張柳蓮 黃清鏵 王麗寧 王慶福 梁磊 林明威

摘? 要：為了篩選出最適合靈芝菌種復壯的培養(yǎng)基和靈芝菌種的保藏方法，通過添加不同含量的甘蔗渣提取液作為靈芝菌株復壯的培養(yǎng)基，觀察靈芝菌絲在不同培養(yǎng)基下的生長速度和生長狀況，并通過對靈芝菌種酶活力進行測定分析，比較幾種不同保藏方法對靈芝菌種活力的影響。結果表明：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）培養(yǎng)基添加甘蔗渣提取液能更好促進靈芝菌絲生長，添加100 g/L甘蔗渣提取液，赤靈芝GL102、紫靈芝GS63和GS15菌絲生長速率分別提高48%、70%和28%。與PDA保藏和石蠟油保藏培養(yǎng)基相比，甘蔗渣保藏的靈芝菌絲生長快、長勢好，脫氫酶活力高。因此，甘蔗渣可用于靈芝菌種的復壯和保藏。

關鍵詞：甘蔗渣;靈芝菌種;菌絲生長;培養(yǎng)基;脫氫酶活性

中圖分類號：Q939.99? ? ? 文獻標識碼：A

Effect of Bagasse on Growth of Ganoderma Mycelium and Evaluation of Strain Preservation

ZHANG Liulian1， HUANG Qinghua1， WANG Lining1， WANG Qingfu1*， LIANG Lei2， LIN Mingwei2

1. Institute of Bioengineering， Guangdong Academy of Sciences / Guangdong Provincial Engineering Laboratory of Biomass High Value Utilization， Guangzhou， Guangdong 510316， China; 2. Heyuan Provincial Academy of Sciences， Heyuan， Guangdong 517000， China

Abstract： In order to select the most suitable culture medium for the rejuvenation and preservation method of Ganoderma strains， by adding different contents of bagasse extract as the medium for the rejuvenation and observed hypha growth rate under different culture medium and growth conditions， and through the comparison of several different preservation methods on the vigor and the analysis of the enzyme activity. The results showed that the mycelium growth was better promoted by adding extraction solution of bagasse into PDA medium， and the mycelium growth rate of Ganoderma lucidum GL102， Ganoderma sinensis GS63 and GS15 increased by 48%， 70% and 28% respectively with the addition of 100 g/L bagasse extract. Compared with PDA preservation and paraffin oil preservation medium， bagasse preservation of Ganoderma mycelia grew fast， grew well and had high dehydrogenase activity.? It was concluded that bagasse can be used for the rejuvenation and preservation of Ganoderma strains.

Keywords： bagasse; ganoderma strains; mycelium growth; medium; dehydrogenase activity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.019

靈芝屬多孔菌科，靈芝屬，是我國最著名的藥食兩用真菌，具有抗腫瘤[1]、保肝護肝[2]、增強人體免疫力[3]、調節(jié)血糖血壓等多方面功效[4-5]。近年來，隨著靈芝栽培行業(yè)的迅速發(fā)展，作為生產源頭的菌種成為直接關系到產品產量和質量的關鍵因素。菌種保藏方法與效果作為種質資源研究的重要方面，是菌種質量的前提和保證[6-8]。建立經濟有效的菌種保藏方法，不僅可以有效保存菌種的優(yōu)良性狀、保持其活力與產量，而且對于種質資源的保存與后續(xù)研究都有極其重要的作用。

甘蔗渣是制糖工業(yè)的重要副產品，約占榨蔗量的24%～27%。甘蔗渣含有豐富的纖維素、半纖維素、木質素和一定量的氮素[9]，可為多數(shù)食用菌提供生長代謝所需營養(yǎng)物質，目前有關甘蔗渣在食用菌栽培方面的相關研究集中在栽培方面[10-11]，鮮見甘蔗渣在食用菌菌種保藏方面的相關報道。筆者研究甘蔗渣提取物對靈芝菌絲生長的影響及其在靈芝保藏中的應用，篩選出最適合靈芝菌種復壯的培養(yǎng)基和最適合靈芝菌種的保藏方法，為靈芝的種植提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試菌株? 赤靈芝（GL102、GL57）、紫靈芝（GS63、GS15）菌株由廣東省生物工程研究所（廣州甘蔗糖業(yè)研究所）提供。4 ℃冰箱保藏1 a，期間未進行轉管。

1.1.2? 實驗材料? 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基由青島高科園海博生物技術有限公司提供，甘蔗渣由廣東省生物工程研究所（廣州甘蔗糖業(yè)研究所）提供。紅四氮唑和二甲基亞砜等試劑均由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供。

1.2? 方法

1.2.1? 培養(yǎng)基配方? 在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）的基礎上加入不同含量的甘蔗渣提取液，分別配制含有0、20、40、60、80、100 g/L濃度的甘蔗渣提取液PDA培養(yǎng)基。

1.2.2? 培養(yǎng)基配制方法? 稱取300 g甘蔗渣，清水室溫浸泡2 h，煮沸30 min，過濾，濾渣重復煮2次，合并濾液，制得甘蔗渣提取液。向甘蔗渣提取液中加入適量（46 g/L）馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA），分別配制成含有0、20、40、60、80、100 g/L濃度的甘蔗渣提取液培養(yǎng)基。小火加熱，不斷用玻璃棒攪拌，防止糊底，直至馬鈴薯葡萄糖瓊脂全部融化。分裝在帶塞的三角瓶內，于115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，出鍋備用。

1.2.3? 靈芝菌種的活化與復壯? 將保存1 a的靈芝母種試管從冰箱取出置于室溫下放置24 h，將母種切割成0.4 cm×0.4 cm大小的有菌絲的瓊脂塊接入PDA平板培養(yǎng)3～5 d，用打孔器（內徑0.6 mm）打孔，分別接入不同配方含量的培養(yǎng)基平板，每種培養(yǎng)基5個重復。于25 ℃培養(yǎng)，菌絲萌發(fā)后每2 d記錄菌絲的生長速率、菌絲長勢及菌落圓整度，待其中任一皿出現(xiàn)菌絲長滿培養(yǎng)皿時停止數(shù)據(jù)的采集。篩選最適合的復壯培養(yǎng)基。

1.2.4? PDA斜面保藏法? 稱取46 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉置于燒杯中，加適量水，加熱溶解后，加水定容至1 L。分裝，121 ℃滅菌20 min，滅菌后擺斜面。將靈芝斜面母種轉接至PDA平板中，置于培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)，待菌絲長滿平板。將此菌絲的一部分作為原始種使用，不經保藏，直接參與指標檢測;另一部分作為各種保藏方法的初始菌種使用。

用直徑5 mm打孔器在長有初始菌種的平板上打孔，挑取菌塊接種于試管斜面上，于25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后，觀察菌落的生長形態(tài)及其他特征，檢查是否染雜菌。將長好的斜面試管置于4 ℃冰箱內保藏，平行保藏5支試管斜面，3個月后進行指標檢測。

1.2.5? 石蠟油保藏法? 將長好的斜面試管灌入無菌石蠟油，石蠟油液面高于斜面1 cm，置于常溫保藏，平行保藏5支試管斜面，3個月后進行指標檢測。

1.2.6? 甘蔗渣保藏法? 用2～3目的篩子對甘蔗渣進行過篩處理，去掉顆粒較小的木屑和碎皮。甘蔗渣預濕，添加砂糖1%，石灰粉1%，含水量65%～70%，分裝試管，121 ℃滅菌1 h。待保藏培養(yǎng)基溫度降至室溫時，從供試菌種平板中挑取菌塊接種于培養(yǎng)基表面，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)10～20 d。待菌絲長滿試管后，將其放在4 ℃冰箱中保藏，平行保藏5支試管斜面，保藏3個月后進行指標檢測。

1.2.7? 菌種保藏效果與菌種活力檢測? 菌絲生長情況：將3種不同保藏方法下的靈芝菌種分別接入純PDA培養(yǎng)基平板，每種5個重復。于25 ℃培養(yǎng)，觀察菌絲萌發(fā)時間，記錄菌絲的生長速率、菌絲長勢及菌落圓整度，待其中任一皿出現(xiàn)菌絲長滿培養(yǎng)皿時停止數(shù)據(jù)的采集。

菌絲生長速度：采用十字交叉法測量菌落平均直徑（打孔器內徑6 mm），菌絲生長速率（mm/d）=（平均菌落直徑–0.6）/（菌絲生長天數(shù)×2）。

菌絲長勢：觀察并記錄，用“+”表示菌絲體生長密度程度，+稀疏，++較稀疏，+++較濃密，++++濃密，+++++非常濃密。

菌落形態(tài)：菌落半徑達培養(yǎng)皿一半時進行觀察并記錄，用“+”表示其程度，-菌絲不生長，+邊緣不整齊、菌落不規(guī)則，++邊緣較整齊、菌落較圓整，+++邊緣整齊、菌落圓整。

靈芝菌種酶活力測定：從培養(yǎng)7 d的平板中刮取菌絲體適量，稱取0.1 g菌絲體裝入10 mL離心管中，依次加入蒸餾水2 mL和TTC溶液（0.5%紅四氮唑）0.4 mL至離心管中，于37 ℃反應3 h。反應完成后4 ℃離心再水洗2次，在離心后的細胞沉淀中加入2 mL二甲基亞砜（DMSO）萃取劑，室溫下從細胞中提取三苯基甲臜（TF）。10 000 r/min，離心5 min后，取上清500 μL于485 nm，測定OD值，每個處理設3個重復。以光吸收值反映脫氫酶活性，光吸收值越大，脫氫酶的活性越高。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（One-way ANOVA），使用LSD、S-N-K檢驗方法和T檢驗法進行顯著水平分析。

2? 結果與分析

2.1? 甘蔗渣對赤靈芝菌絲生長的影響

表1和表2結果顯示，在0、20、40、60 g/L 4個不同濃度甘蔗渣提取液用量下，GL102菌絲生長速度無顯著差異;添加量達到80 g/L或100 g/L時，GL102菌絲的生長速率明顯大于對照;添加濃度為100 g/L時，菌絲生長速率比對照提升了48%。甘蔗渣提取液濃度為0、20、40 g/L時，GL57菌絲生長速率無顯著差異;濃度為60、80、100 g/L時，GL57菌絲生長速率下降，與20、40 g/L濃度下菌絲生長速率有顯著差異，但與對照差異不顯著。赤靈芝（GL102和GL57）在PDA培養(yǎng)基的菌絲比較稀疏，而添加甘蔗渣提取液后的培養(yǎng)基菌絲濃密、粗壯、潔白，菌落整齊、圓整，長勢明顯提升（圖1）。

2.2? 甘蔗渣對紫靈芝菌絲生長的影響

從表3和表4可知，紫靈芝在添加不同濃度甘蔗渣提取液培養(yǎng)基下，菌絲的生長存在著比較大的差別。添加不同濃度甘蔗渣提取液的培養(yǎng)基中紫靈芝菌絲的生長速率不同，GS63在添加40 g/L以上甘蔗渣提取液的培養(yǎng)基中，菌絲生長速率明顯高于對照;添加40～100 g/L甘蔗渣提取液后，GS63菌絲生長速率提升31%～70%。GL15紫靈芝菌絲生長速率在添加20～100 g/L甘蔗渣提取液后顯著高于對照，但是不同添加量對GS15菌絲生長無顯著差異。紫靈芝（GS63和GS15）在添加甘蔗渣培養(yǎng)基的菌落圓整、菌絲濃密、粗壯、潔白，菌絲長勢明顯優(yōu)于PDA培養(yǎng)基（圖1）。

2.3? 不同保藏方法對靈芝生長的影響

從表5可見，以甘蔗渣作為靈芝菌種保藏基質，4個靈芝菌種萌發(fā)時間均在1 d以內，在PDA斜面培養(yǎng)基上菌種萌發(fā)時間均為2 d，4個石蠟油保藏的菌種萌發(fā)時間為3～6 d。

不同保藏方法下不同菌株的生長速率有所差異，GS15在3種保藏方法上菌絲生長速度沒有顯著差異，甘蔗渣保藏的GL102菌絲生長速率顯著高于石蠟油保藏的，但是與PDA培養(yǎng)基保藏的沒有顯著性差異;GL57和GS63用甘蔗渣保藏方法的菌絲生長速率明顯高于另外2種保藏方法。圖2顯示，甘蔗渣保藏與PDA斜面保藏的菌絲長勢

相差不大，石蠟油保藏的菌絲長勢較弱，這可能與剛開始菌種被石蠟油包裹，不易萌發(fā)有關。

2.4? 靈芝菌種酶活力測定結果

從圖3可以看出，在保藏時間和溫度一致的情況下，4種靈芝菌種在不同的保藏方法下測得的脫氫酶活力不同，其中用甘蔗渣保藏的菌種脫氫酶活力測得最強，而PDA和石蠟油保藏的菌種脫氫酶活力相差不大。甘蔗渣保藏的菌種脫氫酶活力提升17%～175%，赤芝GL102和紫芝GS63兩個菌種的脫氫酶活力較高。這與不同保藏方法下靈芝菌絲生長速率結果趨勢一致，進一步說明甘蔗渣可作為靈芝菌種的保藏基質。

3? 討論

甘蔗渣富含纖維素，半纖維素和木質素，結構蓬松，是多數(shù)食用菌良好的栽培基質[12-14]。甘蔗渣在食用菌菌種保藏方面的研究甚少。本研究探討了甘蔗渣對靈芝菌絲生長的影響和對菌種保藏的效果，結果表明：在PDA培養(yǎng)基中適當添加甘蔗渣，可促進赤靈芝和紫靈芝菌絲生長，添加100 g/L甘蔗渣提取液，赤靈芝GL102、紫靈芝GS63和GS15菌絲生長速率分別提高48%、70%和28%，且赤靈芝和紫靈芝長勢優(yōu)于PDA培養(yǎng)基，且甘蔗渣保藏的靈芝菌種萌發(fā)定植較快，菌絲生長速率較快，脫氫酶活力強，表現(xiàn)出較強的生長優(yōu)勢。代彥滿等[15]在PDA培養(yǎng)基中添加小麥提取物對赤靈芝菌絲生長有較強的促進作用。袁學軍等[16]報道靈芝菌絲在PDA加木屑培養(yǎng)基上生長快速，菌絲濃密粗壯。說明在PDA培養(yǎng)基中添加甘蔗渣、小麥、木屑等生物質提取液對靈芝菌絲生長具有不同程度的促進作用。

由于保藏時間所限，本研究尚未能對超低溫冰箱及液氮長期保藏效果進行評價，在后續(xù)的研究中，將完善這方面的數(shù)據(jù)。隨著分子生物學技術的興起，基因組學、蛋白組學和代謝組學的發(fā)展帶動了菌種保藏在基因層面上的研究。Zhang等[17]研究了熱應激對靈芝菌絲體生長的影響發(fā)現(xiàn)，鈣離子參與熱激信號轉導并調節(jié)菌絲體生長。而鮮見針對菌種保藏階段培養(yǎng)基質等環(huán)境因子對菌絲體代謝影響的機理研究。今后將通過對菌種保藏過程中調控菌絲生長的關鍵基因的發(fā)掘，探明保藏過程中的生理變化及其機理機制，可為靈芝菌種以及其他食藥用菌菌種的穩(wěn)定、高效地保藏提供理論支持，以期最終解決菌種保藏中菌種退化的難題。

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責任編輯：白? 凈