王申森，劉馨慧，黃 華，李 歡，王 娟

(北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部，北京 100124)

胰腺癌是最常見的胰腺腫瘤，主要起源于胰腺導(dǎo)管上皮及腺泡細(xì)胞的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變，因?yàn)槠浒l(fā)病率和死亡率都高居全球惡性腫瘤前十位并且是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一，所以被稱為“癌中之王”. 因此，對(duì)胰腺癌發(fā)生及發(fā)展過程的研究具有極為重要的科研及臨床意義.

Claudin 4(Cldn4)是一種緊密連接蛋白，是Claudin家族的一員，Claudin蛋白均由4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，N端和C端均位于細(xì)胞內(nèi)部，細(xì)胞膜外有2個(gè)長度不等的環(huán)，可以和臨近其他同類型的環(huán)相接觸構(gòu)成細(xì)胞間的緊密連接[1-3]. 而且Cldn4的結(jié)構(gòu)高度保守，從線蟲到人類都十分相似. 當(dāng)Claudin蛋白發(fā)生變化時(shí)將影響細(xì)胞間的通透性進(jìn)一步引起多種疾病的發(fā)生[4-6].

目前已報(bào)道Cldn4在卵巢癌[7-9]、前列腺癌[10-11]、乳腺癌[12-13]、胰腺癌[14]、腸道癌等[15]多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)[16]，并且作為一種癌基因介導(dǎo)癌癥的發(fā)生，但是在胰腺癌中將作為一種抑癌基因還是癌基因仍有爭(zhēng)議：Michl等[17]研究表明Cldn4能夠降低胰腺癌細(xì)胞SUIT-2的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，而Kumei等[18]研究表明使用羅格列酮可以通過抑制 MEK-ERK 信號(hào)通路增加Cldn4的表達(dá)，從而降低了胰腺癌細(xì)胞的侵襲力. 本文將通過對(duì)胰腺癌細(xì)胞PANC-1進(jìn)行研究進(jìn)一步確定Cldn4對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移能力的影響.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人胰腺癌細(xì)胞PANC-1和293T細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；Cldn4抗體購自abcom；MTT試劑盒購自索萊寶；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real time PCR 試劑盒、qPCR引物序列購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；PVDF膜、ECL發(fā)光液購自美國Millipore公司；Transwell小室購自Corning；細(xì)胞裂解及蛋白抽提試劑、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、Western blot配膠試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司.

1.2 細(xì)胞增殖檢測(cè)

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，分于96孔板，每孔150 μL，2 000個(gè)細(xì)胞/孔. 置37 ℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)6～24 h. 小心吸去上清，加入90 μL新鮮培養(yǎng)液，再加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h. 然后吸掉上清，每孔加入110 μL Formazan溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解. 在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光值. 同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、Formazan溶解液)，每組設(shè)定3復(fù)孔.

1.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，PBS清洗，胰酶消化，加DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行吹打重懸，制成單細(xì)胞懸液. 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，根據(jù)細(xì)胞增殖能力，在六孔板中，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別鋪入200個(gè)細(xì)胞，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)2周. 當(dāng)培養(yǎng)板出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止實(shí)驗(yàn)，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min,清水洗凈染色液. 干燥克隆培養(yǎng)板，拍照，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

在超凈工作臺(tái)內(nèi)對(duì)實(shí)驗(yàn)所用到的馬克筆、直尺、所用器材等進(jìn)行紫外照射滅菌30 min. 鋪細(xì)胞前用馬克筆在六孔板外底部每隔0.5 cm畫一條線，每個(gè)孔劃4條線，在板中鋪約5×105個(gè)細(xì)胞，使細(xì)胞第2天能鋪滿整個(gè)孔面. 根據(jù)孔板外底部的線進(jìn)行劃線，槍頭要直，不能傾斜，避免劃得粗細(xì)不均，PBS清洗劃下的細(xì)胞，沿壁輕輕加入完全培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 按0、24、48 h的時(shí)間點(diǎn)顯微鏡下拍照. 每次都要在同一固定觀察點(diǎn)觀察劃痕愈合情況. 用Image J軟件測(cè)量劃痕區(qū)域長度，計(jì)算細(xì)胞遷移能力. 計(jì)算公式：劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%.

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)

選取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，即細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，PBS清洗2～3遍，胰酶消化3 min左右(根據(jù)細(xì)胞的貼壁能力)，加DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行吹打，800 r/min離心細(xì)胞. 離心細(xì)胞后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗1～2次，加入無血清培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，吸取1 mL細(xì)胞懸液再加入無血清培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為104/mL. 將Transwell小室置于24 孔板中，上室加入200 μL的細(xì)胞懸液，下室加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基600 μL. 在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h. 將24孔板從培養(yǎng)箱中取出，用移液器吸取上室的培養(yǎng)基，PBS溶液清洗小室2次，棉簽擦去上室細(xì)胞，室溫4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，清洗. 倒置顯微鏡下觀察穿過小室的細(xì)胞量. 隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行拍照、計(jì)數(shù)取平均數(shù).

1.6 Real-Time PCR檢測(cè)

將細(xì)胞融合度在80%左右的各組細(xì)胞處理后使用TRIzol提取RNA，使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA,以β-Actin為內(nèi)參進(jìn)行qPCR，引物如下：Cldn4-F：ATGCAGTGCAAGGTGTACGA，Cldn4-R：GACACCGGCACTATCACCAT；β-Actin-F：TGACG TGGACATCCGCAAAG，β-Actin-R：CTGGAAGGTG GACAGCGAGG. 結(jié)果使用2-ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算mRNA表達(dá)水平.

1.7 Western blot

將細(xì)胞融合度在80%左右的各組細(xì)胞處理后使用含PMSF的RIPA裂解液提取總蛋白，使用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，加入5×SDS上樣緩沖液和RIPA將蛋白定量，沸水浴10 min變性，上樣后進(jìn)行SDS-PAGE電泳(濃縮膠80 V 30 min ，分離膠120 V 1.5 h)并轉(zhuǎn)膜(90 V恒壓濕轉(zhuǎn)1 h)到PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后加一抗(1∶1 000)4 ℃孵育12 h，使用對(duì)應(yīng)二抗孵育后進(jìn)行顯影.

1.8 病毒包裝與感染

將293T細(xì)胞鋪于10 cm皿中待細(xì)胞生長到70%左右使用轉(zhuǎn)染試劑將穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒按照一定比例共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，12 h后進(jìn)行換液. 分別在轉(zhuǎn)染后48 h和72 h收取細(xì)胞培養(yǎng)液加入5×PEG8000在4 ℃冰箱中放置2 h，其間搖勻2～3次. 3 000 r/min離心30 min，棄上清后使用DMEM重懸病毒沉淀分裝后放置于-80 ℃冰箱備用. 將PANC-1細(xì)胞鋪于6孔板中，待細(xì)胞生長到70%左右加入對(duì)應(yīng)的病毒感染細(xì)胞，6 h后換液，48 h后加入對(duì)應(yīng)的抗生素篩選細(xì)胞.

1.9 細(xì)胞的構(gòu)建

為了構(gòu)建過表達(dá)Cldn4的細(xì)胞系，使用引物F：gtgaccggcgcctactctagaATGGCCTCCATGGGGCTACA GG和引物R：gccctcagcggccgcggatccTTACACGTA GTTGC TGGCAGCAGC以人源cDNA為模板將Cldn4的開放閱讀框調(diào)取出，并同源重組至慢病毒載體pCDH-EF1α-MCS-T2A-puro. 在293T細(xì)胞中包毒后感染PANC-1細(xì)胞，使用2 μg/mL的嘌呤霉素篩選出陽性細(xì)胞.

為了構(gòu)建敲低Cldn4的細(xì)胞系(shCldn4)，使用引物F：gatcGCTTTGTTCTTCCCTGGACTGTCAAGA GCAGTCCAGGGAAGAACAAAGCttttt和R：aattAAA AAGCTTTGTTCTTCCCTGGACTGCTCTTGACAGTCCA GGGAAGAACAAAGC退火形成雙鏈后，并連接組至慢病毒載體pLVX-shRNA2-Puro. 在293T細(xì)胞中包毒后感染PANC-1細(xì)胞，使用2 μg/mL的嘌呤霉素篩選出陽性細(xì)胞.

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與作圖，多因素方差分析采用Bonferroni post-tests方法進(jìn)行，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示. 所得數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，組間比較采用t檢驗(yàn)與單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 其中*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001.

2 結(jié)果與分析

2.1 Cldn4在腫瘤中表達(dá)量異常

通過TCGA數(shù)據(jù)庫的搜索發(fā)現(xiàn)，Cldn4在腫瘤中mRNA的表達(dá)量顯著性高于正常組織中的表達(dá)量(如圖1所示，T代表tumor，N代表normal)，與Michl等[17]文獻(xiàn)中報(bào)道的結(jié)果相同：在胰腺癌中Cldn4表達(dá)量異常上升. 這表明Cldn4在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中可能存在一定的作用.

圖1 Cldn4在胰腺癌和正常組織中的表達(dá)量Fig.1 Expression of Cldn4 in pancreatic cancer and normal tissue

2.2 胰腺癌細(xì)胞系中Cldn4的表達(dá)量

通過qPCR和Western blot檢測(cè)胰腺癌PANC-1細(xì)胞中經(jīng)過慢病毒穩(wěn)定過表達(dá)和敲低Cldn4后Cldn4的mRNA和蛋白水平. 過表達(dá)Cldn4后Cldn4在mRNA水平和蛋白水平均有顯著性差異(如圖2(a)和圖2(b)右圖所示)；敲低Cldn4后Cldn4在mRNA水平和蛋白水平均有顯著性差異(如圖2(a)和圖2(b)左圖所示).

圖2 PANC-1細(xì)胞中過表達(dá)和敲低Cldn4后mRNA和蛋白的表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of Cldn4 mRNA and protein in PANC-1 cells after overexpress and knockdown Cldn4

2.3 Cldn4不影響細(xì)胞的增殖

分別將胰腺癌PANC-1細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)和敲低Cldn4的細(xì)胞同對(duì)照組細(xì)胞等量鋪于96孔板中，取0、24、48、72、96 h的細(xì)胞使用MTT試劑盒進(jìn)行檢測(cè). 無論過表達(dá)還是敲低Cldn4均對(duì)胰腺癌細(xì)胞PANC-1的增殖沒有顯著性影響，如圖3所示. 本結(jié)果表明Cldn4并不影響胰腺癌細(xì)胞的增殖能力.

圖3 過表達(dá)和敲低Cldn4后對(duì)PANC-1細(xì)胞增殖能力的影響Fig.3 Effect of Cldn4 overexpression and knockdown on proliferation of PANC-1 cells

2.4 Cldn4抑制細(xì)胞的遷移能力

分別將胰腺癌PANC-1細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)或敲低Cldn4的細(xì)胞同對(duì)應(yīng)對(duì)照組細(xì)胞鋪于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行劃痕并拍照，每24 h進(jìn)行拍照觀察. 過表達(dá)Cldn4與對(duì)照組對(duì)比結(jié)果顯示過表達(dá)Cldn4后能夠抑制胰腺癌細(xì)胞劃痕愈合的速度(如圖4(a)(c)左側(cè)圖所示)；敲低Cldn4與對(duì)照組對(duì)比結(jié)果顯示降低Cldn4的表達(dá)后能夠促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞劃痕愈合的速度(如圖4(b)(c)右側(cè)圖所示)，結(jié)果如圖4所示.

圖4 過表達(dá)和敲低Cldn4后對(duì)PANC-1細(xì)胞遷移能力的影響Fig.4 Effect of Cldn4 overexpression and knockdown on migration of PANC-1 cells

另一種方法使用Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Cldn4對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移的影響. 過表達(dá)Cldn4與對(duì)照組對(duì)比結(jié)果顯示Cldn4表達(dá)量上升后能夠抑制胰腺癌細(xì)胞穿過Transwell小室的能力(如圖5(a)(c)左圖所示)；敲低Cldn4與對(duì)照組對(duì)比結(jié)果顯示降低Cldn4的表達(dá)后能夠促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞穿過Transwell小室的能力(如圖5(b)(c)右圖所示). 以上結(jié)果證明Cldn4能有效抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移能力. 結(jié)果如圖5所示.

圖5 過表達(dá)和敲低Cldn4后對(duì)PANC-1細(xì)胞遷移能力的影響Fig.5 Effect of Cldn4 overexpression and knockdown on migration of PANC-1 cells

3 討論

Cldn4是Claudins蛋白家族的一員，并且是細(xì)胞黏附結(jié)構(gòu)的重要連接蛋白之一. 有假說認(rèn)為在腫瘤代謝中Claudins的降低能夠加強(qiáng)腫瘤的轉(zhuǎn)移和入侵；另一方面有的研究表明Claudins的過量表達(dá)能夠?qū)е履[瘤中蛋白的定位和功能異常，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和入侵. 目前研究發(fā)現(xiàn)Cldn4在多種腫瘤中表達(dá)量異常升高，且在卵巢癌、腸道癌、乳腺癌等癌癥中被證明作為一種癌基因促進(jìn)腫瘤的發(fā)生；而在胃癌中發(fā)現(xiàn)Cldn4扮演著抑癌基因的角色[19]. 文獻(xiàn)報(bào)道證明和數(shù)據(jù)庫均顯示Cldn4在胰腺癌中異常表達(dá)升高，提示Cldn4在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中可能扮演著重要的角色，但是在胰腺癌中Cldn4的功能并不明確.

為探討Cldn4在胰腺癌中的作用，本實(shí)驗(yàn)使用慢病毒的方法構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)Cldn4和穩(wěn)定敲低Cldn4的PANC-1細(xì)胞系，并通過qPCR和Werstern blot檢測(cè)Cldn4的表達(dá)水平變化. 本文通過細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Cldn4并不影響胰腺癌細(xì)胞的增殖，但是通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)證明Cldn4能夠抑制胰腺癌細(xì)胞遷移，這表明Cldn4在胰腺癌細(xì)胞中可能扮演著抑癌基因的角色，但其具體的分子調(diào)控機(jī)制并未闡述. 綜合Cldn4的文獻(xiàn)報(bào)道和最新的研究，猜測(cè)其在胰腺癌中的抑癌機(jī)制可能與乳腺癌中報(bào)道的相關(guān)通路PAK4-CEBPB-Cldn4有關(guān)[20]；或者與胃癌中報(bào)道的PI3K/Akt 途徑有關(guān)[19]. 而Cldn4表達(dá)量的變化可能與之前報(bào)道過的基因的甲基化改變有關(guān)[21]，或者非編碼RNA能夠控制Cldn4的表達(dá)[22].

Cldn4在很多腫瘤中異常表達(dá)，已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道將Cldn4作為治療腫瘤的特定靶點(diǎn). Cldn4是產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素(clostridium perfringens enterotoxin，CPE) 的受體，CPE結(jié)合Cldn4后可通過胞膜穿透作用使細(xì)胞溶解壞死. Michl等[14]用CPE瘤內(nèi)注射異種嫁接的胰腺癌細(xì)胞，引起腫瘤細(xì)胞的大面積死亡，延緩腫瘤的生長. 在前列腺癌細(xì)胞和高表達(dá)Cldn4的腫瘤中也報(bào)道過CPE有治療效果[23-24]. 目前也有研究證明CAR-T對(duì)部分Claudins有一定的作用，希望后期能夠研究出針對(duì)Claudins的CAR-T細(xì)胞療法[25].

Cldn4作為十分常見的腫瘤異常表達(dá)基因，對(duì)于其研究仍處于初步階段，仍需要對(duì)其調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的了解和報(bào)道，這對(duì)于了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著極為重要的理論和實(shí)踐意義.

4 結(jié)論

1) Cldn4在胰腺癌中異常高表達(dá).

2) Cldn4能夠顯著抑制胰腺癌細(xì)胞PANC-1的遷移能力.

3) Cldn4對(duì)胰腺癌細(xì)胞PANC-1的增殖能力無顯著影響.