B（廣州）、C（東莞）、D（廈門）、E（湖北）；實(shí)驗(yàn)用水為純凈水。

1.2 試劑配制

（1）各品牌的農(nóng)殘速測(cè)試劑盒里的緩沖試劑用500 mL 的純凈水溶解。酶、顯色劑和底物在使用前，分別按照試劑盒說明書的要求進(jìn)行配制，具體配制方法見表1。

表1 幾種品牌酶抑制法速測(cè)試劑盒中各種試劑的配制方法

（2）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制。分別用丙酮將樂果、馬拉硫磷、伏殺硫磷、甲基異柳磷、丙溴磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至質(zhì)量濃度為80 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

（3）模擬加標(biāo)樣品制備。按照2 g 的樣品稱樣量，分別吸取5 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.25、12.5、25、50、75 μL 于一次性的燒杯中，制成濃度為0.05、0.5、1、2、3 mg/kg 的模擬加標(biāo)樣品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

對(duì)照液和農(nóng)藥的測(cè)試，參照國(guó)標(biāo)［12］進(jìn)行。

（1）對(duì)照液測(cè)試。以緩沖溶液為對(duì)照液。將緩沖溶液震蕩提取，移取3 mL 和2.5 mL 的樣品緩沖溶液至10 mL 試管中，依次往其中加入適量（見表1）酶液、顯色劑，旋渦混勻，在37 ℃條件下恒溫水浴10 min，之后加入適量（見表1）底物搖勻，立即放入CL-BIII 型16 通道的農(nóng)殘速測(cè)儀的第1 通道測(cè)定。

（2）模擬加標(biāo)樣品測(cè)試。往上述1.2（3）中制備的模擬加標(biāo)樣品中加入10 mL 緩沖溶液，按照1.3（1）的步驟進(jìn)行操作，同對(duì)照液一起，依次放入CL-BIII 型16 通道的農(nóng)殘速測(cè)儀第2-16 通道測(cè)定并記錄抑制率。

2 結(jié)果與分析

將上述1.3 中各農(nóng)藥在各濃度水平下的3 次重復(fù)測(cè)定的結(jié)果（抑制率）進(jìn)行加權(quán)平均，利用加權(quán)平均值繪制抑制率對(duì)各農(nóng)藥濃度的折線圖（見圖1），圖1 中左側(cè)為3 mL 的樣品提取液取用量，右側(cè)為2.5 mL 的樣品提取液取用量。

（1）涕滅威：由圖1a 知，6 種試劑盒測(cè)定涕滅威時(shí)樣品提取液無論是取用3 mL 還是2.5 mL，其抑制率均隨著涕滅威濃度的增大而提高，但是每一種試劑盒提高的幅度各不相同，折線的形態(tài)也稍有差別；樣品提取液取用3 mL 時(shí)，試劑盒對(duì)其敏感性為E＞F≥B≥D＞A＞C，樣品提取液取用2.5 mL 時(shí)，試劑盒對(duì)其敏感性為E≥A＞F≥B＞D＞C，說明樣品提取液取用3 mL 和2.5 mL 之間，A 試劑盒有較大差異，其他試劑盒差異不大。A、B、D、E、F 試劑盒在涕滅威濃度1 mg/kg 以下，隨著濃度的升高，抑制率有較大的增高，之后抑制率增長(zhǎng)減緩；當(dāng)樣品提取液取用3 mL 時(shí)，1 mg/kg 前后抑制率的增長(zhǎng)幅度分別為67.3%、70.1%、65.1%、91.8%、70.7%和18.1%、15%、16.7%、4.5%、16.3%；當(dāng)樣品提取液取用2.5 mL 時(shí)，1 mg/kg 前后抑制率的增長(zhǎng)幅度分別為86.8%、69.1%、52.4%、89.7%、68.6%和7.4%、16.7%、22.4%、5.1%、18.4%。

圖1 抑制率對(duì)各農(nóng)藥濃度的折線圖

（2）涕滅威亞砜：由圖1b 知，就涕滅威亞砜而言，6 種試劑盒的抑制率的走向基本一致，樣品提取液無論取用3 mL 還是2.5 mL，均在農(nóng)藥濃度為0.5 mg/kg 時(shí)出現(xiàn)拐點(diǎn)；當(dāng)樣品提取液取用3 mL 時(shí)，0.5 mg/kg 前后A、B、C、D、E、F 試劑盒的抑制率增長(zhǎng)幅度分別為90.2%、92.3%、76.4%、91.2%、96.9%、95.2%和5.6%、7.7%、15.4%、8.8%、3.1%、4.8%；當(dāng)樣品提取液取用2.5 mL 時(shí)，0.5 mg/kg 前后抑制率的增長(zhǎng)幅度分別為93.6%、78.2%、86.8%、97.4%、94.9%和6.4%、18.9%、11%、1.7%、4.5%；樣品提取液取用3 mL和2.5 mL 沒有太大差異。

（3）涕滅威砜：由圖1c 知，就涕滅威砜而言，樣品提取液無論取用3 mL 還是2.5 mL，E 試劑盒同A、B、C、D、F 試劑盒之間存在較大差異，E 試劑盒樣品提取液取用3 mL 時(shí)，0.5 mg/kg 前后抑制率的增長(zhǎng)幅度分別為91.4%和6.7%，樣品提取液取用2.5 mL 時(shí)，0.5 mg/kg 前后抑制率的增長(zhǎng)幅度分別為92.5%和5%；D 試劑盒在農(nóng)藥濃度0.5 mg/kg 前后，樣品提取液無論是取用3 mL 和2.5 mL 分別是：47.1%、28.5%和39.4%、31.6%。其他試劑盒隨著農(nóng)藥濃度的提高,抑制率的增長(zhǎng)幅度基本均勻,總體來講，對(duì)涕滅威砜的敏感性E＞D＞其他，其他幾種試劑盒差別不大。

（4）滅多威：由圖1d 知，A、B、D、F 試劑盒對(duì)滅多威的敏感性大于C 和E，且前者在0.5 mg/kg 之前抑制率的增長(zhǎng)幅度大于0.5 mg/kg 之后，分別為63%、75%、74.8%、78.4%和24.6%、17.7%、21%、17.1%；C 和E 試劑盒隨著農(nóng)藥濃度的增大，抑制率的增長(zhǎng)幅度基本均勻；樣品提取液取用3 mL 還是2.5 mL之間差別不大。

（5）克百威：由圖1e 知，6 個(gè)試劑盒對(duì)克百威的敏感性F＞B＞D＞E＞C＞A，A 對(duì)克百威基本不敏感。當(dāng)克百威的濃度是0.05 mg/kg 時(shí)，F(xiàn)、B、D 的抑制率在樣品提取液取用3 mL 和2.5 mL 分別達(dá)到75.2%、63.2%、80%和75.8%、60.6%、78.4%，在0.05～3 mg/kg，抑制率的增幅分別為24.8%、35.3%、20%和24.2%、38%、21.6%；當(dāng)克百威的濃度是0.5 mg/kg 時(shí)，C、F 試劑盒的抑制率在樣品提取液取用3 mL 和2.5 mL 分別達(dá)到54.8%、95%和50.7%、95.8%，克百威的濃度在0.5～3 mg/kg 之間，其抑制率的增幅分別為27.1%、5%和31.8%、4.2%；樣品提取液取用3 mL 還是2.5 mL 之間差別不大。

3 結(jié)論與討論

除了A 試劑盒外其他5 種試劑盒對(duì)這5 種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性均較強(qiáng)，A 試劑盒對(duì)克百威的敏感性較弱；但各種試劑盒對(duì)每一種農(nóng)藥的敏感性稍有差別；同一種試劑盒對(duì)不同的農(nóng)藥的敏感性不一樣；測(cè)試時(shí)取用3 mL 的提取液和取用2.5 mL 的提取液根據(jù)農(nóng)藥的不同和試劑盒的不同存在一定的差異；就所測(cè)試的5 種農(nóng)藥來講，6 種試劑盒中除A 之外難定優(yōu)劣。

酶抑制法是應(yīng)用廣泛且成效顯著的一種相對(duì)成熟的檢測(cè)方法［14］，它表征的是混合污染物的綜合毒性，具有操作簡(jiǎn)單、測(cè)試時(shí)間短等特點(diǎn)［15］，但是這種方法不能定量也不能定性［16］，其檢測(cè)效果決定于其中的酶和底物，但是據(jù)業(yè)內(nèi)人士透露，商品化的試劑盒中所使用的酶多數(shù)不是生產(chǎn)商自己生產(chǎn)，因此生產(chǎn)商對(duì)自己所包裝生產(chǎn)的酶試劑的檢測(cè)效果很難做到心中有數(shù)，因此使用者在購(gòu)置試劑盒時(shí)需要對(duì)試劑盒進(jìn)行一定的測(cè)試。