牛佳卉,袁 靜,魏 然,張曉富,張慧芳,賈金玉,趙 文

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)中心,河北保定 071001)

紅棗(ZizyphusjujubaMill.)是我國的特產(chǎn)水果,富含多糖、多酚、三萜酸、環(huán)核苷酸等多種生物活性成分[1],具有藥食兩用的特點。我國棗資源豐富,2018年產(chǎn)量達(dá)880多萬噸[2],但高產(chǎn)低值問題嚴(yán)重。多糖是紅棗中含量較高的功能性營養(yǎng)成分,具有抗腫瘤、降血脂、抗氧化、護(hù)肝、提高免疫力、調(diào)節(jié)腸道菌群等生物學(xué)作用[3-7],但有關(guān)保護(hù)腸道屏障的功能與機制研究較少。

腸道,作為最大的身體黏膜層,暴露在大量的外來物質(zhì)中,是人體的一道天然屏障,分為物理屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障和生物屏障,可以防止食物中的有毒有害物質(zhì)進(jìn)入血液[8]。腸道屏障一旦被破壞會導(dǎo)致大量的細(xì)菌和內(nèi)毒素經(jīng)門靜脈和淋巴系統(tǒng)侵入機體循環(huán),引起腸源性膿毒血癥和內(nèi)毒血癥,不僅加重原發(fā)疾病,甚至?xí)T發(fā)全身嚴(yán)重反應(yīng)和多器官功能障礙綜合征,進(jìn)而危及生命[9]。因此,研究紅棗多糖對腸黏膜受損小鼠腸道屏障的保護(hù)作用,對于進(jìn)一步挖掘紅棗的營養(yǎng)功能、開發(fā)相關(guān)功能性產(chǎn)品、解決我國紅棗高產(chǎn)低值問題具有重要意義。

本文重點研究紅棗多糖對小鼠腸道免疫屏障的保護(hù)作用及機制,首先建立腸道粘膜受損小鼠模型,然后觀察腸道病理切片中腸道的形態(tài)結(jié)構(gòu),其次根據(jù)腸道免疫相關(guān)指標(biāo)和腸道蛋白表達(dá)情況來評價JPS對腸道免疫屏障的保護(hù)作用及作用機制,以期進(jìn)一步挖掘棗的藥食兩用功能,促進(jìn)中國棗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,推動相關(guān)產(chǎn)品創(chuàng)新開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅棗多糖(Jujube Polysaccharides,JPS,多糖含量為70.44%±1.82%) 本實驗室制備(原料為產(chǎn)自保定阜平縣的婆棗,提取方法為:將棗烘干后粉碎成粉末,按照料液比為1∶10 (g∶mL)添加蒸餾水,加入0.3%的纖維素酶,在55 ℃下水浴5 h,將水浴后的溶液4000 r/min離心10 min,合并提取溶液過濾并濃縮至原始體積的一半,然后加入4倍體積的95%(v/v)乙醇沉淀2 d,放置4 ℃,醇沉2次,4000 r/min離心10 min,將沉淀凍干得到樣品多糖);SPF級雄性ICR小鼠 70只,體重約18～22 g,購于北京華阜康生物科技股份有限公司,許可證號:SCXK(京)2014-0004;溶菌酶(Lysozyme,LZM)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase,ACP)、分泌型免疫球蛋白A(Secretory immunoglobulin A,SIgA)、免疫球蛋白A(Immunoglobulin A,IgA)、環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX) 上海源葉生物科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒、Western Blot loading buffer 上海索萊寶生物科技有限公司;Rabbit Anti-NF-κB p65 antibody、Rabbit Anti-MyD88 antibodyCell Signaling Technology;Rabbit Anti-IL-1 beta antibodyAbcam;Anti-β-actin antibody、Goat Anti-Mouse IgG、Goat Anti-Rabbit IgG 北京博奧森生物技術(shù)有限公司;組織蛋白抽提試劑盒、eECL化學(xué)發(fā)光顯影液 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1500-823型全波長掃描酶標(biāo)儀 Thermo Scientific公司;電泳儀(JY600E)、電泳槽、電轉(zhuǎn)槽 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;Tanon-4600SF全自動數(shù)碼凝膠/化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng) 上海天能科技有限公司;Scientz-ⅡD型超聲細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;RM2235型組織病理切片機 德國Leica公司;4590型石蠟包埋機 日本SAKURA精密技術(shù)公司;CKX41型奧林巴斯倒置電子熒光顯微鏡 長恒榮創(chuàng)科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物分組與建模 將70只雄性ICR小鼠購入后適應(yīng)性喂養(yǎng)2～3 d,按體重隨機分為5組,每組14只,分為陰性對照組、模型組、JPS 150、300和600 mg/kg·bw三個劑量組,將小鼠連續(xù)灌胃28 d。其中陰性對照組和模型組用蒸餾水等體積灌胃,劑量組灌胃不同劑量的多糖提取物,劑量設(shè)置依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[10-12]和前期預(yù)試驗結(jié)果可知JPS 300 mg/kg的效果較好,因此為中劑量,低、高劑量分別設(shè)為150、600 mg/kg·bw,連續(xù)灌胃到第28 d,實驗第28 d進(jìn)行造模的準(zhǔn)備,具體操作方法為模型組和紅棗多糖劑量組按照劑量100 mg/kg·bw腹腔注射給予小鼠環(huán)磷酰胺,陰性對照組則按照等體積法用生理鹽水進(jìn)行腹腔注射。

1.2.2 動物處理及樣本采集 末次給藥造模后,將各組動物禁食12 h,然后稱重記錄體重。頸椎脫臼法處死動物,解剖取其脾臟、胸腺并稱重記錄,取部分腸道組織,制成10%腸道勻漿,3000 r/min離心5 min取上清待測。再取各腸段組織放置10%的福爾馬林溶液中充分固定,石蠟包埋,HE染色,制作病理切片,進(jìn)行病理組織形態(tài)學(xué)檢查。最后將剩余的腸道組織放入-80 ℃冰箱冷凍備用。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 免疫器官指數(shù)的測定

脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(mg)/小鼠體重(g)

胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量(mg)/小鼠體重(g)

1.3.2 小鼠腸道派伊爾結(jié)(Peyer’s Patch,PP結(jié))的計數(shù) 將小鼠解剖后取出的小腸放入含有PBS液的培養(yǎng)皿中,將腸黏膜表面的脂肪組織清除干凈,在小腸的最外層,位于腸系膜的對側(cè)的麥粒狀的圓形突起為派伊爾結(jié)。肉眼觀察計數(shù)小腸的派伊爾結(jié)的數(shù)目,每組小鼠的派伊爾結(jié)取平均值。

1.3.3 腸道生化指標(biāo)的測定 取制備好的腸道勻漿,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書分別測定SIg A、IgA、LZM、ACP等生化指標(biāo)。

1.3.4 腸道病理組織形態(tài)學(xué)觀測及免疫細(xì)胞計數(shù) 用甲醛溶液與蒸餾水按體積比1∶10的比例配制福爾馬林溶液,室溫下備用。將小鼠各腸段取出后,放入10%的中性福爾馬林溶液中,固定24 h,然后進(jìn)行常規(guī)包埋,用于HE染色。在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)腸道絨毛中腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的數(shù)量。

1.3.5 腸道中MyD88、NF-κB p65、IL-1β蛋白的表達(dá)測定 采用Western Blotting的方法測定腸道MyD88、NF-κB p65、IL-1β蛋白的表達(dá)。按照組織蛋白抽提試劑盒中說明書的要求提取腸道組織蛋白,最終蛋白樣品以4∶1的比例加入緩沖液,然后將樣品沸水浴5 min使蛋白變性,最后將蛋白樣品保存于-80 ℃冰箱中備用。進(jìn)行SDS-PAGE,用預(yù)染蛋白質(zhì)Marker對比分子質(zhì)量,用濕轉(zhuǎn)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。用5%的脫脂奶粉封閉2 h,在4 ℃下一抗孵育過夜,然后用TBST清洗3次,再用二抗孵育1 h,用TBST清洗5次,最后配置HRP顯色液,在膜上均勻滴顯色液,獲得圖像并分析。

表1 JPS對小鼠免疫器官指數(shù)的影響Table 1 Effect of JPS on immune organ index in mice

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用ImageJ-win64分析Western Blot圖像,試驗數(shù)據(jù)運用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗,若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。本試驗中所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示。P<0.05,表示顯著差異;P<0.01,表示極顯著差異。

圖1 JPS對小鼠腸道病理切片的影響Fig.1 Effect of JPS on intestinal pathological sections of mice 注:a:十二指腸;b:空腸;c:回腸。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅棗多糖對小鼠腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

小鼠十二指腸、空城、回腸的形態(tài)變化如圖1所示。由圖1可以看出,各腸段陰性對照組小腸絨毛整齊排列,纖長,絨毛之間的間隙較小。與陰性對照組相比,模型組各腸段小腸絨毛形狀不規(guī)則,絨毛長度低于陰性對照組,此外,小腸絨毛排列松散,絨毛之間的間隙增大,一些絨毛甚至斷裂和脫落,表明模型造模成功。與模型組比,JPS低劑量組與模型組相比改善不明顯;中、高劑量組絨毛形態(tài)改善較大,絨毛長且排列緊密,絨毛斷裂、脫落的現(xiàn)象減輕,絨毛間隙變小。因此,環(huán)磷酰胺對小鼠腸道的絨毛形態(tài)具有破壞作用,而JPS可以改善環(huán)磷酰胺對小腸絨毛結(jié)構(gòu)的損傷,保護(hù)腸道屏障,此結(jié)果與李學(xué)敏[13]等人的研究一致。

2.2 紅棗多糖對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

由表1可以看出,與陰性對照組相比,模型組胸腺和脾臟指數(shù)極顯著下降(P<0.01)。與模型組相比,JPS低、中劑量組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)沒有顯著性差異,但中劑量組的脾臟、胸腺指數(shù)有所提高。JPS高劑量組脾臟指數(shù)增加,但差異不明顯,胸腺指數(shù)顯著增加(P<0.05)。

機體的免疫功能與免疫器官的發(fā)育情況密切相關(guān),免疫器官是免疫細(xì)胞形成、分化及生成的重要場所,胸腺和脾臟是機體的重要免疫器官,其生長發(fā)育與機體的免疫功能具有直接聯(lián)系[14-15]。本研究表明JPS對環(huán)磷酰胺造成的小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)具有正調(diào)節(jié)作用,其結(jié)果與蕨類多糖和黃芪多糖[16-17]均能提高免疫抑制小鼠臟器指數(shù),緩解環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制結(jié)果相似。

2.3 紅棗多糖對小鼠腸道PP結(jié)的影響

派伊爾結(jié)又稱派爾集合淋巴結(jié),是腸黏膜免疫系統(tǒng)的重要組成部分。PP結(jié)的大小、數(shù)量可以反應(yīng)腸道黏膜免疫的狀態(tài)[18-19]。表2表明了JPS對小鼠腸道PP結(jié)的數(shù)量變化。可知與陰性對照組相比,模型組中PP結(jié)的個數(shù)顯著減少(P<0.05),與周華等[20]研究環(huán)磷酰胺對小鼠Peyer’s結(jié)和腸道粘膜相關(guān)淋巴細(xì)胞的影響結(jié)果一致。與模型組相比,JPS各劑量組的腸道PP結(jié)數(shù)量明顯增加,其中JPS低劑量組顯著增加(P<0.05),中、高劑量組極顯著增加(P<0.01)。研究結(jié)果表明JPS可改善環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的腸道粘膜免疫功能損傷的情況,增加腸道PP結(jié)的數(shù)量,增強腸道免疫功能。

表2 JPS對小鼠腸道PP結(jié)的影響Table 2 Effect of JPS on intestinal PP node in mice

2.4 紅棗多糖對小鼠腸道免疫指標(biāo)的影響

由表3可知,與陰性對照組比較,模型組小鼠腸粘膜SIgA、IgA分泌不同程度的下降,差異極顯著(P<0.01),說明環(huán)磷酰胺可明顯損害腸道上皮細(xì)胞分泌抗菌物質(zhì),此實驗造模是成功的;與模型組相比,JPS低劑量組SIgA含量顯著增加(P<0.05),IgA含量無顯著性變化,中劑量組的SIgA和IgA含量顯著增加(P<0.05),高劑量組的SIgA和IgA含量極顯著增加(P<0.01),且呈現(xiàn)劑量和依賴關(guān)系,表明JPS對SIgA和IgA的分泌有顯著的改善的作用。與陰性對照組相比,模型組的溶菌酶和酸性磷酸酶的酶活性均顯著降低(P<0.05);與模型組相比,JPS組低劑量組的溶菌酶和酸性磷酸酶的活性沒有顯著性的變化(P>0.05)。而JPS中、高劑量組的溶菌酶和酸性磷酸酶的酶活均顯著增加(P<0.05)。

表3 JPS對小鼠小腸腸道免疫指標(biāo)的影響Table 3 Effect of JPS onimmune index in small intestine of mice

表4 JPS對小鼠腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量變化的影響Table 4 Effects of JPS on the number of lymphocytes in the intestinal epithelium of mice

SIgA是由腸黏膜固有層漿細(xì)胞分泌的免疫球蛋白,是腸道免疫屏障的主要效應(yīng)因子,在腸道黏膜表面起到重要的免疫保護(hù)作用,能夠增強腸道的免疫功能[21-22]。IgA是黏膜免疫的主要抗體,是維持腸道黏膜穩(wěn)態(tài)的重要物質(zhì)[23-24]。本研究結(jié)果說明JPS可以加快小鼠中腸黏膜SIg A的分泌量的速度,在一定程度上拮抗環(huán)磷酰胺對腸道SIg A的分泌抑制作用。

溶菌酶由巨噬細(xì)胞分泌,其能夠改善增強巨噬細(xì)胞的吞噬功能,結(jié)合細(xì)菌脂多糖,減輕內(nèi)毒素作用,進(jìn)而增強機體的抵抗力,還有抗菌、抗炎和抗病毒的作用[25-26]。酸性磷酸酶是溶酶體的標(biāo)志酶,而溶酶體大量存在于巨噬細(xì)胞中,因此,酸性磷酸酶水平反映了巨噬細(xì)胞的激活程度[27]。本試驗研究結(jié)果類似與黃秀芳等人的研究[28],表明紅棗多糖能夠通過提高腸道的溶菌酶和酸性磷酸酶的活力來增強腸道的免疫功能,進(jìn)而保護(hù)腸道免疫屏障免受環(huán)磷酰胺對其造成的損傷。

2.5 紅棗多糖對小鼠腸道免疫細(xì)胞的影響

上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞是存在于小腸粘膜上皮的一類獨特的淋巴細(xì)胞群,在腸道免疫過程中最先與抗原接觸,發(fā)揮免疫屏障作用,可反映腸黏膜免疫屏障的完整性及免疫防御功能的完善程度[29]。由表4可知,與陰性對照組相比,模型組中十二指腸、空腸和回腸中的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量極顯著下降(P<0.01);與模型組相比,JPS中劑量組的十二指腸、空腸中上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞顯著增加(P<0.05),而回腸中極顯著增加(P<0.01)。JPS高劑量組中十二指腸的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞顯著增加(P<0.05),而空腸和回腸中極顯著增加(P<0.01)。研究結(jié)果表明,JPS能促進(jìn)腸道內(nèi)上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的增殖,在一定程度上緩解環(huán)磷酰胺對小鼠腸道造成的粘膜免疫損傷,此結(jié)果與廖呂燕的研究類似[30]。同時還發(fā)現(xiàn)腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量從十二指腸到回腸逐漸減小,有可能是因為不同腸段接觸不同種類和數(shù)量的病原微生物及抗原有關(guān),這一變化特點與有關(guān)報道一致[31]。

杯狀細(xì)胞分布于腸絨毛柱狀細(xì)胞之間,是一種分泌高度糖基化黏蛋白的細(xì)胞,通過有效隔離宿主上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞與腸道微生物接觸,抑制腸道過度炎癥反應(yīng),進(jìn)而維持腸道免疫屏障穩(wěn)態(tài)[32-33]。由表5可知,杯狀細(xì)胞從十二指腸到回腸其數(shù)量呈逐漸增加趨勢。與陰性對照組相比,模型組中十二指腸、空腸和回腸的杯狀細(xì)胞的數(shù)量極顯著下降(P<0.01);與模型組相比,JPS中劑量組十二指腸和空腸中杯狀細(xì)胞的數(shù)量極顯著增加(P<0.01),回腸中杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.05)。高劑量組中十二指腸、空腸和回腸中杯狀細(xì)胞的數(shù)量分別極顯著增加(P<0.01)。研究結(jié)果表明,JPS能夠促進(jìn)腸道中杯狀細(xì)胞的增殖,調(diào)節(jié)環(huán)磷酰胺所導(dǎo)致小鼠腸道免疫細(xì)胞下降的趨勢,增加小鼠腸道免疫細(xì)胞的數(shù)量。

表5 JPS對小鼠腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量變化的影響Table 5 Effects of JPS on the number of intestinal goblet cells in mice

圖2 JPS對小鼠腸道MyD88、NF-κB p65和IL-1β蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of JPS on MyD88,NF-B p65 and Il-1 protein expression in intestinal tract of mice注:A為陰性對照組,B為模型對照組,C為紅棗多糖低劑量組,D為紅棗多糖中劑量組,E為紅棗多糖高劑量組。 與陰性對照組相比,#P<0.05,##P<0.01;與模型組相比,*表示P<0.05,**表示P<0.01。

同時發(fā)現(xiàn),腸道杯狀細(xì)胞的數(shù)量從十二指腸到回腸逐漸增加,這與文獻(xiàn)[34]報道的一致,可能因為回腸作為小腸、大腸的交界,更容易受到微生物的侵害,免疫屏障較弱,所以回腸的杯狀細(xì)胞數(shù)量較多。

2.6 紅棗多糖對小鼠腸道蛋白表達(dá)的影響

圖2顯示了JPS對小鼠腸道中MyD88、NF-κB p65和IL-1β蛋白的表達(dá)情況。由圖2可知與陰性對照組相比,模型組極顯著上調(diào)MyD88和IL-1β蛋白的表達(dá)(P<0.01)，顯著上調(diào)NF-κB p65蛋白的表達(dá)(P<0.05);與模型組比,JPS低劑量組顯著下調(diào)MyD88蛋白的表達(dá)(P<0.05),極顯著下調(diào)IL-1β蛋白的表達(dá)(P<0.01),對NF-κB p65蛋白的表達(dá)無顯著性影響(P>0.05),JPS中、高劑量組均極顯著下調(diào)MyD88、NF-κB p65、IL-1β蛋白的表達(dá)(P<0.01)。

MyD88是TLRs信號通路的關(guān)鍵接頭分子,在啟動核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB依賴的信號級聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用[35]。NF-κB作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,廣泛參與炎性介質(zhì)和前炎性介質(zhì)的調(diào)控,在機體的先天性免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答中起著關(guān)鍵作用,調(diào)節(jié)多種炎癥因子和免疫效應(yīng)蛋白的表達(dá),而NF-κB p65蛋白是啟動NF-κB途徑的關(guān)鍵蛋白[36]。研究表明,黃芩苷[37]可通過對NF-κB信號通路的調(diào)控,從而減少炎性因子(IL-1β,TNF-α)的分泌,發(fā)揮抗炎作用,保護(hù)免疫屏障。中藥單體鹽酸小檗堿[38]可通過降低UC小鼠體內(nèi)的TNF-α、IL-1β水平,升高IL-10表達(dá)水平來改善UC小鼠的結(jié)腸炎癥,減少腸壁通透性。而本試驗結(jié)果表明紅棗多糖通過下調(diào)MyD88、NF-κB p65的表達(dá),導(dǎo)致少量的NF-κB釋放,少部分的從胞漿轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核,從而調(diào)控淋巴細(xì)胞中炎性因子的合成和釋放,抑制IL-1β的分泌,進(jìn)而提高腸道免疫功能,保護(hù)腸道屏障。

3 結(jié)論

本試驗通過建立環(huán)磷酰胺所致腸道黏膜損傷小鼠的模型,研究JPS對其腸道免疫屏障的保護(hù)作用。結(jié)果表示JPS能夠緩解環(huán)磷酰胺對小鼠腸道造成的損傷,維持其正常的的腸道形態(tài)結(jié)構(gòu),保護(hù)腸道屏障;通過增加腸道PP結(jié)的數(shù)量,增強腸道SIgA、IgA的分泌以及溶菌酶和酸性磷酸酶的活性,增加腸道免疫細(xì)胞的數(shù)量,來增強機體腸道免疫屏障。機制可能與下調(diào)腸道黏膜損傷小鼠腸細(xì)胞MyD88、NF-κB p65和IL-1β蛋白的表達(dá),抑制NF-κB通路的激活,降低炎癥因子的分泌有關(guān)。