謝耀錕 曹金城 周錦魁

腦梗死和腦出血都存在缺氧和缺血的病理過(guò)程,隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)該過(guò)程中還存在細(xì)胞凋亡［1］。研究顯示［2］,腦動(dòng)脈硬化導(dǎo)致的腦組織細(xì)胞缺氧和缺血是因細(xì)胞凋亡引起,所以凋亡在其中扮演重要角色。研究顯示［3］,黃芪提取物可有效抗缺氧神經(jīng)細(xì)胞凋亡,本研究就分析中藥黃芪在對(duì)抗神經(jīng)細(xì)胞缺氧性凋亡中的作用機(jī)理,皆在為指導(dǎo)臨床使用黃芪治療腦梗死和腦出血等提供理論依據(jù),現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1材料 清潔級(jí)SD 大鼠(南京君科生物工程有限公司,貨號(hào)：J001)10 只；氮?dú)?二氧化碳(N2/CO2)空氣混合器、缺氧罐(廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司,型號(hào)：PE-180F)；抗兔IgG 二抗SABC 試劑盒(上海群已生物科技有限公司,貨號(hào)：PAB10816)；Bax 多克隆抗體(艾美捷科技有限公司,貨號(hào)：PAB27023)；D-Hank’s液(北京百奧萊博科技有限公司,貨號(hào)：BL0817)；兔抗大鼠Bcl(北京百奧萊博科技有限公司,產(chǎn)品編號(hào)：YT684)；Neurobasal 培養(yǎng)液(賽默飛世爾科技有限公司,貨號(hào)：21103-049)；黃芪注射液(神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司,批號(hào)：0011024)；B27Neurobasal 培養(yǎng)液(上海意杰生物科技有限公司,批號(hào)：N014B)；多聚甲醛(PA)(武漢賽維爾生物科技有限公司)；光學(xué)顯微鏡(上海普赫光電科技有限公司,型號(hào)：E100)；熒光顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠,型號(hào)：XSP-BM13C)；新生牛血清(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào)：S9040)；馬血清(上海北諾生物有限公司型號(hào)：Hyclone SH30074.03)。

1.2方法

1.2.1大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞原代無(wú)血清培養(yǎng) 取出大鼠大腦,置于含有氯化鈉 6.25 mmol/L 的D-Hank’s 液中,軟腦膜剝除,將皮層分離,洗3 次。皮層組織剪為1～2 mm3小塊,置于D-Hank’s 液中(溫度37℃,含0.125%胰蛋白酶),水浴25 min 后加入10%新生牛血清將反應(yīng)終止,1000 r/min 離心3 min,去除上清液,再加入含6.25 mmol/L 氯化鈉的5 ml 10%馬血清打散,放置5 min 后取細(xì)胞懸液置于第2 支離心管,重復(fù)1 次上述步驟。10%馬血清清洗細(xì)胞2 次,接種于24 孔培養(yǎng)板(5×105/ml),各孔0.4 ml,置于37 ℃,5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)4 h。再換為含氯化鈉 6.25 mmol/L 的2%B27Neurobasal 培養(yǎng)液,各孔0.3 ml,后續(xù)每3 天換液1 次。

1.2.2大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞缺氧復(fù)氧培養(yǎng) 神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)4 d 后置入?yún)捬豕?通入95%的N2和5%CO2混合氣體,1500 ml/min,30 min 后將厭氧罐夾閉。將厭氧罐置入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),再取出24 孔培養(yǎng)板,置于5%的CO2,于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行復(fù)氧培養(yǎng)。

1.2.3臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞直接計(jì)數(shù)法 24 孔培養(yǎng)板缺氧復(fù)氧培養(yǎng)后,1∶9 比例加入0.4%臺(tái)盼藍(lán),將其濃度降為0.04%,染色1 min,將蓋玻片反蓋于載玻片,于光學(xué)顯微鏡下記錄活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù),隨機(jī)計(jì)數(shù)＞200 個(gè)細(xì)胞,計(jì)算存活率。

1.2.4神經(jīng)細(xì)胞Hoeehst33342 染色 神經(jīng)細(xì)胞加入Hoeehst33342 10 μg/ml,37℃環(huán)境下孵育30 min,加入1%的PA 固定10 min,然后用封液將蓋玻片封于載玻片,使用熒光顯微鏡觀看。

1.2.5神經(jīng)細(xì)胞Bax 和Bcl-2 免疫組化染色 神經(jīng)細(xì)胞去除培養(yǎng)液,使用磷酸緩沖鹽溶液0.01 mol/L 沖洗1 次,4%多聚甲醛固定液固定20 min,磷酸緩沖鹽溶液沖洗3 次,5 min/次。0.1% Triton-X100 PRS 作用15 min,磷酸緩沖鹽溶液沖洗3 次,0.3%過(guò)氧化氫處理20 min,磷酸緩沖鹽溶液沖洗3 次,加入10%小牛血清磷酸緩沖鹽溶液封閉。加入抗Bax 或抗Bcl-2,4℃濕盒過(guò)夜,次日使用磷酸緩沖鹽溶液沖洗3 次,10 min/次,加入抗兔IgG 二抗SABC,37℃下靜置45 min,磷酸緩沖鹽溶液沖洗3 次。加入A、B 試劑,37℃下靜置45 min,磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次,給予3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色將反應(yīng)終止,磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次,最后封片。

1.2.6實(shí)驗(yàn)分組 ①黃芪注射液組：缺氧培養(yǎng)前分別加入黃芪生藥量10、50、100 mg/ml 作為黃芪注射液1 組、2 組、3 組；Hoeehst33342 染色中,黃芪注射液2 組再加1 組作為第4 組,缺氧培養(yǎng)12 h 后加入黃芪注射液50 mg/ml。②腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子組：缺氧培養(yǎng)前加入腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子50 ng/ml；Hoeehst33342染色中,再加1 組作為第2 組,缺氧培養(yǎng)12 h 后加入腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子50 ng/ml。③凋亡陽(yáng)性組：缺氧復(fù)氧下培養(yǎng)。④正常對(duì)照組：5%的CO2,于37℃飽和濕度下培養(yǎng)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同缺氧時(shí)間對(duì)培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞存活率的影響比較 神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)4 d 后置入?yún)捬豕?分別缺氧6、12、24 h,均復(fù)氧48 h,結(jié)果顯示,各組細(xì)胞存活率呈持續(xù)下降趨勢(shì),正常對(duì)照組＞缺氧6 h 組＞缺氧12 h 組＞缺氧24 h 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.9775、14.2281、69.7896,P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同缺氧時(shí)間對(duì)培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞存活率的影響比較()

表1 不同缺氧時(shí)間對(duì)培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞存活率的影響比較()

注：與正常對(duì)照組比較,aP＜0.05

2.2黃芪缺氧誘導(dǎo)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡的Hoeehst33342 染色結(jié)果 神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)4 d 后缺氧12 h再?gòu)?fù)氧48 h,進(jìn)行Hoeehst33342 染色,黃芪注射液1、2、3 組的細(xì)胞凋亡率呈持續(xù)降低趨勢(shì),細(xì)胞凋亡率黃芪注射液1 組＞黃芪注射液2 組＞黃芪注射液3 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.9112、13.5405,P＜0.05)；黃芪注射液4 組的細(xì)胞凋亡率高于黃芪注射液2 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.3122,P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 黃芪缺氧誘導(dǎo)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡的Hoeehst33342 染色結(jié)果比較()

表2 黃芪缺氧誘導(dǎo)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡的Hoeehst33342 染色結(jié)果比較()

注：與凋亡陽(yáng)性組比較,aP＜0.05

2.3黃芪對(duì)缺氧誘導(dǎo)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡調(diào)控基因蛋白的影響 神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)4 d后缺氧12 h再?gòu)?fù)氧48 h,各組Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)：黃芪注射液1、2、3 組Bax 蛋白表達(dá)隨著黃芪注射液的增加而降低,Bcl-2 蛋白表達(dá)隨著黃芪注射液的增加而增加；黃芪注射液1 組Bax 表達(dá)高于黃芪注射液3 組,Bcl-2 蛋白表達(dá)低于黃芪注射液3 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.2528、3.5631,P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 黃芪對(duì)缺氧誘導(dǎo)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡調(diào)控基因蛋白的影響比較()

表3 黃芪對(duì)缺氧誘導(dǎo)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡調(diào)控基因蛋白的影響比較()

注：與凋亡陽(yáng)性組比較,aP＜0.05

2.4黃芪對(duì)缺氧誘導(dǎo)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)Bcl-2/Bax比值的影響 缺氧誘導(dǎo)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞Bax 提高,Bcl-2 降低,黃芪注射液1、2、3 組Bcl-2/Bax 比值黃芪注射液1 組＜黃芪注射液2 組＜黃芪注射液3 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.8974、13.1559,P＜0.05)。黃芪注射液1、2、3 組Bcl-2/Bax 比值均明顯高于凋亡陽(yáng)性組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.6836、25.2982、38.8909,P＜0.05)。見(jiàn)表4。

表4 黃芪對(duì)缺氧誘導(dǎo)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)Bcl-2/Bax 比值的影響比較()

表4 黃芪對(duì)缺氧誘導(dǎo)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)Bcl-2/Bax 比值的影響比較()

注：與凋亡陽(yáng)性組比較,aP＜0.05

3 討論

大量研究表明［4,5］,細(xì)胞凋亡為導(dǎo)致腦梗死、腦出血等腦細(xì)胞死亡的一個(gè)重要途徑。本研究通過(guò)含糖缺氧和復(fù)氧培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),細(xì)胞存活率中,正常對(duì)照組＞缺氧6 h 組＞缺氧12 h 組＞缺氧24 h 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果提示缺氧既有細(xì)胞凋亡,也有細(xì)胞壞死,因此選擇缺氧12 h 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)較合適。有研究通過(guò)無(wú)糖缺氧3、5 h 和復(fù)氧45、24 h 發(fā)現(xiàn),大鼠40%的海馬神經(jīng)元凋亡,提示有糖培養(yǎng)下,因此存在糖酵解,所以缺氧時(shí)間需要更長(zhǎng)才會(huì)紊亂神經(jīng)細(xì)胞代謝,但機(jī)體為有糖環(huán)境,因此選擇含糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)較為符合［6］。研究表明［7］,黃芪總皂甙可提高腦缺血再灌注損傷腦部血清超氧化物歧化酶(SOD)活性,對(duì)自由基產(chǎn)生進(jìn)行抑制,有效降低或避免神經(jīng)細(xì)胞凋亡。黃芪注射液包含氨基酸、多糖、皂甙等多種黃芪有效成分,本研究通過(guò)將其作用于缺氧培養(yǎng)的生精細(xì)胞,再使用Hoeehst33342 染色觀察,發(fā)現(xiàn)缺氧前加入黃芪注射液能顯著抑制缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡,缺氧12 h 后加入黃芪注射液,雖然抑制細(xì)胞凋亡的作用有所降低,但也明顯低于凋亡陽(yáng)性組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),證實(shí)了黃芪注射液可抑制缺氧性神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Bax 和Bcl-2 是凋亡調(diào)控基因Bcl-2 家族中備受關(guān)注的基因和蛋白,Bax-Bax 蛋白二聚體可促進(jìn)凋亡,Bcl-2-Bax 可抑制凋亡,所以Bax 和Bcl 蛋白的表達(dá)量很關(guān)鍵。有研究對(duì)腦梗死大鼠腦內(nèi)導(dǎo)入Bcl-2 基因,促進(jìn)Bcl-2 蛋白過(guò)量表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能明顯減輕腦梗死程度［8］。本研究結(jié)果顯示,黃芪注射液1、2、3組Bax 蛋白表達(dá)隨著黃芪注射液的增加而降低,Bcl-2蛋白表達(dá)隨著黃芪注射液的增加而增加,黃芪注射液1、2、3 組Bcl-2/Bax 比值均高于凋亡陽(yáng)性組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

綜上所述,黃芪注射液可有效通過(guò)提升Bcl-2/Bax比值來(lái)調(diào)節(jié)缺氧神經(jīng)細(xì)胞避免凋亡。