銀杏多糖對小鼠淋巴細胞免疫調節(jié)作用的研究

金 鑫,李敬雙,王一倫,李 賢,李鳳嬌,于 洋

(錦州醫(yī)科大學 食品科學與工程學院,遼寧錦州 121001)

銀杏,又名白果,在中國歷史上作為一種藥食同源的中藥早有使用,如銀杏果藥用早在元代《日用本草》中出現(xiàn)過,明代李時珍的《本草綱目》中也有“銀杏,氣薄、味厚,性澀而收,益肺氣,定咳嗽,縮小便,能殺蟲消毒”的記載[1]。

銀杏多糖(Ginkgobilobapolysaccharides,GBP)是銀杏中一種重要的活性成分。近年來研究發(fā)現(xiàn),銀杏多糖具有免疫調節(jié)[2]、抗腫瘤[3]、抗炎[4]、抗氧化[5]、降低血糖[6]等多種活性作用。Ren Q等[2]利用DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析柱對銀杏葉粗多糖進行了系統(tǒng)的分離純化與單糖組成分析，并通過對巨噬細胞的吞噬能力,NO、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1、IL-6的分泌量等指標來評定其免疫功能,結果顯示,銀杏葉粗多糖由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成并顯示出較好的免疫促進作用。孟秀彥等[7]用銀杏多糖制成滅活的傳染性法氏囊超強毒(vvIBDV)GX8/99細胞適應株佐劑疫苗,對公雛雞進行免疫接種,疫苗的效果通過IL-2和IFN-γ分泌量、血清抗體、外周血淋巴細胞轉化率、外周血CD4+和CD8+T淋巴細胞數(shù)量等指標來評定,結果顯示,以銀杏葉多糖為佐劑的疫苗顯示出較好的免疫促進作用。銀杏多糖作為一種天然活性物質,具有免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等生物活性,且具有毒副作用小、安全性高、來源廣泛等優(yōu)點。我國銀杏種植面積已達260萬畝,總產量已占世界90%以上,正可以作為一種潛在的免疫調節(jié)劑,在醫(yī)藥、功能性食品等領域均有較好的應用前景,因此,對銀杏多糖的進一步綜合開發(fā)利用是十分有意義的。然而目前有關多糖結構和活性關系以及具體的作用機制的研究相對較少,在解析其結構、闡明其銀杏多糖的免疫調節(jié)作用機制等方面仍需進一步深入探索。

體外細胞試驗具有干擾因素少、易于控制,可進行代謝和機制研究的優(yōu)點,因此,為探討銀杏多糖的免疫調節(jié)活性,本實驗體外觀察了銀杏多糖體外對小鼠脾淋巴細胞增殖、細胞周期、細胞因子分泌及其mRNA表達的影響,以期為銀杏多糖的進一步開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

Balb/c小鼠 SPF級,體重(20±2) g,6-8周齡,錦州醫(yī)科大學生命科學院,生產許可證號 SCXK(遼)2014-0004;銀杏多糖 晨光生物技術有限公司,純度≥90%;胎牛血清 浙江天杭生物科技有限公司產品;甲基噻唑藍(methyl thazolyl tetrazolium,MTT)、臺盼藍、RPMI-1640培養(yǎng)基、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、三羥甲基氨基甲烷(trismetyl aminomethane,Tris)和磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution,PBS) 北京索萊寶科技有限公司;小鼠細胞周期試劑盒 德美天旎生物技術有限公司;小鼠IL-4,IFN-γ細胞因子檢測試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司;TaKaRa逆轉錄試劑盒、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)試劑盒 寶生物工程(大連)有限公司。

Varioskan FlashT多功能酶標儀 Thermo Fisher Scientific;超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司,SW-CJ-1F型;倒置顯微鏡 日本OLYMPUS公司,CKX41SF;低速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司,TD5A;96孔或24孔板臺式離心機 上海安亭(TDL80-2B);CO2培養(yǎng)箱 日本SHELLAB;FA2004N型電子天平 上海精密科學儀器有限公司;BD FACSCelesta型流式細胞儀 美國BD公司;Mastercyler ep realplex4型實時熒光定量PCR儀、AG 22331 Hamburg型PCR擴增儀、BioPhotometer plus型蛋白核酸分析儀 德國Eppendorf公司;全自動凝膠成像系統(tǒng) 中國Tanon2500。

1.2 實驗方法

1.2.1 淋巴細胞懸液制備 參考?？鹊萚8]、馬玉芳等[9]實驗方法,小鼠用頸椎脫臼法處死后,拿鑷子夾住小鼠耳部在75%的酒精中浸泡1～2 min進行消毒,在無菌超凈工作臺內將脾取出,放入裝有PBS的培養(yǎng)皿中浸泡1～2 min后轉移到RPMI-1640培養(yǎng)基中,用注射器拉桿末端研磨透過200目濾網塞。將濾液吸出至離心管,1500 r/min 4 ℃離心5 min,棄上清后加入紅細胞裂解液 3 mL裂解紅細胞,靜置5 min再離心,再棄上清,重復操作直至紅細胞完全裂解。用RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸沉淀細胞并過濾,臺盼藍染色后用倒置顯微鏡觀察,調整細胞活力達95%以上并加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液使細胞密度達5×106個/mL,制成淋巴細胞懸液。

表1 實驗中小鼠IL-4、IFN-γ和內參ACTB引物序列Table 1 Mouse IL-4、IFN-γ and internal reference ACTB primer sequences in the experiment

1.2.2 實驗分組與處理 實驗設空白對照組、陽性對照組、銀杏多糖處理組?？瞻讓φ战M每孔加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基,陽性對照組每孔加入含5 μg/mL左旋咪唑的RPMI-1640完全培養(yǎng)基,銀杏多糖處理組每孔加入含不同濃度銀杏多糖(25、50、100、200、400 μg/mL)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。將淋巴細胞懸液接種于24孔細胞培養(yǎng)板,每組設3個復孔,每孔加入1 mL淋巴細胞懸液和1 mL相應的RPMI-1640完全培養(yǎng)基;接種于96孔細胞培養(yǎng)板,每組設5個復孔,每孔加入100 μL淋巴細胞懸液和100 μL相應的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。

1.2.3 MTT法檢測銀杏多糖對淋巴細胞增殖的影響 參考張思哲等[10]實驗方法,將淋巴細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板,按1.2.2實驗分組及處理。在37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)48 h后每孔再加入20 μL MTT液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清,每孔再加入150 μL DMSO,將酶標儀設置為570 nm后測OD值。小鼠的脾淋巴細胞增殖率以增殖指數(shù)(PI)來表示。

1.2.4 流式細胞術檢測銀杏多糖對淋巴細胞周期的影響 參考駱梅等[11]實驗方法,將淋巴細胞懸液接種于24孔細胞培養(yǎng)板,按1.2.2實驗分組及處理。37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)48 h后,以1200 r/min離心3 min,每孔加入1 mL PBS重懸細胞,離心棄上清,輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞,避免細胞成團。加入1 mL預冷70%乙醇中,輕輕吹打混勻,4 ℃固定過夜。將已固定的細胞以1200 r/min離心3 min,棄上清后,每管加入1 mL預冷的 PBS,重懸細胞,離心棄上清,每管再加入0.5 mL的碘化丙啶染色液,37 ℃避光孵育30 min,用流式細胞儀檢測及Modifit分析。

1.2.5 ELISA法檢測銀杏多糖對淋巴細胞分泌細胞因子的影響 參考Xie等[12]實驗方法,將淋巴細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板,按1.2.2實驗分組及處理。37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)48 h后,1500 r/min 4 ℃離心5 min,收集上清。用ELISA法檢測銀杏多糖對淋巴細胞IL-4、IFN-γ分泌的影響,具體操作參考小鼠細胞因子試劑盒說明書進行。

1.2.6 qRT-PCR法檢測銀杏多糖對IL-4、IFN-γmRNA表達的影響 參考Pan等[13]實驗方法,將淋巴細胞懸液接種于24孔細胞培養(yǎng)板,按1.2.2實驗分組及處理。37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)48 h。棄上清,用PBS清洗2次,每管加1 mL Trizol,使細胞完全裂解,換EP管,以12000 r/min,4 ℃離心10 min,棄沉淀,每管加入500 μL的三氯甲烷,上下劇烈搖晃30 s,冰浴10 min。以12000 r/min,4 ℃離心10 min,棄上清,再加入500 μL的異丙醇,上下顛倒8次,冰浴10 min,以12000 r/min,4 ℃離心15 min,小心吸除上清液,將管底沉淀留存下來。每管分別加入1 mL 75%冰乙醇,上下顛倒混勻,以12000 r/min,4 ℃離心10 min,棄去上清液,再加入1 mL 75%冰乙醇,上下顛倒混勻,以 12000 r/min,4 ℃離心5 min后再棄上清,室溫放置30 min。加入RNase-free水20 μL溶解沉淀。將上述溶解的RNA溶液取出1 μL在超微量紫外/可見分光光度計260 nm及280 nm處測定吸光度比值,并將其Total RNA的濃度記錄下來,比值在1.8～2.1之間,表明提取的RNA未污染,質量好。

按照TaKaRa逆轉錄試劑盒的說明配制反應體系:1 μL gDNA Eraser,2 μL 5×gDNA Eraser Buffer,6 μL Rnase Free dH2O,1 μL Total RNA,總體系為10 μL,混合均勻,室溫放置20 min后,加入1 μL Primescript RT Enzyme Mix I,1 μL RT Primer Mix,4 μL 5×PrimeScript Buffer 2,4 μL Rnase Free dH2O,總體系為20 μL。在37 ℃條件下反應15 min,85 ℃反應5 s,最終得到cDNA樣品放于-80 ℃保存。參考謝嬋[14]、Khatlani等[15]引物設計,并對所用的PCR引物進行預試驗。

采用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)試劑盒的說明配制反應體系:12.5 μL 2×TB Green Premix Ex Taq II,1 μL上游引物,1 μL下游引物,2 μL cDNA模板,8.5 μL滅菌水,共25 μL,混合均勻,進行Real time PCR反應,按照擴增試劑盒的程序設置為95 ℃ 30 s預變性、95 ℃ 5 s變性、60 ℃ 30 s退火,40個循環(huán)。以ACTB作為內參,擴增完后采用 2-ΔΔCt方法進行數(shù)據(jù)分析以得到目的基因的相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 銀杏多糖對淋巴細胞增殖的影響

機體最主要的免疫細胞正是淋巴細胞,分為B淋巴細胞和T淋巴細胞。由表2可知,與空白組相比,陽性組和銀杏多糖處理組淋巴細胞增殖指數(shù)均極顯著升高(P<0.01);銀杏多糖處理組在25～200 μg/mL濃度范圍內,淋巴細胞增殖指數(shù)隨銀杏多糖濃度的升高而升高,呈良好的劑量-效應關系,繼續(xù)升高銀杏多糖濃度至400 μg/mL,淋巴細胞增殖指數(shù)反而顯著下降(P<0.05),說明銀杏多糖對淋巴細胞增殖呈雙向調節(jié)作用。與陽性組相比,銀杏多糖處理組在25、50、100、400 μg/mL時淋巴細胞增殖指數(shù)極顯著低于陽性組(P<0.01),銀杏多糖處理組為200 μg/mL時淋巴細胞增殖指數(shù)低于陽性組,但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。已有研究表明,多糖主要通過影響淋巴細胞增殖能力、亞群結構、細胞因子的分泌、NO的釋放能力等對淋巴細胞產生調節(jié)作用[16]。另有研究表明商陸均一多糖對小鼠脾淋巴細胞增殖產生顯著促進作用[17]、杏鮑菇菌糠多糖對小鼠脾指數(shù)、脾淋巴細胞增殖及免疫因子均有調節(jié)作用[18]。這與本研究結果一致,因此提示銀杏多糖與左旋咪唑均能通過促進小鼠脾淋巴細胞的增殖產生免疫調節(jié)作用。

表2 銀杏多糖對淋巴細胞增殖的影響Table 2 Effects of GBP on lymphocyte

2.2 銀杏多糖對淋巴細胞周期的影響

細胞周期對細胞增殖又有著縝密的調控作用,在細胞周期中,G1期為DNA合成的準備期,S期涉及DNA合成,G2為有絲分裂做準備,M期為分裂期[19]。由表3可知,與空白組相比,陽性組和銀杏多糖處理組G0/G1期細胞占比均極顯著降低,S期+G2/M總占比均極顯著升高(P<0.01),且銀杏多糖對淋巴細胞周期呈雙向調節(jié)作用。與左旋咪唑組相比,銀杏多糖處理組在25、50、100、400 μg/mL時G0/G1期占比極顯著高于陽性組、S期+G2/M期細胞總占比極顯著低于陽性組(P<0.01),而200 μg/mL銀杏多糖處理組的G0/G1期占比極顯著低于陽性組、S期+G2/M期細胞總占比極顯著高于陽性組(P<0.01)。已有研究表明,G0/G1期細胞是細胞周期增殖過程的啟動點,細胞周期由G1期進入S期存在G1→S阻滯點,一旦G1期受阻,細胞則不能順利進入S期進行DNA復制,淋巴細胞的生長就會受到抑制[20-22]。上述結果表明,銀杏多糖與左旋咪唑均能誘導淋巴細胞通過G1→S阻滯點,順利進入S期完成DNA復制,進行有絲分裂,進而促進淋巴細胞的生長發(fā)育。

表3 銀杏多糖對淋巴細胞周期的影響Table 3 Effects of GBP on lymphocyte

2.3 銀杏多糖對淋巴細胞IFN-γ、IL-4分泌的影響

正常情況下,T細胞按一定比例向Th1和Th2細胞分化,兩者處于動態(tài)平衡,調節(jié)正常的免疫應答。IFN-γ能夠誘導Th0細胞分化為Th1細胞,Th1細胞又可以分泌IFN-γ、IL-12、IFN-γ等細胞因子同時可抑制過度的Th2細胞介導的免疫反應;IL-4能夠刺激Th0細胞分化為Th2細胞,Th2細胞又可以分泌IL-4、IL-6、IL-10等細胞因子同時可抑制過度的Th1細胞介導的免疫反應[23-25],因此,IFN-γ和IL-4之間既相互抑制又自身促進,不僅維持自身平衡對維持Th1和Th2的平衡也有重要作用[26]。由表4可知,與空白組相比,陽性組和銀杏多糖處理組的細胞因子IFN-γ、IL-4分泌量極顯著增加(P<0.01);與陽性組相比,銀杏多糖處理組為200 μg/mL時細胞因子IFN-γ、IL-4的分泌量低于陽性組,但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與空白組相比,陽性組、25、100、200 μg/mL銀杏多糖處理組的IFN-γ/IL-4比值均低于空白組,且陽性組、100、200 μg/mL銀杏多糖處理組與空白組的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),銀杏多糖處理組在50、400 μg/mL時IFN-γ/IL-4比值高于空白組,且400 μg/mL銀杏多糖處理組與空白組的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與陽性組相比,100、200 μg/mL銀杏多糖處理組IFN-γ/IL-4比值低于陽性組,但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。銀杏多糖處理組IFN-γ/IL-4比值從25 μg/mL起始,到50 μg/mL時上升,到100 μg/mL時下降,直至400 μg/mL時再度上升,形成了IFN-γ/IL-4(Th1/Th2)動態(tài)平衡。已有研究對正常BALB/c小鼠分別灌胃銀杏外種皮多糖(GBEP)10.00、3.33、1.11 g/kg后,IFN-γ/IL-4比值先降低后升高,且比對照組低[27]。這與本研究結果有一致之處,因此提示銀杏多糖能夠通過促進細胞因子IFN-γ、IL-4的分泌、維持IFN-γ/IL-4(Th1/Th2)動態(tài)平衡,對小鼠的細胞免疫產生一定的促進作用。

表4 銀杏多糖對淋巴細胞IFN-γ、IL-4分泌的影響Table 4 Effects of GBP on IFN-γ、IL-4 secretion in

2.4 銀杏多糖對淋巴細胞IFN-γ、IL-4 mRNA表達的影響

表5 銀杏多糖對淋巴細胞IFN-γ 和IL-4 mRNA的影響Table 5 Effects of GBP on IFN-γ and IL-4 mRNA in

2.4.1 銀杏多糖對淋巴細胞IFN-γmRNA表達的影響 由表5和圖1可知,與空白組相比,陽性組和銀杏多糖處理組IFN-γ細胞因子mRNA表達量均極顯著上升(P<0.01);銀杏多糖處理組在25～200 μg/mL范圍內隨銀杏多糖濃度的上升其mRNA的表達量持續(xù)增加,繼續(xù)升至400 μg/mL反而下降,說明銀杏多糖對誘導淋巴細胞IFN-γmRNA的表達呈雙向調節(jié)作用。與陽性組相比,銀杏多糖處理組在25、50、100、400 μg/mL時,IFN-γmRNA相對表達量極顯著低于陽性組(P<0.01),銀杏多糖處理組在200 μg/mL時,IFN-γmRNA相對表達量低于陽性組,但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。已有研究發(fā)現(xiàn),海膽多糖體外可以上調小鼠脾淋巴細胞Th1細胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γmRNA表達[28]。上述結果表明,銀杏多糖可能通過調控IFN-γmRNA表達水平,來調節(jié)細胞因子的分泌量,從而對機體免疫功能產生促進作用。

2.4.2 銀杏多糖對淋巴細胞IL-4 mRNA表達的影響 由表5和圖2可知,與空白組相比,陽性組和銀杏多糖處理組IL-4細胞因子mRNA表達量均極顯著上升(P<0.01);銀杏多糖組在25～200 μg/mL濃度范圍內隨銀杏多糖濃度的上升其mRNA的表達量持續(xù)增加,繼續(xù)升至400 μg/mL反而下降,說明銀杏多糖對誘導淋巴細胞IL-4 mRNA的表達量呈雙向調節(jié)作用。與陽性組相比,銀杏多糖處理組在25、50、100、400 μg/mL時,IL-4 mRNA相對表達量極顯著低于陽性組(P<0.01),銀杏多糖處理組在200 μg/mL時,IL-4 mRNA相對表達量低于陽性組,但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。朱軼鋒等[29]研究發(fā)現(xiàn)APS的濃度為80～320 μg/mL時對外周血、胸腺、脾臟和法氏囊淋巴細胞增殖,細胞因子IL-2、TNF-β、IFN-γ、IL-4、IL-6的分泌以及相關基因mRNA的表達有顯著的促進作用。上述結果表明,銀杏多糖可能通過調控IL-4 mRNA表達水平,來調節(jié)細胞因子的分泌量,從而對機體免疫功能產生促進作用。

圖1 IFN-γ mRNA電泳結果Fig.1 Electrophoresis results of IFN-γ mRNA

圖2 IL-4 mRNA電泳結果Fig.2 Electrophoresis results of IL-4 mRNA注:ACTB組:1. marker,2. 空白組,3. 左旋咪唑組,4. 25 μg/mL銀杏多糖組,5. 50 μg/mL銀杏多糖組,6. 100 μg/mL銀杏多糖組,7. 200 μg/mL銀杏多糖組,8. 400 μg/mL銀杏多糖組;IFN-γ組:9. 空白組,10. 左旋咪唑組,11. 25 μg/mL銀杏多糖組,12. 50 μg/mL銀杏多糖組,13. 100 μg/mL銀杏多糖組,14. 200 μg/mL銀杏多糖組,15. 400 μg/mL銀杏多糖組;IL-4組:9. 空白組,10. 左旋咪唑組,11. 25 μg/mL銀杏多糖組,12. 50 μg/mL銀杏多糖組,13. 100 μg/mL銀杏多糖組,14. 200 μg/mL銀杏多糖組,15. 400 μg/mL銀杏多糖組。

3 結論

本文通過體外觀察銀杏多糖對小鼠脾淋巴細胞增殖、細胞周期、細胞因子分泌及其mRNA表達的影響,表明銀杏多糖能夠提高小鼠脾淋巴細胞體外免疫活性,其作用機制可能是通過上調IFN-γ和IL-4 mRNA表達來調節(jié)細胞因子的分泌量,進而維持IFN-γ/IL-4(Th1/Th2)動態(tài)平衡;誘導細胞通過G1-S期關卡,順利進入S期,DNA復制起始,細胞進行生長與增殖,從而發(fā)揮其提高機體免疫功能的作用。對闡明銀杏多糖的免疫調節(jié)作用機制及開發(fā)銀杏多糖類的保健功能食品具有一定的參考價值。本文探討了銀杏多糖對小鼠淋巴細胞的免疫調節(jié)作用,因此,今后的研究應重點關注銀杏多糖在體內的免疫調節(jié)作用、其藥理活性與多種信號通路關系及如何調控這些信號分子。