代謝工程改造微生物合成單萜芳香產(chǎn)品的研究進(jìn)展

朱 坤，孔 婧，榮蘭新，劉士琦，肖冬光，于愛群

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

從代謝工程概念的首次提出到現(xiàn)在的30年左右的時(shí)間里，在分子生物學(xué)、基因組學(xué)、生物化學(xué)和基因工程等相關(guān)學(xué)科和技術(shù)的推動(dòng)下，經(jīng)過幾代人的努力，目前代謝工程已經(jīng)形成了一套比較完備的理論體系和技術(shù)方法?，F(xiàn)階段，代謝工程技術(shù)的基本路線就是首先利用先進(jìn)的生物理論和技術(shù)對(duì)細(xì)胞的代謝途徑及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析并提出合理的設(shè)計(jì)策略，再結(jié)合基因重組技術(shù)對(duì)相關(guān)途徑和網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行修飾、改造、擴(kuò)展或者引入，從而實(shí)現(xiàn)改變細(xì)胞特性或者提高特定代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的目的。

近年來，越來越多的科研人員投身于利用代謝工程技術(shù)構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠的研究工作。所謂的微生物細(xì)胞工廠如同一般意義上的工廠一樣[1]，由微生物細(xì)胞作為制造產(chǎn)品的生產(chǎn)廠房，代謝通路擔(dān)任生產(chǎn)線，培養(yǎng)基提供生產(chǎn)原料和動(dòng)力來源，而細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的反饋和調(diào)控機(jī)制則是生產(chǎn)管理系統(tǒng)，工廠內(nèi)各個(gè)部門之間密切配合，最終目的是實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)品產(chǎn)量的最大化。這其中最熱門的研究就是利用代謝工程技術(shù)在不同微生物底盤中成功構(gòu)建了包括單萜及其衍生物在內(nèi)的多種植物天然產(chǎn)物的生物合成途徑，如檸檬烯、紫蘇醇、香葉醇、芳樟醇等。

單萜類植物天然產(chǎn)物是一類從植物體內(nèi)分離出來的次生代謝產(chǎn)物，由兩個(gè)異戊二烯骨架結(jié)構(gòu)單位組成[2]，具有豐富的藥理學(xué)或生物學(xué)活性，廣泛應(yīng)用于食品、飲料、化妝品和醫(yī)藥工業(yè)中，其市場(chǎng)需求也日益增長(zhǎng)。例如，檸檬烯就是一種典型的天然活性單萜物質(zhì)，分子式為C10H16，屬于單環(huán)單萜。它很早就被國(guó)際權(quán)威組織認(rèn)定為“公認(rèn)安全”（generally regarded as safe，GRAS）化合物，作為前體物可以轉(zhuǎn)化合成多種高附加值的藥物和香精化學(xué)品[3-4]。氫化后的檸檬烯由于凝固點(diǎn)較低而且不溶于水，在低溫條件下作為添加劑能夠有效改善燃料的性能[5]，因此在能源領(lǐng)域也有很大的發(fā)展?jié)摿?。作為檸檬烯衍生物的紫蘇醇、香葉醇是很好的香精原料，目前已被廣泛應(yīng)用于配制食品和日用產(chǎn)品；除此之外，這兩種物質(zhì)都有著非常出色的藥理功效，如紫蘇醇入藥可以抑制癌細(xì)胞的遷移，逆轉(zhuǎn)人體內(nèi)已形成的腫瘤[6]，而香葉醇作為抗炎劑在治療炎癥方面療效顯著[7]。另一種檸檬烯衍生物芳樟醇幾乎每年都居于香料消費(fèi)名單的榜首，實(shí)驗(yàn)表明芳樟醇也具有抑制細(xì)菌、真菌、病毒等微生物的活性[8-9]，并且還具備緩解壓力、提高睡眠質(zhì)量等功效[10]。

迄今為止，人們獲取活性植物天然產(chǎn)物的主要方法是植物提取分離法和有機(jī)合成法[11]，但植物提取分離法存在植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、產(chǎn)物提取難度大和效率低等問題，而化學(xué)合成法也存在著嚴(yán)重依賴化石燃料、反應(yīng)效率低以及極易造成環(huán)境污染等缺點(diǎn)。近年來，隨著代謝工程等相關(guān)技術(shù)取得了一系列的突破性發(fā)展，利用微生物細(xì)胞工廠異源合成植物天然產(chǎn)物有望成為替代植物提取分離法和化學(xué)合成法的一種有效策略。從環(huán)保和生態(tài)的角度來看，微生物合成法具有節(jié)約成本、減少環(huán)境污染等優(yōu)勢(shì)，因此是建設(shè)節(jié)約型社會(huì)，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的綠色生產(chǎn)方式，發(fā)展前景廣闊。本文綜述了近年來在不同的微生物底盤細(xì)胞中利用代謝工程技術(shù)構(gòu)建細(xì)胞工廠從而生物合成一些單萜類植物天然產(chǎn)物方面的研究進(jìn)展，并討論了該方法目前所面臨的瓶頸問題及其可能的解決措施，以期為在微生物細(xì)胞工廠中實(shí)現(xiàn)單萜類化合物的規(guī)模化、效益化工業(yè)生產(chǎn)提供可能的理論依據(jù)。

1 在微生物底盤中所構(gòu)建的單萜化合物異源合成途徑

大多數(shù)微生物細(xì)胞本身并不具備合成單萜類植物天然產(chǎn)物的能力，研究人員利用代謝工程技術(shù)手段通過引入部分或完整代謝途徑的方法重構(gòu)了微生物的代謝網(wǎng)絡(luò)，在不同微生物底盤中成功構(gòu)建了單萜類化合物的異源合成途徑（圖1）。為了便于研究，大多數(shù)研究者會(huì)把單萜類化合物在微生物底盤中的合成過程分成三個(gè)模塊：首先，由自然界中兩種代謝路徑合成植物單萜的共同前體物異戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）；隨后，在單萜生物合成途徑中關(guān)鍵酶——香葉基二磷酸合酶（geranyl diphosphate synthase，GPPS）的催化下，1分子IPP和1分子DMAPP合成直接前體香葉基焦磷酸（geranyl diphosphate，GPP）；最后，GPP在一系列單萜合酶作用下生成各種單萜類化合物[11]。其中，IPP和DMAPP互為同分異構(gòu)體，合成這兩種物質(zhì)的天然生物合成途徑有兩種，分別為甲羥戊酸（mevalonate，MVA）途徑和甲基赤蘚醇磷酸（methylerythritol phosphate，MEP）途徑。MVA途徑和MEP途徑在合成場(chǎng)所、合成原料和途徑酶等方面均存在明顯差異：MEP途徑主要存在于原核生物和植物的質(zhì)體中，它以丙酮酸（pyruvate）和3-磷酸甘油醛（glyceraldehyde-3-phosphate，G3P）為合成原料，關(guān)鍵限速途徑酶包括1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase，DXS）、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（1-deoxy-Dxylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）、4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸合酶（4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate synthase，HDS）和4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸還原酶（4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase，HDR）等[12-13]；MVA途徑則主要存在于真核生物細(xì)胞質(zhì)中，它以乙酰輔酶A（acetyl-CoA）為合成原料，關(guān)鍵限速酶為乙酰乙酰輔酶A硫解酶（acetoacetyl-CoA thiolase，AACT）、羥甲基戊二酰乙酰輔酶A合酶（hydroxymethylglutaryl-CoA synthase，HMGS）、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（hydroxymethylglutaryl-CoA reductase，HMGR）、甲羥戊酸激酶（mevalonate kinase，MK）和磷酸甲羥戊酸激酶（phosphomevalonate kinase，PMK）等[14]。盡管這兩種代謝途徑的合成邏輯完全不同，但是合成過程中卻都產(chǎn)生了IPP、DMAPP、GPP這樣的末端產(chǎn)物，并且都是通過中間產(chǎn)物交換和反饋調(diào)節(jié)作用來對(duì)微生物代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)控，甚至在合成某些代謝物時(shí)彼此之間還會(huì)發(fā)生協(xié)同作用[15]。這些發(fā)現(xiàn)極大地激發(fā)了研究人員的探索興趣，一方面驅(qū)使研究者去探尋是否在自然界中存在一條甚至多條有著更高生產(chǎn)效率的單萜類產(chǎn)物合成途徑，另一方面啟迪研究者通過合成生物學(xué)的手段去構(gòu)建全新的非天然代謝途徑來合成單萜類產(chǎn)物，為未來徹底解除限制目的產(chǎn)品高產(chǎn)的代謝瓶頸提供了更多的可能。

圖1 微生物單萜及其衍生物的生物合成途徑Fig.1 Overview of the biosynthetic pathway of monoterpenes and their derivatives in microorganisms

2 代謝工程改造微生物合成單萜芳香產(chǎn)品的策略及應(yīng)用實(shí)例

2.1 代謝工程改造思路

近年來，通過利用代謝工程技術(shù)對(duì)特定微生物的代謝途徑進(jìn)行改造，研究者們已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了多種單萜芳香產(chǎn)品的微生物異源合成（表1）。代謝工程中的具體調(diào)控方式有很多種，大致可分為轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平和蛋白質(zhì)水平上的調(diào)控等。經(jīng)過一代又一代科研工作者的努力，目前代謝工程改造過程中所使用到的技術(shù)和方法已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步和突破。但目前在利用微生物合成單萜芳香產(chǎn)品的研究工作中，主要采用的還是強(qiáng)化目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑中代謝通量的思路來對(duì)微生物底盤細(xì)胞進(jìn)行改造，以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的提高（表1），具體改造思路總結(jié)如下：

2.1.1 過表達(dá)關(guān)鍵酶基因 目前的研究結(jié)果基本能夠確定單萜類產(chǎn)物合成的前體物GPP就是MVA途徑的主要限速瓶頸，因此實(shí)現(xiàn)前體底物GPP的充足供應(yīng)是提高單萜芳香產(chǎn)品產(chǎn)量的關(guān)鍵，而過表達(dá)MVA途徑中的關(guān)鍵酶基因則是提高合成途徑代謝通量的重要手段和方法。

羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）是MVA途徑中的關(guān)鍵限速酶之一，其催化HMG-CoA生成甲羥戊酸的生化反應(yīng)的強(qiáng)弱是決定微生物細(xì)胞內(nèi)GPP產(chǎn)量的重要因素之一。華東理工大學(xué)花強(qiáng)團(tuán)隊(duì)[16]首先在解脂耶氏酵母產(chǎn)芳樟醇工程菌株中單基因過表達(dá)HMGR的編碼基因HMG1，芳樟醇的產(chǎn)量與初始菌株相比顯著增加，達(dá)到了0.52 mg/L。為了進(jìn)一步促進(jìn)產(chǎn)物的合成，該團(tuán)隊(duì)研究人員緊接著探討了HMG1基因與MVA途徑中磷酸甲羥戊酸激酶基因ERG8、乙酰乙酰輔酶A硫解酶基因ERG10、甲羥戊酸激酶基因ERG12或甲羥戊酸二磷酸脫羧酶基因ERG19組合表達(dá)時(shí)對(duì)芳樟醇產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)過表達(dá)HMG1的菌株相比，各基因組合過表達(dá)菌株合成芳樟醇的產(chǎn)量有了進(jìn)一步的增加，其中共過表達(dá)HMG1和ERG12的工程菌株合成芳樟醇的能力最強(qiáng)，產(chǎn)量提升至0.84 mg/L。

表1 微生物單萜及其衍生物的產(chǎn)量和相關(guān)的途徑改造策略Table 1 The production of monoterpenes and the related engineering strategies in microorganisms

由IDI1基因編碼的異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶能夠催化IPP異構(gòu)化為DMAPP，并調(diào)整GPP和法尼基焦磷酸（Farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP）的通量分布，在GPP合成途徑中也具有重要的意義。華東理工大學(xué)花強(qiáng)團(tuán)隊(duì)[16]在解脂耶氏酵母產(chǎn)芳樟醇工程菌株中引入3個(gè)拷貝的IDI1基因，芳樟醇產(chǎn)量為0.75 mg/L；當(dāng)共過表達(dá)HMG1和IDI1基因時(shí)，芳樟醇產(chǎn)量提高至1.44 mg/L，幾乎是對(duì)照菌株的16倍，是單獨(dú)過表達(dá)HMG1菌株的2.8倍。

天津科技大學(xué)于愛群團(tuán)隊(duì)[17]同樣在解脂耶氏酵母產(chǎn)檸檬烯工程菌株中采用相似的策略，分別單基因過表達(dá)MVA通路中涉及到的十個(gè)酶的編碼基因ACOAAT1、ACOAAT2、HMGS、HMGR、MK、PMK、PMVADO、IPPDI、GGPPS和FPPS，其中單基因過表達(dá)HMGR基因的菌株合成D型和L型檸檬烯的產(chǎn)量最高，分別達(dá)到0.256和0.316 mg/L，該研究確定了檸檬烯合成過程中的關(guān)鍵限速酶為HMGR。

2.1.2 關(guān)鍵酶的改造和調(diào)控 單萜產(chǎn)量的最大化由單位菌體生產(chǎn)能力和菌體總量決定，通過對(duì)關(guān)鍵酶蛋白進(jìn)行直接改造和調(diào)控的方式來提高關(guān)鍵酶的活性可有效解除MVA途徑中的關(guān)鍵酶限速步驟，從而提高單位菌體的生產(chǎn)能力。該方法也有利于避免由基因過表達(dá)對(duì)細(xì)胞所產(chǎn)生的代謝負(fù)擔(dān)。

微生物中缺乏特異性的GPPS，在法尼基焦磷酸合酶（ERG20）催化IPP和DMAPP生成GPP的反應(yīng)過程中，它會(huì)再次以GPP為底物生成FPP，這也是造成在微生物細(xì)胞中合成單萜類化合物的直接前體GPP供給不足的主要原因。華東理工大學(xué)花強(qiáng)團(tuán)隊(duì)[16]在解脂耶氏酵母初始菌株中引入ERG20F88W-N119W基因，造成了ERG20的氨基酸殘基發(fā)生了突變，從而改變了GPP和FPP通量的分布，大大提高了GPP的積累量。與對(duì)照菌株相比，以改造后的工程菌株作為出發(fā)平臺(tái)，其異源合成芳樟醇的產(chǎn)量大大提升。浙江大學(xué)葉麗丹團(tuán)隊(duì)[18]通過對(duì)F96W、N127W和K197G這三個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行組合誘變以進(jìn)一步改變了ERG20的底物選擇性，結(jié)果表明在線粒體和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)改造型ERG20F96W-N127W基因的釀酒酵母工程菌株合成芳樟醇的產(chǎn)量最高，達(dá)到2.69 mg/L，與表達(dá)野生型ERG20基因的菌株相比增加了2倍。

GPPS和檸檬烯合酶（limonene synthesis，LS）的N端都含有一段靶向序列，對(duì)這段靶向序列進(jìn)行的截短修飾有利于提高酶的催化活性[19]。美國(guó)勞倫斯伯克利國(guó)家實(shí)驗(yàn)室Taek Soon Lee團(tuán)隊(duì)[20]在大腸桿菌中構(gòu)建出L-檸檬烯的合成途徑后，通過對(duì)GPPS和LS這兩種酶進(jìn)行截短優(yōu)化，使得L-檸檬烯的產(chǎn)量從2 mg/L提升到了約40 mg/L。其次，使用強(qiáng)啟動(dòng)子提高M(jìn)K和PMK的表達(dá)水平，并用來自金黃色葡萄球菌的HMGS和HMGR來替換大腸桿菌的內(nèi)源酶，L-檸檬烯的產(chǎn)量從2 mg/L提升到了70 mg/L。最后，結(jié)合使用上述兩種策略，L-檸檬烯的產(chǎn)量從2 mg/L又提升到了335 mg/L。

天津大學(xué)元英進(jìn)團(tuán)隊(duì)[2]在改造釀酒酵母菌株生產(chǎn)香葉醇的過程中依托計(jì)算機(jī)應(yīng)用軟件去認(rèn)識(shí)和理解關(guān)鍵酶的結(jié)構(gòu)，通過理性設(shè)計(jì)達(dá)到了對(duì)酶進(jìn)化和修飾的目的。首先基于計(jì)算機(jī)對(duì)導(dǎo)肽結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果，在香葉醇合酶（CrGES）N端4個(gè)不同的位置（S14、L28、S43和S52）分別進(jìn)行截?cái)啵⑼ㄟ^建模分析發(fā)現(xiàn)在S43處去除導(dǎo)肽序列的香葉醇合成酶（t3CrGES）的二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性比其余3種酶更高，結(jié)果表明t3CrGES截短型菌株合成香葉醇的產(chǎn)量最高，達(dá)到191.61 mg/L，是未截短型菌株的4.45倍，說明了導(dǎo)肽和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性對(duì)酶活性有重大影響。之后在蛋白質(zhì)相互作用理論的指導(dǎo)下，用短柔性連接體GSG（微蛋白支架）分別從正向和反向兩個(gè)角度來連接法尼基焦磷酸合酶ERG20F96W-N127W和t3CrGES以產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)，使得兩種酶表現(xiàn)出更高的催化活性并減少了中間產(chǎn)物的損耗，結(jié)果表明組合型為t3CrGES-ERG20F96W-N127W+ERG20F96W-N127W的菌株合成香葉醇的產(chǎn)量最高，達(dá)到523.96 mg/L，體現(xiàn)出在合成途徑中縮短多個(gè)酶的空間距離，能夠有效地提高酶的催化反應(yīng)效率。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果體現(xiàn)出了酶工程作為關(guān)鍵方法改造微生物底盤合成單萜類產(chǎn)物的重要性，對(duì)進(jìn)一步提高香葉醇產(chǎn)量很有指導(dǎo)意義。

2.1.3 區(qū)室化工程 在酵母亞細(xì)胞域細(xì)胞質(zhì)內(nèi)采用組合共表達(dá)MVA途徑中的途徑基因、突變關(guān)鍵酶ERG20的基因位點(diǎn)，以及對(duì)關(guān)鍵酶進(jìn)行融合表達(dá)（如利用蛋白支架連接）等方法目前已經(jīng)成為了代謝工程改造微生物異源合成單萜芳香產(chǎn)品研究中比較常態(tài)化的策略，而把異源途徑轉(zhuǎn)移到微生物其它亞細(xì)胞區(qū)室中的報(bào)道卻很少看到。浙江大學(xué)葉麗丹團(tuán)隊(duì)[18]在釀酒酵母不同亞細(xì)胞區(qū)室（如線粒體和細(xì)胞質(zhì)）中構(gòu)建了雙重MVA代謝途徑，在雙向GAL1/GAL10啟動(dòng)子的作用下，以單順反子形式在線粒體和細(xì)胞質(zhì)中同時(shí)表達(dá)芳樟醇合酶（linalool synthase，LIS）基因和ERG20F96W-N127W基因，合成芳樟醇的產(chǎn)量達(dá)到7.61mg/L，與僅在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)MVA途徑相比，芳樟醇的產(chǎn)量得到明顯提升，這種區(qū)室化工程策略為今后芳樟醇和其它單萜類化合物的高水平生產(chǎn)提供了較好的思路。

2.2 發(fā)酵優(yōu)化策略

根據(jù)微生物在生長(zhǎng)繁殖過程中對(duì)外界環(huán)境的要求，對(duì)微生物的發(fā)酵條件和營(yíng)養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，能夠有效提高其細(xì)胞生長(zhǎng)速率和代謝產(chǎn)物合成速率，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)利用微生物生產(chǎn)更多特定代謝產(chǎn)物的目標(biāo)。在經(jīng)代謝工程改造后能夠異源合成單萜芳香產(chǎn)品的菌株中，原有的代謝途徑及調(diào)控機(jī)制已被改變，此時(shí)的發(fā)酵優(yōu)化就顯得尤為重要。

2.2.1 優(yōu)化發(fā)酵條件 天津科技大學(xué)于愛群團(tuán)隊(duì)[17]利用代謝工程技術(shù)改造解脂耶氏酵母異源生產(chǎn)檸檬烯后，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了鎂離子對(duì)解脂耶氏酵母工程菌株合成檸檬烯的促進(jìn)作用，并利用單因素實(shí)驗(yàn)法（溫度、pH、轉(zhuǎn)速、初始細(xì)胞密度、添加劑）對(duì)工程菌株進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化試驗(yàn)，確定了最佳的工藝條件：發(fā)酵溫度20 ℃，轉(zhuǎn)速250 r/min，初始OD600=2.0，pH 5.74和培養(yǎng)基體積50 mL（250 mL搖瓶中），正十二烷體積10%，培養(yǎng)時(shí)間5 d，MgSO4·7H2O濃度0.2%。實(shí)驗(yàn)過程中獲得的D-檸檬烯和L-檸檬烯的最高產(chǎn)量分別達(dá)到11.705 和11.088 mg/L。

中科院青島生物能源與過程研究所咸謨和劉會(huì)洲團(tuán)隊(duì)[21]從優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)方式和培養(yǎng)環(huán)境入手來提升大腸桿菌工程菌株的生產(chǎn)性能，進(jìn)而提高香葉醇的產(chǎn)量：a.對(duì)大腸桿菌工程菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)（OD600=2），48 h后產(chǎn)量達(dá)到68.6 mg/L；另外對(duì)該菌株進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)5 h，產(chǎn)量提高到78.8 mg/L。b. 在沒有葡萄糖的情況下，大腸桿菌細(xì)胞會(huì)重復(fù)利用醋酸鹽，從而促進(jìn)乙酰基酯酶（Acetylesterase，Aes）催化乙酸香葉酯轉(zhuǎn)化生成香葉醇。于是，通過對(duì)大腸桿菌工程菌株采用葡萄糖饑餓策略（在48 h停止葡萄糖供應(yīng)，在葡萄糖不足的條件下繼續(xù)培養(yǎng)）進(jìn)行培養(yǎng)，分批補(bǔ)料發(fā)酵后成功將濃度為1.27 g/L（88.8%）的乙酸香葉酯轉(zhuǎn)化為香葉醇，香葉醇的終產(chǎn)量達(dá)到2.0 g/L。

2.2.2 優(yōu)化培養(yǎng)基碳源 華東理工大學(xué)花強(qiáng)團(tuán)隊(duì)[16]利用解脂耶氏酵母產(chǎn)芳樟醇工程菌株來探究葡萄糖、甘油、果糖或檸檬酸（各20 g/L）分別作為單一碳源對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和合成芳樟醇的影響，結(jié)果表明檸檬酸鹽組合成芳樟醇的產(chǎn)量最高，產(chǎn)量和細(xì)胞干重（dry cell weight，DCW）分別達(dá)到2.52 mg/L和356 μg/g。另外還探究了10 g/L檸檬酸鹽與10 g/L葡萄糖、甘油或果糖的混合碳源對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和合成芳樟醇的影響，觀察到檸檬酸鹽和葡萄糖作為混合碳源的細(xì)胞生長(zhǎng)情況最好，而芳樟醇的產(chǎn)量與以20 g/L檸檬酸鹽作為唯一碳源組相比幾乎保持不變。最后，工程菌株在以20 g/L檸檬酸鹽和8 g/L丙酮酸鹽為碳源時(shí)進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)合成芳樟醇的產(chǎn)量最高，達(dá)到了6.96 mg/L（939 μg/g DCW）。

在此基礎(chǔ)上，華東理工大學(xué)花強(qiáng)團(tuán)隊(duì)[22]繼續(xù)對(duì)解脂耶氏酵母工程菌株生產(chǎn)檸檬烯的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，首先探究了8種初始濃度為20 g/L的碳源（甘油、葡萄糖、檸檬酸、果糖、麥芽糖、蔗糖、甘露糖和半乳糖）對(duì)解脂耶氏酵母合成檸檬烯的影響，結(jié)果表明以甘油為碳源時(shí)合成檸檬烯的產(chǎn)量最高，達(dá)到1.74 mg/g DCW。再通過在培養(yǎng)基中添加不同初始濃度（10、20、30、40、50 g/L）的甘油來探究碳源濃度對(duì)解脂耶氏酵母生產(chǎn)檸檬烯的影響，結(jié)果表明，初始濃度為20 g/L的甘油組合成檸檬烯的產(chǎn)量最高，達(dá)到1.47 mg/g DCW；并觀察到隨著甘油初始濃度的升高，檸檬烯產(chǎn)量達(dá)到峰值的時(shí)間點(diǎn)會(huì)出現(xiàn)向后推遲的現(xiàn)象。此外，該團(tuán)隊(duì)還探究了不同初始濃度（0～4 g/L）的檸檬酸鹽、乙酸鹽、丙酮酸鹽和蘋果酸鹽作為輔助碳源對(duì)解脂耶氏酵母生產(chǎn)檸檬烯的影響情況，結(jié)果表明初始濃度為4 g/L的檸檬酸鹽組作為輔助碳源時(shí)合成檸檬烯的產(chǎn)量最高，達(dá)到58.4 mg/L，比對(duì)照組高1.39倍。最后該團(tuán)隊(duì)以甘油作為主要碳源，并補(bǔ)充輔助碳源檸檬酸，在1.5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)，檸檬烯的終產(chǎn)量達(dá)到了165.3 mg/L，這也是目前為止解脂耶氏酵母異源合成檸檬烯的最高產(chǎn)量。

浙江大學(xué)葉麗丹團(tuán)隊(duì)[18]同樣采用分批發(fā)酵培養(yǎng)方式，將釀酒酵母產(chǎn)芳樟醇工程菌株在尿嘧啶缺陷型培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并對(duì)輔助碳源進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明補(bǔ)充輔助碳源對(duì)提高細(xì)胞生產(chǎn)芳樟醇的性能有很大：添加丙酮酸（4 g/L）組芳樟醇的最高產(chǎn)量達(dá)到21.01 mg/L，添加甲羥戊酸內(nèi)酯（70 mg/L）組芳樟醇的最高產(chǎn)量達(dá)到23.45 mg/L。

眾所周知，不同菌體對(duì)原料的利用能力不同，各種原料的利用效率之間也相差很大，并且原材料組分的差異導(dǎo)致各種類型培養(yǎng)基的價(jià)格相去甚遠(yuǎn)，因此在滿足微生物生長(zhǎng)生產(chǎn)要求的前提下，應(yīng)該優(yōu)先選擇價(jià)格低、效果好的培養(yǎng)基。天津科技大學(xué)于愛群團(tuán)隊(duì)[17]探究了不同添加量（0、10%、30%、50%和70%）的廚房廢油替代葡萄糖為唯一碳源對(duì)解脂耶氏酵母工程菌株生產(chǎn)檸檬烯的影響，結(jié)果表明：工程菌株在添加濃度為70%的廚房廢油的培養(yǎng)基中發(fā)酵效果最好，D型和L型檸檬烯的產(chǎn)量分別達(dá)到2.514 和2.723 mg/L，比初始產(chǎn)量提高了20倍，這一研究成果也為今后利用微生物轉(zhuǎn)化廉價(jià)碳源合成高附加值產(chǎn)品的研究帶來了希望。

2.3 產(chǎn)物分離方法

隨著微生物細(xì)胞中生化反應(yīng)的進(jìn)行，微生物生長(zhǎng)環(huán)境中代謝產(chǎn)物的濃度會(huì)不斷升高，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害或者代謝負(fù)擔(dān)[24-25]，最終導(dǎo)致單萜產(chǎn)品的產(chǎn)量和細(xì)胞生物量之間呈現(xiàn)反比例關(guān)系。在微生物發(fā)酵工程中，對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行有效、及時(shí)地分離可有助于解決該問題。

中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所咸謨和劉會(huì)洲團(tuán)隊(duì)[21]對(duì)大腸桿菌產(chǎn)香葉醇工程菌株進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，向生產(chǎn)系統(tǒng)中加入香葉醇標(biāo)準(zhǔn)品，在發(fā)酵過程的前5個(gè)小時(shí)內(nèi)，生產(chǎn)系統(tǒng)因揮發(fā)作用損失了81.4%的香葉醇。該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)向生產(chǎn)系統(tǒng)中添加十四酸異丙酯形成的水、有機(jī)兩相系統(tǒng)可有效防止目標(biāo)產(chǎn)物的揮發(fā)，也同時(shí)降低了目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的毒性，產(chǎn)物產(chǎn)量大大提升。

荷蘭瓦赫寧根大學(xué)植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室的Harro Bouwmeester團(tuán)隊(duì)和荷蘭瓦赫寧根國(guó)際植物研究中心的Jules Beekwilder團(tuán)隊(duì)[23]利用酵母菌ERG20基因突變株AE9K197G探索在培養(yǎng)系統(tǒng)中（1.7 g/L酵母氮基（不含氨基酸）、5 g/L（NH4）2SO4、20 g/L D-葡萄糖、20 g/L瓊脂）捕獲目標(biāo)產(chǎn)物檸檬烯的有效手段，比較了包括戊烷萃取、固相微萃取、十二烷覆蓋萃取、特殊吸收器吸收在內(nèi)的四種不同的捕獲方法，證明了在微生物發(fā)酵系統(tǒng)中同步采取捕獲產(chǎn)品的措施可有效地將檸檬烯提取出來，并且獲得的產(chǎn)品與基于植物的提取系統(tǒng)相比更加穩(wěn)定、也達(dá)到了食品級(jí)的要求。該研究成果也展現(xiàn)了利用微生物合成法生產(chǎn)揮發(fā)性單萜芳香產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)。

美國(guó)勞倫斯伯克利國(guó)家實(shí)驗(yàn)室Taek Soon Lee團(tuán)隊(duì)[20]以大腸桿菌產(chǎn)紫蘇醇工程菌株為研究對(duì)象，探究了基于陰離子交換樹脂的原位產(chǎn)品回收方法對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物紫蘇醇生產(chǎn)的影響，發(fā)現(xiàn)了樹脂Amberlite IRA 410 Cl（A）能夠特異性捕獲紫蘇醇，也最大限度地提高了工程菌株的生產(chǎn)能力，使得紫蘇醇的終產(chǎn)量達(dá)到105 mg/L。但該樹脂的添加也會(huì)引起細(xì)胞毒性或機(jī)械應(yīng)力從而降低細(xì)胞密度。

3 結(jié)論與展望

綜上所述，本文從代謝工程改造思路、發(fā)酵優(yōu)化策略及產(chǎn)物分離方法等角度出發(fā)綜述了利用代謝工程技術(shù)改造不同微生物宿主合成天然單萜芳香產(chǎn)品的研究進(jìn)展。從目前報(bào)道的結(jié)果來看，利用代謝工程改造策略來優(yōu)化或改變微生物宿主已有的代謝和表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，有助于大大提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量?？傊ㄟ^代謝工程手段所構(gòu)建的能夠合成單萜芳香產(chǎn)品的微生物細(xì)胞工廠為這一重要植物天然產(chǎn)物的綠色生產(chǎn)提供了一條新路線。

但是，目前利用代謝工程技術(shù)改造微生物直接發(fā)酵生產(chǎn)各類單萜芳香產(chǎn)品的研究還面臨諸多挑戰(zhàn)，主要包括：a. 所用微生物底盤的不同對(duì)目的產(chǎn)物的終產(chǎn)量是有明顯影響的，而目前的研究還主要局限于大腸桿菌、釀酒酵母和解脂耶氏酵母中（表1）；b. 相關(guān)產(chǎn)物在這幾種微生物底盤中的產(chǎn)量基本都是毫克級(jí)（表1），還很難滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)際要求。因此，在這一背景下，為了構(gòu)建更高效合成單萜芳香產(chǎn)品的微生物細(xì)胞工廠并最終實(shí)現(xiàn)其綠色制造，亟需深入探究影響不同微生物底盤高效生產(chǎn)特定目標(biāo)產(chǎn)物的關(guān)鍵機(jī)制及核心問題。要進(jìn)一步明確不同微生物底盤中合成單萜芳香產(chǎn)品的關(guān)鍵控制節(jié)點(diǎn)和與之相對(duì)應(yīng)的控制策略，應(yīng)從以下幾個(gè)層面入手：

3.1 培養(yǎng)基方面

眾所周知，培養(yǎng)基是由人工配制的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，是微生物各種生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。不同微生物底盤對(duì)各種培養(yǎng)基原料的利用能力和效率之間相差很大，因此培養(yǎng)基成分是決定微生物底盤合成目標(biāo)產(chǎn)物（尤其是異源產(chǎn)物）能力高低的重要因素之一。例如，之前的研究已經(jīng)證實(shí)了在YPD培養(yǎng)基中添加適量鎂離子能夠提高解脂耶氏酵母D-檸檬烯合酶（dlimonene synthase，DLS）和L-檸檬烯合酶（l-limonene synthase，LLS）的催化活性同時(shí)提高檸檬烯的產(chǎn)量[17]；在YPD培養(yǎng)基中補(bǔ)充適量丙酮酸有利于增加釀酒酵母的菌體濃度同時(shí)提高芳樟醇的產(chǎn)量[18]。因此，為了獲得更高的目標(biāo)產(chǎn)品產(chǎn)量，從培養(yǎng)基方面可以從進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基成分和篩選產(chǎn)品合成途徑中相關(guān)限速酶激活劑兩方面著手。

3.2 底盤細(xì)胞方面

底盤細(xì)胞是各種生化反應(yīng)發(fā)生的直接場(chǎng)所，因此它的重要地位不言而喻。近些年，依托基因測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的高速發(fā)展，對(duì)各種微生物底盤細(xì)胞自身特征的認(rèn)識(shí)已經(jīng)取得了很大突破。例如，研究者對(duì)作為原核模式微生物代表的大腸桿菌的生理和代謝特征了解最為充分，應(yīng)用最為廣泛，其生產(chǎn)的許多轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品也已經(jīng)取得了商業(yè)化。雖然在包涵體形成以及蛋白翻譯后修飾等方面存在缺陷，但憑借遺傳背景清晰、易培養(yǎng)、遺傳操作性強(qiáng)、異源蛋白產(chǎn)量高等特點(diǎn)，大腸桿菌往往成為代謝工程中底盤細(xì)胞的首選[26-27]。對(duì)于單萜芳香產(chǎn)品來說，相比釀酒酵母和解脂耶氏酵母，目前大腸桿菌底盤中相關(guān)產(chǎn)物（檸檬烯和香葉醇）的產(chǎn)量也是更高的，顯示出很好的應(yīng)用前景。

與大腸桿菌相比，真核模式微生物釀酒酵母具有遺傳穩(wěn)定性更高（如能夠在基因組中同時(shí)插入多個(gè)外源基因片段）、表達(dá)真核來源功能蛋白（如植物源細(xì)胞色素P450酶和單萜合酶）的能力更強(qiáng)[28]等特點(diǎn)。此外，釀酒酵母本身就具有催化產(chǎn)生單萜芳香產(chǎn)品合成所需前體物GPP的MVA途徑。因此，釀酒酵母成為了異源合成單萜芳香產(chǎn)品的理想微生物底盤。

解脂耶氏酵母是一種新型的非模式微生物底盤細(xì)胞。相比于釀酒酵母，它具有更適合高密度發(fā)酵、碳源譜范圍更廣泛以及對(duì)惡劣生長(zhǎng)環(huán)境的適應(yīng)度更高等特點(diǎn)，使得該酵母在工業(yè)領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用前景[29-30]。另外，解脂耶氏酵母已經(jīng)具有了MVA途徑，且作為產(chǎn)油酵母其胞內(nèi)乙酰輔酶A的積累量較高；因此在生產(chǎn)單萜芳香產(chǎn)品方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用前景同樣廣闊。然而由于對(duì)解脂耶氏酵母的研究及應(yīng)用起步較晚，因此目前尚未完全掌握該底盤細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控等分子機(jī)制，遺傳操作系統(tǒng)也迄待完善。

總之，目前利用代謝工程技術(shù)生產(chǎn)各類單萜芳香產(chǎn)品的研究還主要集中在大腸桿菌、釀酒酵母和解脂耶氏酵母這幾種微生物底盤中。值得關(guān)注的是，依托基因測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的高速發(fā)展，近年來對(duì)許多非模式微生物底盤細(xì)胞（如藍(lán)細(xì)菌[31-32]等）特征的認(rèn)識(shí)已經(jīng)取得了很大的突破，再加上CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)的不斷完善，有利于研究者為單萜芳香產(chǎn)品的微生物合成發(fā)掘新的、更有工業(yè)應(yīng)用前景的非模式微生物底盤細(xì)胞，并找到不同產(chǎn)物與微生物底盤之間的最大兼容性。另外，利用合成生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建微生物基因組精簡(jiǎn)優(yōu)化的底盤細(xì)胞[33]也有望成為提高單萜芳香產(chǎn)品產(chǎn)量的重要策略。

3.3 代謝工程策略方面

從之前的研究結(jié)果來看，利用適宜的代謝工程策略來增大代謝網(wǎng)絡(luò)中通向目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑的代謝流有利于提高單萜芳香產(chǎn)品的產(chǎn)量。但是，目前仍然存在很多挑戰(zhàn)，比如：a. MVA途徑自身的代謝通量過低；b. MVA途徑中存在有多個(gè)分支代謝途徑；c.中間體和產(chǎn)物的積累會(huì)造成嚴(yán)重的代謝負(fù)擔(dān)以及毒害作用；d.對(duì)某些微生物底盤生理和代謝機(jī)制的認(rèn)知還不夠充分；e.無法真正意義上對(duì)微生物底盤的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)控和實(shí)現(xiàn)目標(biāo)代謝通量的最大化。因此，很多研究者認(rèn)為可以把單萜芳香產(chǎn)品代謝工程的優(yōu)化工作分成上、中、下游三個(gè)模塊來分別進(jìn)行[34]：a.增加起始物質(zhì)——乙酰輔酶A、丙酮酸和3-磷酸甘油的供應(yīng)量[35-37]；b.強(qiáng)化直接前體物GPP合成途徑的代謝流[38-39]；c.敲除或弱化直接前體物GPP的競(jìng)爭(zhēng)性途徑[18]。

目前的研究結(jié)果表明，GPP的供應(yīng)不足可能是造成單萜芳香產(chǎn)品合成量不高的主要限速瓶頸，因此實(shí)現(xiàn)GPP的充足供應(yīng)是提高目標(biāo)產(chǎn)品產(chǎn)量的重中之重。另外，單萜芳香產(chǎn)品合成后存在的內(nèi)源性轉(zhuǎn)化現(xiàn)象也是導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)量無法大幅度提升的重要因素[23]。另外，研究者需要利用更理性全面的策略（如系統(tǒng)生物學(xué)）和更先進(jìn)的技術(shù)和方法（如合成生物學(xué)）來深入探究影響不同微生物底盤高效生產(chǎn)特定目標(biāo)產(chǎn)物的限速步驟、關(guān)鍵機(jī)制及核心問題。只有明確了關(guān)鍵限制因素，才能找準(zhǔn)目標(biāo)、有的放矢，最終實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量、產(chǎn)率的大幅度提高。

3.4 代謝產(chǎn)物耐受性方面

隨著產(chǎn)物的不斷積累，微生物生長(zhǎng)環(huán)境中單萜芳香產(chǎn)品的濃度不斷升高，就產(chǎn)生了對(duì)微生物底盤細(xì)胞的毒害作用。單萜芳香產(chǎn)品對(duì)微生物細(xì)胞造成毒害的機(jī)制非常復(fù)雜，目前已知的主要原因是單萜物質(zhì)引起了微生物細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜等結(jié)構(gòu)的破壞[40-41]；降低了細(xì)胞內(nèi)某些酶的活性；并阻礙了細(xì)胞生理活動(dòng)的正常進(jìn)行，最終導(dǎo)致微生物死亡。以下策略可以提高微生物底盤對(duì)代謝產(chǎn)物的耐受性問題：a.利用誘變育種或適應(yīng)性進(jìn)化等技術(shù)篩選出耐受性更強(qiáng)的菌株作為出發(fā)的底盤細(xì)胞；b.首先利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)等方法探索微生物耐受單萜物質(zhì)的機(jī)制，然后采用分子育種手段（比如引入特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）來提高微生物底盤細(xì)胞對(duì)單萜產(chǎn)物的耐受性；c.采用萃取、樹脂吸收或膜過濾等分離技術(shù)及時(shí)地把單萜產(chǎn)物從培養(yǎng)環(huán)境中分離出來，實(shí)現(xiàn)“邊產(chǎn)生邊分離”，阻止毒害現(xiàn)象的發(fā)生。

最后，利用構(gòu)建多種微生物底盤細(xì)胞組成的混合發(fā)酵系統(tǒng)[42-43]以及無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)[44]等策略來突破現(xiàn)有的一些限制性因素，從而提高代謝工程設(shè)計(jì)和改造的效率，也有助于提高利用微生物細(xì)胞工廠合成單萜芳香產(chǎn)品的生產(chǎn)水平。