利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)29份火龍果種質(zhì)染色體的倍性鑒定

黃黎芳 武志江 梁桂東 陸貴鋒 黃鳳珠 劉朝安 鄧海燕

摘 ?要：火龍果為仙人掌科量天尺屬和蛇鞭柱屬植物，不同類型火龍果種質(zhì)的染色體倍性尚不明確。為明確所收集的種質(zhì)資源以及創(chuàng)制的新材料的染色體倍性，利用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)29份火龍果材料進(jìn)行了倍性鑒定。結(jié)果顯示，供試的18份種質(zhì)資源中共鑒定出二倍體火龍果14份，四倍體4份，無(wú)三倍體材料。通過(guò)不同倍性親本雜交和秋水仙素誘變所創(chuàng)制的8份后代材料經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)有二倍體材料1份，三倍體材料3份，四倍體材料4份，這表明火龍果屬間雜交和化學(xué)誘變可獲得多倍體材料。研究結(jié)果對(duì)火龍果資源的遺傳學(xué)評(píng)價(jià)以及開展倍性雜交育種提供重要的參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：流式細(xì)胞術(shù);火龍果;種質(zhì)資源;染色體;倍性分析中圖分類號(hào)：S667??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Ploidy Determination of 29 Pitaya Germplasms Using Flow Cytometry

HUANG Lifang， WU Zhijiang， LIANG Guidong， LU Guifeng， HUANG Fengzhu， LIU Chaoan，DENG Haiyan^*

Horticultural Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract： Pitaya which belongs to the cactus family includes two genus，HylocereusandSeleniereus， the ploidy levels of different pitaya germplasms are still not clear. In order to clarify the ploidy of germplasm resources and the hybrids or mutants， the ploidy of 29 pitaya materials were identified by flow cytometry. 14 of 18 germplasm materials were diploid and others were tetraploid while no triploids were available. The 8 interploid hybrids and colchicine-induced mutants were identified as 3 triploids， 4 tetraploids and 1 diploid， which showed that polyploid materials could be obtained by intergeneric hybridization and chemical mutagenesis of pitaya. The results would provide an important reference basis for genetic evaluation and ploidy cross breeding of pitaya resources.

Keywords： flow cytometry; pitaya; germplasm resources; chromosome; ploidy analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.008

火龍果為仙人掌科（Cactaceae）量天尺屬（Hylocereus）和蛇鞭柱屬（Seleniereus）攀援性多年生植物，原產(chǎn)于中南美洲熱帶地區(qū)，因其果實(shí)豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能作用廣受消費(fèi)者歡迎。自20世紀(jì)90年代引入中國(guó)大陸以來(lái)，在我國(guó)南亞熱帶地區(qū)廣泛種植?；瘕埞N質(zhì)資源豐富，在自然界中主要存在二倍體（2n=22）和四倍體（2n=44）2種類型^[1-2]。Tel-Zur等^[3]報(bào)道了火龍果量天尺屬為二倍體（2n=22），蛇鞭柱屬也是二倍體（2n=22），有刺黃皮白肉種Hylocereus?megalanthus屬于異源四倍體（2n=4x=44），來(lái)源于Hylocereus和Seleniereus屬的自然雜交。劉順枝等^[4-5]利用優(yōu)化的染色體制片技術(shù)開展了火龍果植物染色體觀察研究，并進(jìn)行了染色體核型分析，發(fā)現(xiàn)白肉火龍果（Hylocereus undatus）的染色體數(shù)目為2n=2x=22，紅肉火龍果（Hylocereus polyrhizus）染色體數(shù)目為2n=2x=22。因火龍果植物包含2個(gè)屬以及其屬間雜交種，通過(guò)種質(zhì)資源收集得到的除原生種外，還有許多育種中間材料，其倍性類型不明確。不同倍體間雜交是火龍果育種經(jīng)常采用的方法之一，這使得雜交后代植株的倍性水平復(fù)雜多樣，因此鑒別火龍果種質(zhì)資源及創(chuàng)制的后代植株的倍性，在火龍果育種實(shí)踐中非常必要。

染色體計(jì)數(shù)法和染色體核型分析可以精確鑒定火龍果倍性，但其操作耗時(shí)，不適宜大規(guī)模鑒定倍性。流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析、分選的技術(shù)，采用光學(xué)系統(tǒng)對(duì)高速流動(dòng)的單細(xì)胞懸浮液進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量和信號(hào)處理得到的DNA含量分布曲線，可以直接觀測(cè)植物倍性。近年來(lái)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞周期分析及植物基因組大小估算等研究中。迄今在蘋果^[6]、獼猴桃^[7]、草莓^[8]、越橘^[9]、梨^[10]和荔枝^[11]等果樹上均證實(shí)了流式細(xì)胞光度術(shù)鑒定植株染色體倍性的可靠性。本研究利用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)收集的火龍果不同種質(zhì)資源類型和創(chuàng)制的后代植株進(jìn)行染色體倍性鑒定研究，以期挖掘更多的多倍體種質(zhì)，為火龍果種質(zhì)資源的創(chuàng)新和開發(fā)利用提供參考。

1??材料與方法

1.1 材料

1.1.1 ?供試種質(zhì)??供試樣品共29個(gè)（表1），采集于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南寧火龍果種質(zhì)資源圃。材料來(lái)源于中國(guó)臺(tái)灣、越南、中美洲等火龍果種植地區(qū)。試驗(yàn)于2019年11月采集植株的幼嫩肉質(zhì)莖尖供染色體倍性分析。

1.1.2 ?試劑??（1）解離緩沖液（Tris·MgCl₂ 緩沖液）：200?mmol/L Tris，4?mmol/L MgCl₂，0.5%（V/V）TritionX-100;用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至7.5，0.22?mm濾膜過(guò)濾除菌，4?℃保存。（2）染色緩沖液：解離液緩沖液中加入20?mg/L碘化丙啶（PI）和20 mg/L的RNA酶，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.3 ?儀器與設(shè)備??流式細(xì)胞儀型號(hào)為美國(guó)BD（Becton， Dickinson and Company）公司生產(chǎn)的BD660517 C6-Plus。染色體含量的分布圖像由流式細(xì)胞儀自動(dòng)測(cè)定，相關(guān)參數(shù)的調(diào)控參照儀器說(shuō)明。光源由波長(zhǎng)為488?nm氬離子激發(fā)，染色的DNA分子促發(fā)熒光，測(cè)定其熒光強(qiáng)度，與測(cè)定裝置相連的計(jì)算機(jī)分析軟件即可對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。本次實(shí)驗(yàn)所有測(cè)試樣品的細(xì)胞核DNA含量是以二倍體對(duì)照為標(biāo)準(zhǔn)的相對(duì)值，每次檢測(cè)至少收集5000個(gè)細(xì)胞顆粒。

1.2方法

（1）稱取約50 mg的葉片組織，蒸餾水洗凈表面塵土，濾紙吸干后放入預(yù)冷的培養(yǎng)皿內(nèi)，加預(yù)冷的解離液1?mL解離緩沖液;用鋒利的刀片一次性快速切碎，整個(gè)過(guò)程材料需浸沒在解離液中，以便更好地游離細(xì)胞核。（2）吸取培養(yǎng)皿內(nèi)的解離液，用300目的濾膜過(guò)濾至1.5 mL離心管中，15?000?r/min離心15～20 s，棄上清。（3）加200?μL預(yù)冷的染色緩沖液重懸，37?℃孵育15?min，上機(jī)檢測(cè)。

2??結(jié)果與分析

2.1流式細(xì)胞倍性檢測(cè)

以二倍體紅皮紅肉火龍果‘金都1號(hào)為對(duì)照，流式細(xì)胞儀測(cè)得二倍體品種染色體的峰值熒光強(qiáng)度為187×10³，表現(xiàn)為較好的單峰;三倍體品種DNA相對(duì)含量是二倍體的1.5倍，呈現(xiàn)為1.5倍二倍體的單峰;四倍體品種染色體相對(duì)含量是二倍體的2倍，呈現(xiàn)為2倍二倍體的單峰（圖1）。

2.2不同類型火龍果種質(zhì)資源的染色體倍性

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)收集的18份不同類型的火龍果種質(zhì)材料染色體倍性，從表2可見，其中量天尺屬紅皮白肉品種‘越南白肉、青皮白肉品種‘青龍和無(wú)刺黃皮白肉品種‘無(wú)刺黃龍均鑒定為二倍體，與對(duì)照‘霸王花倍性一致。鑒定發(fā)現(xiàn)4份四倍體種質(zhì)材料分別為‘哥倫比亞黃龍‘燕窩果‘美國(guó)糖龍‘紅麒麟。其中‘燕窩果來(lái)源于‘哥倫比亞黃龍后代，表現(xiàn)出四倍體的特征;‘美國(guó)糖龍和‘紅麒麟為量天尺屬紅皮紅肉品種二倍體與‘哥倫比亞黃龍四倍體的雜交后代，也表現(xiàn)出四倍體的特征。其余7個(gè)量天尺屬紅皮紅肉品種經(jīng)鑒定均為二倍體。蛇鞭柱屬的‘黑龍和屬間雜交種‘白水晶‘紅肉燕窩果‘小葉紅水晶經(jīng)鑒定為二倍體材料。未發(fā)現(xiàn)有三倍體種質(zhì)材料。

2.3 雜交后代及誘變材料的染色體倍性水平

本課題組前期利用2個(gè)S. megalanthus種質(zhì)A13（4x）和C59（4x）分別與H. undatus種質(zhì)MB（2x）雜交，獲得后代A13-MB、C59-MB1和C59-MB2。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A13-MB為四倍體，C59-MB1和C59-MB2為三倍體植株（表3），說(shuō)明火龍果四倍體與二倍體屬間雜交可產(chǎn)生一定比例的三倍體和四倍體。而C59自交產(chǎn)生的F₁代植株C59+經(jīng)鑒定為四倍體，該結(jié)果與四倍體自交后代倍性預(yù)期一致。育種中間材料C51經(jīng)鑒定為三倍體，三倍體C51與二倍體MB雜交F₁代未發(fā)現(xiàn)多倍體，僅產(chǎn)生二倍體后代C51-MB。流式細(xì)胞儀測(cè)得的三倍體和四倍體材料結(jié)果基本符合預(yù)期。

YD-1、YD-2為本課題組前期利用二倍體材料H. polyrhizus種子經(jīng)秋水仙素加倍后產(chǎn)生的誘變植株，其細(xì)胞核DNA含量直方圖上出現(xiàn)單一的波峰，且其峰熒光值與對(duì)照相差近一倍，說(shuō)明二者染色體數(shù)目加倍，其植株倍性預(yù)測(cè)為四倍體。前期形態(tài)學(xué)觀察也表現(xiàn)出子葉顯著增大增厚，植株健壯，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)等特征。誘變植株未發(fā)現(xiàn)存在細(xì)胞核含量成倍數(shù)性差異的兩群細(xì)胞，說(shuō)明無(wú)倍性嵌合體出現(xiàn)。

3??討論

通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定植株倍性，是早期研究者最常用的方法?；瘕埞谋扼w材料是異源四倍體，在植株形態(tài)上與其他二倍體植株有較大差異，但僅通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察不能精準(zhǔn)判斷火龍果的倍性，尤其在幼苗期，不同倍性材料形態(tài)學(xué)差異并不顯著。利用流式細(xì)胞術(shù)能在幼苗期鑒定植株倍性，將為高效準(zhǔn)確篩選雜交育種材料提供便利。本研究中，測(cè)試的18份種質(zhì)資源僅‘越南白肉經(jīng)劉順枝等^[4]利用染色體制片法鑒定為二倍體，‘哥倫比亞黃龍經(jīng)Tel-Zur等^[12]利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定為四倍體，其余16份材料均為本研究首次分析確定其染色體倍性。經(jīng)測(cè)試，‘越南白肉和‘哥倫比亞黃龍染色體倍性與前人報(bào)道一致。其余16份種質(zhì)資源按不同種屬類型，其倍性鑒定結(jié)果與Tel-Zur等^[12]報(bào)道的相應(yīng)類型的材料倍性一致，量天尺屬的紅皮白肉、青皮白肉和無(wú)刺黃皮白肉品種均被認(rèn)為是二倍體，而量天尺屬的紅皮紅肉、蛇鞭柱屬的紅皮紅肉和紅皮白肉種也均為二倍體。而形態(tài)學(xué)上與S. megalanrus具有類似特征的帶刺黃皮白肉及其后代、帶刺橘皮紅肉品種均為四倍體。18份種質(zhì)資源材料中未檢測(cè)到三倍體植株，可能火龍果天然雜交出現(xiàn)三倍體的幾率較低。

火龍果的刺黃皮白肉四倍體種H. megalanrus既具有量天尺屬類似的三棱柱狀肉質(zhì)莖，又像蛇鞭柱屬一般具有帶刺的果實(shí)，果實(shí)具有濃郁的風(fēng)味，被用于培育優(yōu)良的多倍體雜交種，以期獲得具更優(yōu)良性狀如更大的果實(shí)、果皮不帶刺和更高的產(chǎn)量的品種。根據(jù)這些育種目標(biāo)，研究人員進(jìn)行了屬間雜交和化學(xué)誘變等多倍體育種，可產(chǎn)生性狀改良的二倍體和多倍體后代應(yīng)用于育種實(shí)踐中^[13]。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定的11個(gè)雜交親本和后代以及誘變植株中，親本A13和C59為四倍體，MB為二倍體;創(chuàng)制的種質(zhì)中發(fā)現(xiàn)1個(gè)二倍體C51-MB;3個(gè)三倍體分別是C59-MB1、C59-MB2、C51;4個(gè)四倍體分別是A13-MB、C59+、YD-1、YD-2;倍性突變材料未見有二倍體和四倍體的嵌合體或混倍體出現(xiàn)。本研究中Hylocereus和Seleniereus的屬間雜交可獲得一定比例的二倍體、三倍體和四倍體，但未像前人報(bào)道一樣獲得五倍體和六倍體^[14]，可能與本試驗(yàn)所用雜交后代材料較少有關(guān)。而三倍體C51作為母本經(jīng)與二倍體父本MB（H. undatus）雜交得出二倍體后代C51-MB，說(shuō)明該三倍體是部分可育的，至少可產(chǎn)生具有功能的雌配子，在與花粉供體雜交的情況下最終形成可存活的后代。Tel-Zur等^[15]推測(cè)異源三倍體產(chǎn)生功能性雌雄配子的比例較高是由于染色體平衡分離的結(jié)果。本試驗(yàn)僅停留在對(duì)火龍果植物進(jìn)行染色體倍性鑒定上，而基于火龍果植物細(xì)胞學(xué)方面的研究較少，下一步將繼續(xù)開展火龍果多倍體的核型分析、氣孔大小和密度、可育性等方面研究，為火龍果育種提供更多細(xì)胞學(xué)支撐。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)同一倍性內(nèi)不同品種火龍果細(xì)胞核DNA含量差異不顯著，倍性間細(xì)胞核DNA含量成倍數(shù)性差異，進(jìn)一步證明利用流式細(xì)胞光度術(shù)測(cè)定細(xì)胞核DNA相對(duì)含量來(lái)鑒定火龍果倍性是可行的。與利用染色體計(jì)數(shù)法相比，流式細(xì)胞光度術(shù)測(cè)定核DNA含量試樣處理簡(jiǎn)單，試材用量小（50 mg左右），測(cè)量較準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好，適用于樣本較多的植物倍性檢測(cè)分析，對(duì)于多倍體后代的早期鑒定具有較大應(yīng)用價(jià)值，但是缺陷是不能獲得更為詳細(xì)的染色體信息。

參考文獻(xiàn)

[1]Ross R. Chromosome counts， cytology and reproduction in the Cactaceae[J]. American Journal of Botany， 1981， 68（4）： 463-470.

[2]Lichtenzveig J， Abbo S， Nerd A，et al.?Cytology and mating systems in the climbing cactiHylocereusandSelenicereus[J]. American Journal of Botany， 2000， 87（7）： 1058-1065.

[3]Tel-Zur N， Abbo S， Bar-Zvi D，et al. Genetic relationships amongHylocereus andSelenicereus vine cacti （Cactaceae）： Evidence from hybridization and cytological studies[J]. Annals of Botany， 2004， 94（4）： 527-534.

[4]劉順枝， 劉政浩， 林潤(rùn)怡， 等. 白肉火龍果染色體制片技術(shù)及核型分析[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 42（3）： 115-118， 193.

[5]劉順枝， 周浩彬， 林潤(rùn)怡， 等. 紅肉火龍果氣生根染色體制片優(yōu)化及核型分析[J]. 北方園藝， 2015（12）： 71-76.

[6]李??赟， 石蔭坪， 束懷瑞， 等. 利用流式細(xì)胞光度術(shù)鑒定蘋果倍性的研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 1998， 18（4）： 499-504.

[7]朱道圩， 楊??宵， 郅玉寶， 等. 用流式細(xì)胞儀鑒定中華獼猴桃的多倍體[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2007， 43（5）： 905-908.

[8]于紅梅， 王??靜， 趙密珍， 等. 利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)草莓倍性方法的優(yōu)化[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2012， 43（10）： 1530-1533.

[9]?閆東玲， 趙麗娜， 王賀新， 等. 利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定東北地區(qū)主要越桔屬植物染色體倍性[J]. 分子植物育種， 2019， 17（4）： 1257-1263.

[10]田路明， 齊??丹， 曹玉芬， 等. 利用流式細(xì)胞儀鑒定梨種質(zhì)資源染色體倍性[J]. 中國(guó)果樹， 2018（3）： 29-32.

[11]賴??彪， 吳傳龍， 秦永華， 等. 流式細(xì)胞儀測(cè)定荔枝倍性和基因組大小的細(xì)胞核提取液篩選與應(yīng)用[J]. 果樹學(xué)報(bào)， 2019， 36（7）： 939-946.

[12]Tel-Zur N， Mizrahi Y， Cisneros A，et al. Phenotypic and genomic characterization of vine cactus collection （Cactaceae）[J]. Genetic Resources and Crop Evolution， 2011， 58： 1075-1085.

[13]Tel-Zur N， Dudaib M， Ravehc E，et al.In situinduction of chromosome doubling in vine cacti （Cactaceae）[J]. Scientia Horticulturae， 2011， 129： 570-576.

[14]?Cisneros A， Tel-Zur N. Genomic analysis in threeHylocereus species and their progeny：Evidence for introgressive hybridization and gene flow[J]. Euphytica， 2013， 194： 109-124.

[15]?Tel-Zur N， Abbo S， Mizrahib Y. Cytogenetics of semi-fertile triploid and aneuploid intergeneric vine cacti hybrids[J]. Journal of Heredity， 2005， 96（2）： 124-131.

責(zé)任編輯：沈德發(fā)