鈍葉草葉斑病病原鑒定

鄭金龍 劉文波 賀春萍 易克賢 習(xí)金根 粱艷瓊 Gbokie Jr Thomas 吳楊

摘? 要：為鑒定鈍葉草葉斑病的病原，通過對61份來自中國海南、廣東、廣西、云南、福建、江蘇，以及美國和南非的疑似鈍葉草葉斑病的葉片樣品進(jìn)行分離培養(yǎng)，獲得120個菌株，對其進(jìn)行純化培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、致病性測定，利用來自海南的鈍葉草為靶標(biāo)寄主，并利用rDNA-ITS、GAPDH、TUB2引物對55號菌株進(jìn)行分析鑒定。結(jié)果表明，經(jīng)柯赫氏法則驗證40株菌株不致病，70株致病性較弱，10株致病性強(qiáng);選擇55號致病性強(qiáng)菌株，進(jìn)行形態(tài)觀察，初步確定該病的病原菌為新月彎孢霉（Culvularia lunata），經(jīng)3種引物的PCR擴(kuò)增測序鑒定，和C. lunata相似性達(dá)到99%，進(jìn)一步確定鈍葉草葉斑病的致病菌為新月彎孢霉。研究結(jié)果將為今后對鈍葉草葉斑病的發(fā)病規(guī)律、防治方法及抗病機(jī)制等方面的研究提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鈍葉草;葉斑病;新月彎孢菌;病原菌鑒定;致病性測定

中圖分類號：S436.8? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Identification of the Pathogen of Stenotaphrum helferi Leaf Spot

ZHENG Jinlong1， LIU Wenbo2*， HE Chunping1， YI Kexian1*， XI Jingen1， LIANG Yanqiong1， Gbokie Jr Thomas3， WU Yang4

1. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China; 2. College of Plant Protection， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 3. College of Plant Protection， Nanjing Agricultural University， Nanjing， Jiangsu 210095， China; 4. School of Life Sciences， Jinggangshan University， Jian， Jiangxi 343009， China

Abstract： This study aimed to identify the pathogen of the leaf spot of Stenotaphrum helferi. A total of 61 leaf samples of S. helferi with suspected leaf spot disease were collected from six provinces in China （Hainan， Guangdong， Guangxi， Yunnan， Fujian and Jiangsu）， the United States and the South Africa. The potential causal agents were isolated and 120 bacterial strains were obtained. The strains were identified in morphology， and by conducting pathogenicity assay in the accesions from Hainan. In addition， the strains were identified by the PCR method based on the rDNA internal transcribed spacer region （rDNA-ITS）， glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase （GAPDH） and β-tubulin （TUB2） sequences. The analysis followed Koch's law and showed 40 strains with no pathogenisis， 70 strains with weak pathogenisis， and 10 strains with strong pathogenisis. The strains of No.55 with strong pathogenisis were selected for morphological observation， and the pathogens of the disease were preliminarily determined. Sequence identities of rDNA-ITS， GAPDH and TUB2 between No.55 strains and Curvularia lunata reached 99%， suggesting that the pathogenic bacteria of the leaf spot in S. helferi was C. lunata. Our findings would provide data to support future studies on the epidemiology， resistance mechanism and control strategy of the leaf spot disease of bluestocked grass.

Keywords： Stenotaphrum helferi; leaf spot; Curvularia lunata; pathogen identification; pathogenicity assay

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.026

鈍葉草（Stenotaphrum helferi）為禾本科（Gramineae）鈍葉草屬（Stenotaphrum）的多年生草本植物，是一種新型、優(yōu)良的暖季型草坪草。因其抗寒性較差[1]，適宜在熱帶與亞熱帶氣候條件下生長[2]，除具有耐陰性強(qiáng)[3]、抗旱性好[4]，具有一定的抗病性[5-6]，土壤適應(yīng)性強(qiáng)、再生力強(qiáng)的生物學(xué)特性，還有耐踐踏、綠期較長、耐淹濕[7]等優(yōu)良性狀，適合用于城市的高架橋，疏林地帶的綠化植被，也可以用做草坪草[8]。

據(jù)文獻(xiàn)報道，鈍葉草病害約15種，病原菌約36種[5]，主要包括尾孢菌葉斑病（Cercospora festucae Hardison）、幣斑病（Sclerotinia homoeocarpa F. T. Bennett）、霜霉病（Sclerospora macrospora Sacc.）、蘑菇圈（Agaricals）、灰斑病（Pyricularia grisea Sacc.）[9-12]、絲核菌葉斑?。≧hizoctoria oryzae Ryk. et Gooch）[13]、散黑粉病（Ustilago affinis Ell. & Ev.）[11]、黑孢枯萎?。∟igrospora sphaerica Mason）[11]、褐曲?。≧hizoctonia solani Kuhn）[10， 11， 13]、根腐?。℅aeumannomyces graminis Var.graminis Arx. & D. Oliver）[14]、銹病（Puccinia stenotaphri）[9-11]、葉鞘腐爛病（Rhizoctoria oryzae Ryk. et Gooch）[13]、粘菌病（Fuligo spp.）[13]、鈍葉草衰退病（Panicum mosaic virus）[10-11]等。其中已報道在我國福建的花斑鈍葉草上發(fā)生比較普遍的是尾孢菌葉斑病[15]。但由新月彎孢霉（Curvularia lunata）引起的鈍葉草葉斑病在我國尚未見報道。

新月彎孢菌屬無性型真菌彎孢霉屬，其有性態(tài)為新月旋孢腔菌（Cochliobolus lunata Nelson & Haasis），屬于子囊菌門旋孢腔菌屬真菌（Cochliobolus），二者是異源的[16]。新月彎孢菌（Curvularia lunata，有性態(tài)Cochliobolus lunata）是一種常見的植物病原菌，其寄生兼營腐生，該菌可以侵染水稻、玉米、辣椒、香蕉、番茄、高粱、唐菖蒲等多種作物[17]，引起玉米葉斑病、高粱葉枯病、大麻葉斑病、甘蔗幼苗枯萎病等[18]，該菌甚至對人體也有致病性，可引起真菌性角膜炎、足菌腫和腹膜炎等疾病[19]，是少見的條件致病菌。由新月彎孢菌引起的鈍葉草葉斑病是鈍葉草生產(chǎn)上最為嚴(yán)重的病害之一，多從葉軸發(fā)病，引起葉片大面積枯萎，重則致其枯死。本研究通過病原菌分離純化、形態(tài)學(xué)觀察、致病性測定和分子生物學(xué)鑒定等手段對61份鈍葉草品種（系）的葉斑病進(jìn)行病原鑒定，以期為該病害的綜合防治提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

61份鈍葉草材料收集自中國的海南、福建、廣西、廣東、江蘇、云南，以及美國和南非等不同原產(chǎn)地（表1），種質(zhì)資源種植在海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院實驗基地。每份材料采1份共采取61份疑似鈍葉草葉斑病病葉作為實驗材料。

1.2? 方法

1.2.1? 致病菌分離純化? 采用常規(guī)組織分離法從葉片病斑處分離病原菌[20]，后切取大小約4～5 mm的組織塊，用75%的乙醇浸30 s，0.1%升汞表面消毒2～3 min，然后用無菌水沖洗3次，之后將其分別轉(zhuǎn)移到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上。放置于28 ℃全光照恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察并記錄病原菌的生長情況。

1.2.2? 致病性測定? （1）損傷接種測定。選取分離的病原菌，用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)搖菌，使孢子濃度為107個/mL。從田間采集61份健康、大小均一的鈍葉草植株，每株含12～14片健康新鮮的葉片。將葉片放置于保鮮盒進(jìn)行刺傷接種，每片葉接種1處（具體操作：搖勻病菌，用移液器移50 μL孢子懸浮液于葉片刺傷處），接種處以薄脫脂棉保濕，然后全部用油紙袋封好做保濕處理，7 d后觀察并記錄發(fā)病情況。

（2）非損傷接種測定。選取分離的病原菌，用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)搖菌，使孢子濃度為107個/mL。從田間采集61份健康、大小均一的鈍葉草植株，每株含12～14片健康新鮮葉片。將其放置在三角瓶中進(jìn)行扦插水培，待恢復(fù)生長24 h后接種。將孢子懸浮液均勻噴霧于所有的葉片上，對照組噴清水。共噴2次，間隔3 d噴第2次。實驗植株全部放在透明的大塑料箱中，用油紙袋封好做保濕處理，7 d后觀察并記錄發(fā)病情況，選取致病性最強(qiáng)的菌株做后續(xù)的實驗。

1.2.3? 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定? 將1.2.2篩選出的致病性最強(qiáng)的病原菌分別接種到水瓊脂（WA）培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，經(jīng)過28 ℃全光照恒溫培養(yǎng)一段時間，待生長出菌落，?觀察并記錄菌落的培養(yǎng)性狀，包括菌落的形狀、顏色、氣生菌絲的有無及其是否發(fā)達(dá)。

病原菌形態(tài)觀察包括觀察分子孢子類型、大小、形狀、分隔數(shù);孢子梗的形態(tài)、長度、寬度和顏色等。

1.2.4? 病原菌分子鑒定? PCR序列擴(kuò)增和測序。提取DNA后，分別利用ITS、GAPDH和TUB2基因的部分序列引物對基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列、退火溫度及延伸時間等見表2。

PCR體系總體積為25 μL：0.1 μL TaqDNA聚合酶（5U/μL）;2.5 μL Loading buffer（含Mg2+）;2 μL dNTPs;1 μL引物（10 μmol/L）;2 μL模板DNA，用滅菌ddH2O補足25 μL。后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，拍照記錄，并采用凝膠成像系統(tǒng)分析片段的大小，目的片段經(jīng)回收送往深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。

病原菌rDNA～I(xiàn)TS序列同源性比較。在NCBI數(shù)據(jù)庫檢索測序所得的基因部分序列后，得到序列號分別為：引物ITS對應(yīng)系列號為HF934911，引物GAPDH對應(yīng)系列號為MG018252，引物TUB2對應(yīng)系列號為KT021349。經(jīng)過MEGA 6.0軟件的“W”功能比對校正后，用Bootstrap test構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并采用Neighbor joining法計算遺傳距離。同時對病原菌分別進(jìn)行ITS、TUB2和GAPDH單基因聚類分析，并將基因按照ITS～ GAPDH～TUB2的順序進(jìn)行序列拼接后重新采用上述方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，以進(jìn)一步分析確定該病原菌。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 病害癥狀

新月彎孢霉鈍葉草葉斑病是一種真菌病害，發(fā)病初期，病部出現(xiàn)半透明小斑點，呈淡黃色或水漬狀;隨后，病斑逐漸擴(kuò)大，在病葉產(chǎn)生沿葉軸平行伸長的深褐色、邊緣褪綠的橢圓形或不規(guī)則病斑;發(fā)病后期，病斑中央呈黃褐色或灰白色，且產(chǎn)生一些黑色小粒點，環(huán)境潮濕時發(fā)病嚴(yán)重，產(chǎn)生灰白色霉層和大量分生孢子（圖1），重則整葉枯黃至死亡。

2.2? 病原菌分離和致病力測定

共分離獲得120份菌株，通過損傷接種和非損傷接種2種方法分別對這些分離菌株進(jìn)行病原菌致病力測定，經(jīng)觀察，結(jié)果表明，2種接種方法均能使葉片發(fā)病，且癥狀與初始分離所選的葉片病癥相同（圖1），發(fā)病癥狀和發(fā)病時間無明顯區(qū)別。以接種后發(fā)病葉片作為分離材料再次進(jìn)行分離，重復(fù)接種后，所得病原菌與初次分離所得菌落在分生孢子形態(tài)等方面相同（圖1），符合柯赫氏法則。經(jīng)柯赫氏法則驗證，40株菌株不致病，70株致病較弱，10株致病性強(qiáng)，其中55號菌株經(jīng)2種方法接種，其發(fā)病面積最大，說明其致病性最強(qiáng)。

2.3? 病原菌形態(tài)特征

病原菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上28 ℃全光照恒溫培養(yǎng)4 d后菌落直徑超過5 cm，7 d后長滿培養(yǎng)基，直徑約為9 cm。菌絲體呈絨毛狀，初始為白色，后隨著培養(yǎng)時間增加，由中央向邊緣部位漸變?yōu)榈撞炕液谏厦娌紳M灰白色絨毛狀菌絲;培養(yǎng)基背面在第3天起中部呈灰黑色，近邊緣處呈黃色，后期全部變?yōu)樗{(lán)黑色。分生孢子呈淡褐色，梭形，具3個隔膜，由基部向上第3個細(xì)胞較大;分生孢子梗呈深褐色，有橫膈，頂端多彎曲（圖2）。分生孢子測量大小為（19.39～37.45）μm×（7.78～15.80）μm，分生孢子梗測量大小為（40.41～224.92）μm×（3.84～7.69）μm。通過以上對培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)的觀察，并進(jìn)行相關(guān)資料的查閱[21-23]，可初步鑒定引起該病害的病原菌為彎孢霉屬（Curvularia sp.）新月彎孢霉（C. lunata）。

2.4? 病原菌的分子鑒定

分別利用ITS、GAPDH和TUB2基因的部分序列引物對55號菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物（圖3）。目的片段經(jīng)回收測序后，應(yīng)用核酸數(shù)據(jù)庫中的BLAST軟件，在DNA序列數(shù)據(jù)庫中檢索出同源DNA序列并比較分析。根據(jù)與其親緣關(guān)系較近的DNA序列進(jìn)行比對，顯示均為新月彎孢菌基因組。根據(jù)ITS、TUB2和GAPDH部分序列分別做聚類分析，然后根據(jù)ITS～GAPDH～TUB2這3個基因序列拼接后聚類（圖4）。結(jié)果與各單基因分析類似，進(jìn)一步表明可以將該病原菌歸屬于新月彎孢霉屬。

3? 討論

鈍葉草葉斑病是目前鈍葉草生產(chǎn)上的最主要病害之一，特別是海南高溫高濕的氣候環(huán)境，更有利于該病的暴發(fā)流行。本研究從61份疑似鈍葉草葉斑病的葉片中分離到120個菌株，通過形態(tài)觀察，并經(jīng)文獻(xiàn)比對[21-23]，確定均為彎孢屬。但是絕大部分菌株不致病或致病性較弱，只有少部分比較強(qiáng)，這可能與彎孢菌為弱寄生而又能腐生的習(xí)性有關(guān)，這與金敏忠等[17]的研究結(jié)果一致。另外，實驗只選取來自海南的鈍葉草葉片為靶標(biāo)，可能其他的鈍葉草屬對該病原菌具有抗性，這有待于后期的研究進(jìn)一步驗證。

國外對彎孢霉的研究較早，馬丁于1936年報道了由C. lunata嚴(yán)重侵染水稻引起的谷粒變色[24]。1956年，Nelson等[25]報道了玉米彎孢霉葉斑病的發(fā)生，此后，Mandokhot[26]、Macrì[27]及Gao等[28]在20多個國家也相繼報道了該病[29]。我國對彎孢霉的研究起步較晚，1972年出版的《中國真菌總匯》中報道了5種彎孢菌[30]，1979年出版的《真菌鑒定手冊》報道了4個種[31]，張猛等[32-34]從形態(tài)分類與RAPD技術(shù)相結(jié)合的方式解決了彎孢屬種間的分類。近年來，在Plant Disease上關(guān)于病原物為彎孢屬的報道較多，Chen等[35]首次報道了郁金香葉斑病病原棒彎孢（Curvularia clavata），Bagwari等[36]也報道了由畫眉草彎孢霉（C. eragrostidis）引起的楊樹葉片葉斑病，但未見彎孢霉侵染鈍葉草的報道。

本研究僅對鈍葉草葉斑病病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、致病性測定和分子生物學(xué)鑒定，明確了該病的病原菌為新月彎孢霉（C. lunata），這對于該病害的防治具有指導(dǎo)意義。但由于新月彎孢霉一年四季均可侵染鈍葉草引發(fā)葉斑病，病原菌不需要越冬，而且由于南方地區(qū)高溫高濕的環(huán)境特征，導(dǎo)致該病易發(fā)、頻發(fā)，因此，防治鈍葉草葉斑病除了選用低毒高效的殺菌劑外，還需加強(qiáng)人工栽培管理措施，盡可能減少植株機(jī)械傷口，以減少病原菌侵入，達(dá)到鈍葉草作為一種新型草坪草的最佳利用效果。

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責(zé)任編輯：謝龍蓮