宋 琦,李 艷,徐志鵬,杜召輝,姜 海,邱兆磊,王振杰*

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診外科,蚌埠 233000;2蚌埠市第三人民醫(yī)院五官科;*通訊作者,E-mail:ahbyfywzj@163.com)

創(chuàng)傷失血性休克(traumatic hemorrhagic shock,THS)是急診外科常見的急危重癥,也是導(dǎo)致相關(guān)病人死亡的重要原因。研究發(fā)現(xiàn),早期未控制失血而繼發(fā)的一系列失控性炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)是引起其高死亡率的主要原因之一[1,2]。創(chuàng)傷失血性休克導(dǎo)致大量的炎性因子釋放諸如IL-1、IL-6、TNF-α等,如何早期控制失血、改善微循環(huán)、抑制炎癥過度釋放,阻斷SIRS和MODS的發(fā)生是創(chuàng)傷失血性休克研究的熱點(diǎn)[3,4]。肝臟是人體對(duì)THS協(xié)調(diào)反應(yīng)的重要器官之一,肝衰竭是MODS的一個(gè)重要組成部分[5]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的激活是THS過程中介導(dǎo)MODS的重要一步。c-Jun N末端蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)屬于MAPK家族,是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,JNK信號(hào)通路在肝損傷中起著重要調(diào)節(jié)作用[6]。醋酸鈉林格液被稱為液體復(fù)蘇“第一線”晶體液[7],使用醋酸鈉林格液行限制性液體復(fù)蘇時(shí)能夠明顯抑制肝肺組織炎癥因子的釋放[8],但其減輕肝損傷的具體作用機(jī)制尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。醋酸鈉林格液復(fù)蘇是否通過抑制JNK信號(hào)通路的激活來減輕創(chuàng)傷失血性休克時(shí)肝組織的損傷,國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)未見報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察醋酸鈉林格液對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝炎性因子及JNK信號(hào)通路的影響,探討其可能機(jī)制,為臨床THS患者早期液體復(fù)蘇治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取SPF級(jí)SD大鼠(上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供)共32只,雌雄不拘,體質(zhì)量(285±25)g,年齡8-10周。在室溫、濕度及光照均受控的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中飼養(yǎng)7 d,然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)操作均按照“醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南”進(jìn)行,并經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備及試劑

Medlab-u/2cs型生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(南京美易科技有限公司);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、核酸濃度測(cè)定儀、qPCR儀(美國Thermo Fisher);SDS-PAGE電泳系統(tǒng)(美國BIO-Rad);0.9%氯化鈉注射液、乳酸鈉林格氏液(安徽環(huán)球藥業(yè)股份有限公司),醋酸鈉林格液(湖南康源制藥有限公司);SuperScript Ⅲ RT反轉(zhuǎn)錄kit(美國ABI-invitrogen);一抗稀釋液、二抗稀釋液、JNK antibody以及MKP-1 antibody均購于北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司。

1.3 動(dòng)物分組

選取SD大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn),使用隨機(jī)數(shù)字表法分組:休克未復(fù)蘇組(n=8)、生理鹽水組(n=8)、乳酸鈉林格液組(n=8)和醋酸鈉林格液組(n=8)。四組大鼠均制備成休克模型,生理鹽水組、乳酸鈉林格液組及醋酸鈉林格液組于休克后60 min應(yīng)用不同液體進(jìn)行30 min液體復(fù)蘇,復(fù)蘇后觀察4 h,休克未復(fù)蘇組不予復(fù)蘇。生理鹽水組、乳酸鈉林格液組、醋酸鈉林格液組復(fù)蘇后4 h取大鼠肝組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);休克未復(fù)蘇組休克觀察4 h取大鼠肝組織,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 休克復(fù)蘇模型的建立

1.4.1 休克模型建立前準(zhǔn)備 ①麻醉：稱重后，通過大鼠腹腔按照1 ml ∶100 g比例，注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的水合氯醛，并聯(lián)合異氟醚吸入麻醉大鼠。②消毒、鋪巾：麻醉成功后仰臥位固定于恒溫手術(shù)臺(tái)上，雙側(cè)腹股溝區(qū)備皮，并用絡(luò)合碘溶液消毒2-3遍后鋪無菌治療巾。③置管：使用無菌手術(shù)器械解剖游離出雙側(cè)股動(dòng)脈及股靜脈，分別置管、固定，使用2.5%的枸櫞酸鈉葡萄糖進(jìn)行封管。右側(cè)股動(dòng)脈置管連接Medlab-u/2cs生物信號(hào)采集系統(tǒng)，持續(xù)監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈血壓(mean arterial pressure，MAP)，通過左側(cè)股動(dòng)脈放血誘導(dǎo)休克，右側(cè)股靜脈進(jìn)行休克后的液體復(fù)蘇，將微量泵連接至左側(cè)股靜脈。

1.4.2 建立休克復(fù)蘇模型 使用2 ml注射器(已提前以1 ∶10比例預(yù)充2.5%的枸櫞酸鈉葡萄糖0.2 ml),以2 ml/3 min速度由左側(cè)股動(dòng)脈放血,MAP維持在(35±5)mmHg之間,整個(gè)過程持續(xù)20 min。維持MAP在(35±5)mmHg之間60 min,期間可緩慢放血或回輸自體血。分別應(yīng)用對(duì)應(yīng)的復(fù)蘇液體對(duì)生理鹽水組、乳酸鈉林格液組與醋酸鈉林格液組大鼠在30 min內(nèi)完成限制性液體復(fù)蘇。液體輸注量以復(fù)蘇液體量和失血量比例為3 ∶1進(jìn)行,復(fù)蘇后觀察4 h取大鼠肝組織。休克未復(fù)蘇組不予液體復(fù)蘇,觀察4 h取大鼠肝組織(標(biāo)本凍存于-80℃冰箱中)。為彌補(bǔ)手術(shù)區(qū)域及呼吸道液體的丟失,在整個(gè)休克及復(fù)蘇過程中,通過左側(cè)股靜脈輸注生理鹽水5 ml/(kg·h)。

1.5 實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)

1.5.1 肝組織中TNF-α mRNA、IL-4 mRNA、IL-6 mRNA、IL-10 mRNA的表達(dá) 用Trizol法提取肝組織標(biāo)本總RNA,將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,建立擴(kuò)增體系(20 μl),擴(kuò)增引物見表1。擴(kuò)增:按照95 ℃ 2 min預(yù)變性,循環(huán)1次;94 ℃ 20 s變性,60 ℃ 20 s延伸,循環(huán)40次;繪制曲線:72 ℃ 30 s繪制溶解曲線。結(jié)束后讀取Ct值并計(jì)算mRNA的表達(dá),采用2-ΔΔCt法計(jì)算表達(dá)量。

表1 目的基因引物序列

1.5.2 采用Western blot法檢測(cè)JNK磷酸化和MKP-1乙?；牡鞍自诟谓M織中表達(dá) 取約100 mg的凍存肝組織,使用PBS洗滌2次后,于勻漿管壺腹部剪碎,加入RIPA裂解液1 ml,然后放置在冰上進(jìn)行研磨。抽提肝組織蛋白,在4 ℃冷凍離心機(jī)中離心10 min(12 000 r/min),取上清液,對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析和濃度測(cè)定(參照BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒的方法)。將樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。5%脫脂奶粉于搖床上封閉1 h,加入對(duì)應(yīng)的兔抗大鼠多克隆抗體(1 ∶1 000)一抗,4 ℃孵育過夜后,加入與HRP偶聯(lián)的山羊抗兔Ig G(1 ∶5 000)二抗室溫下孵育1 h,用TBST洗滌10 min,共3次,最后放置暗室曝光及顯影定影(采用ECL法),FluorChem灰度分析軟件進(jìn)行分析。目的蛋白相對(duì)表達(dá)=(目的蛋白灰度/β-actin灰度)×100%。

1.5.3 肝組織病理學(xué)檢查 肝組織用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定、石蠟包埋、切片、HE染色,在光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較結(jié)果

休克未復(fù)蘇組、生理鹽水組、乳酸鈉林格液組和醋酸鈉林格液組大鼠體質(zhì)量、基礎(chǔ)平均動(dòng)脈壓經(jīng)單因素方差分析,組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表2)。

表2 四組大鼠體質(zhì)量和基礎(chǔ)平均動(dòng)脈壓比較

2.2 肝組織病理學(xué)改變

在光鏡下觀察:休克未復(fù)蘇組肝細(xì)胞混濁腫脹明顯、胞質(zhì)淡染,可見大量炎性細(xì)胞浸潤,肝竇及肝細(xì)胞間質(zhì)淤血明顯;生理鹽水組和乳酸鈉林格液組較休克未復(fù)蘇組組肝細(xì)胞腫脹減輕,可見較多炎性細(xì)胞浸潤;醋酸鈉林格液組肝細(xì)胞混濁腫脹不明顯,少量炎性細(xì)胞浸潤,肝竇及肝細(xì)胞間質(zhì)無明顯淤血,與生理鹽水組和乳酸鈉林格液組相比,肝損傷及炎性浸潤減輕(見圖1)。

2.3 肝組織TNF-α mRNA、IL-4 mRNA、IL-6 mRNA、IL-10 mRNA的表達(dá)

與休克未復(fù)蘇組、生理鹽水組和乳酸鈉林格液組相比,醋酸鈉林格液組TNF-α mRNA、IL-6 mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.01),IL-4 mRNA和IL-10 mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.01,見表3)。

表3 四組大鼠TNF-α mRNA、IL-4 mRNA、IL-6 mRNA、IL-10 mRNA的表達(dá)

2.4 JNK磷酸化、MKP-1乙?；牡鞍自诟谓M織中的表達(dá)

與休克未復(fù)蘇組、生理鹽水組和乳酸鈉林格液組相比,醋酸鈉林格液組JNK磷酸化的蛋白相對(duì)表達(dá)量減少(P<0.01);MKP-1乙?；谋磉_(dá)增加(P<0.01,見圖2)。

與休克未復(fù)蘇組比較,*P<0.05,**P<0.01;與生理鹽水組和乳酸鈉林格液組比較,#P<0.05,##P<0.01圖2 JNK磷酸化、MKP-1乙?；牡鞍自诟谓M織中的表達(dá)水平Figure 2 Relative expression of JNK phosphorylation protein and MKP-1 acetylation protein in liver tissue of rats in four groups

3 討論

全球每年死于失血性休克的患者約190萬,其中接近80%死于創(chuàng)傷[2]。創(chuàng)傷失血性休克(THS)往往會(huì)引起機(jī)體的有效循環(huán)血量不足、組織灌注減少,進(jìn)而激活體內(nèi)諸如中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞等釋放出大量以白細(xì)胞介素和腫瘤壞死因子(TNF-α)為主的炎癥介質(zhì),導(dǎo)致炎癥微環(huán)境失調(diào),引起全身炎癥反應(yīng)(SIRS),如不及時(shí)干預(yù),最終可能進(jìn)一步發(fā)展為全身多器官功能障礙(MODS),甚至死亡[9]。THS救治理念在于有效改善組織低灌注的同時(shí)能夠減輕機(jī)體炎癥反應(yīng),抑制炎癥的進(jìn)一步發(fā)展,減輕組織臟器的損傷,降低病死率[10]。

肝臟是THS時(shí)最先受累的重要器官之一,約20%的THS患者表現(xiàn)出一定程度的肝功能障礙[11]。肝損傷是SIRS進(jìn)展加快并導(dǎo)致MODS的一個(gè)重要部分,考慮到肝臟在代謝、排泄和體內(nèi)平衡機(jī)制中的作用,肝損傷是直接與機(jī)體損傷加重相關(guān)的臟器,肝細(xì)胞是可再生細(xì)胞,當(dāng)肝臟在嚴(yán)重破壞后,仍有足夠的修復(fù)彈性,因此針對(duì)性的治療可能有效提高休克復(fù)蘇的成功率[5]。相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為,醋酸鈉林格液是失血性休克液體復(fù)蘇的“第一線”晶體液[7],能夠減輕組織損傷,提高失血性休克大鼠存活率,改善凝血功能[12],并且醋酸鈉的代謝很少依賴于肝臟,不會(huì)引肝臟中醋酸的蓄積。本實(shí)驗(yàn)中結(jié)果表明,通過三種液體限制性液體復(fù)蘇創(chuàng)傷失血性休克大鼠模型,醋酸鈉林格液能夠抑制肝臟組織促炎因子TNF-α、IL-6的產(chǎn)生,提高抑炎因子IL-4、IL-10的生成,肝組織病理結(jié)果也顯示了休克未復(fù)蘇組的肝組織損傷明顯,醋酸鈉林格液組相對(duì)于乳酸鈉林格液組及生理鹽水組肝組織炎性浸潤最輕,這與先前的研究結(jié)果一致。但醋酸鈉林格液進(jìn)行液體復(fù)蘇,減輕肝損傷的具體作用機(jī)制尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

THS后引起全身性炎癥反應(yīng)的最早的信號(hào)傳導(dǎo)途徑目前仍知之甚少。JNK信號(hào)通路是MAPK家族一條相對(duì)重要的信號(hào)通路,可被創(chuàng)傷、休克等應(yīng)激反應(yīng)和TNF-α激活[13]。磷酸化的C-Jun N末端激酶(p-JNK)是一種中央代謝調(diào)節(jié)劑,TNF-α可通過JNK的活化來發(fā)揮其功能,TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是JNK依賴性的[14]。有研究指出,在出血發(fā)生后不久,促分裂原活化蛋白(MAP)激酶中的JNK即在肝臟中活化,參與肝組織缺氧的早期反應(yīng)過程。小鼠出血至25 mmHg 30 min會(huì)導(dǎo)致肝臟內(nèi)JNK磷酸化顯著增加(2.1倍),組織缺氧是激活出血后肝臟早期信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵因素[15]。在藥物導(dǎo)致的肝損傷的研究中,JNK在對(duì)乙酰氨基酚(APAP)誘發(fā)的肝損傷中起著核心作用,抑制JNK激活來部分緩解乙酰氨基酚APAP誘導(dǎo)的肝損傷[16,17]。絲裂原激活的蛋白激酶磷酸酶1(MKP-1),是JNK的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)劑。MKP-1具有抗凋亡和抗炎特性,可通過抑制JNK信號(hào)途徑細(xì)胞凋亡和炎癥[18]。Wancket等[19]報(bào)道指出,MKP-1能夠通過抑制JNK活性保護(hù)小鼠免受APAP誘導(dǎo)的肝損傷。MKP-1表達(dá)水平的升高與p38和JNK活性的降低在時(shí)間上呈相關(guān)性,組織細(xì)胞中MKP-1表達(dá)的適度增加能夠縮短p38和JNK活化的時(shí)間,并在一定程度上抑制了TNF-α和IL-6的產(chǎn)生[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了這一點(diǎn),生理鹽水組、乳酸鈉林格液組、醋酸鈉林格液組大鼠肝組織JNK磷酸化水平相對(duì)于休克未復(fù)蘇組明顯降低,而肝組織中MKP-1乙酰化水平高于休克未復(fù)蘇組,并且醋酸鈉林格液組中表達(dá)水平最高,表明在創(chuàng)傷失血性休克發(fā)生時(shí),JNK會(huì)在肝臟中活化,通過液體復(fù)蘇能夠增加肝組織MKP-1乙?；?從而抑制JNK磷酸化,減少促炎因子IL-6、IL-10的釋放,減輕肝組織損傷及炎癥反應(yīng)。相關(guān)的研究指出:醋酸鹽可以減弱JNK磷酸化的能力,通過減少細(xì)胞中促炎因子的釋放,并提高抗炎因子的轉(zhuǎn)錄水平來調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的平衡,從而減輕細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[21]。因此我們推測(cè),醋酸鈉林格液相對(duì)于生理鹽水和乳酸鈉林格液,可能是通過醋酸鹽的補(bǔ)充,提高大鼠肝組織中MKP-1乙?；?從而抑制JNK信號(hào)通路的活化,調(diào)節(jié)炎性因子的釋放,進(jìn)而減輕了肝組織損傷及炎癥反應(yīng)。