基于HPLC的益腦心顆粒特征圖譜分析方法的建立

王 鑫,黃美玲,李建宏,任曉東,羅 丹,陳明會*

(1漢中市人民醫(yī)院藥劑科,漢中 723000;2漢中市鐵路中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科;3西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部;*通訊作者,E-mail:951036067@qq.com)

益腦心顆粒(國藥準(zhǔn)字Z20025079,為陜西漢王藥業(yè)股份有限公司獨(dú)家品種)由川芎、制首烏、丹參、郁金、山楂、天麻六味中藥組成,具有活血散瘀,平肝熄風(fēng)等功效,用于血瘀肝旺所致眩暈頭痛,心悸失眠,胸悶氣短等[1-3]。方中天麻含有天麻素、腺苷、5-羥甲基糠醛、巴利森苷A等成分,具有腦保護(hù)、抗暈眩、鎮(zhèn)靜催眠等作用[4-7];丹參中含丹酚酸B、5-羥甲基糠醛、迷迭香酸等成分,有抗凝血、改善微循環(huán)等作用[8,9];溫郁金具有抗血栓、抗炎等活性[10];何首烏含有二苯乙烯苷類、腺苷、沒食子酸等成分,具有明顯的抗衰老及神經(jīng)保護(hù)、降血脂及抗動脈粥樣硬化等作用[11-14];川芎含有腺苷、阿魏酸等成分有治療心血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用[15,16];山楂含有沒食子酸,具有明顯的抗氧化作用[17-19]。本制劑制備工藝主要為水提與生藥粉碎等[1]。該制劑在本院及研究報道中對眩暈頭痛等患者臨床療效較好[20]。因此,分析本制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)很有必要。本文參照中藥特征圖譜的有關(guān)技術(shù)要求[21]及運(yùn)用高效液相色譜(HPLC)法對本制劑進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀,型號Prominence UFLC,SPD-M20A二極管陣列檢測器,LC/Labsoluion色譜工作站,日本島津公司;KQ-5200DE臺式數(shù)控超聲波清洗器,昆山超聲儀器有限公司;十萬分之一電子分析天平,型號MS105DU,梅特勒公司;色譜柱Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),瑞典阿克蘇諾貝爾(Akzo Nobel)公司;乙腈、甲醇,色譜級,美國Fisher公司;水為自制超純水;其余為分析純。腺苷(批號:HA069554,含量98.0%)、二苯乙烯苷(批號:HO118401,含量98.0%)、沒食子酸(批號:HA175312,含量98.0%)、丹酚酸B(批號:HS034208,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%)、巴利森苷A(批號:BP1063,含量95.0%)等對照品均購自寶雞辰光生物科技有限公司;天麻素(批號:110807-202010,質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.5%)、5-羥甲基糠醛(批號:111626-202013,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%)、迷迭香酸(批號:111871-202007,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.1%)等對照品均購自中國食品藥品檢定研究院;川芎、制首烏、丹參、郁金、山楂、天麻等中藥材,均購自漢中市老百姓大藥房旗艦店;益腦心顆粒(國藥準(zhǔn)字Z20025079,規(guī)格15g×9袋/盒,批號010001、010002、010003、010004、010005、010006、010007、010008、010009、010010),陜西漢王藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 特征圖譜測定方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液 (B),梯度洗脫,見表1。記錄時間為100 min。流速:1.0 ml/min;柱溫:30 ℃;檢測波長:270 nm;進(jìn)樣量:10 μl。

表1 流動相梯度洗脫

1.2.2 混合對照與供試品溶液的制備

1.2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品腺苷5.10 mg、天麻素5.24 mg、沒食子酸5.10 mg、5-羥甲基糠醛5.03 mg、二苯乙烯苷5.10 mg、巴利森苷A 5.26 mg、迷迭香酸5.10 mg、丹酚酸B 5.10 mg置于50.00 ml量瓶中,加50%甲醇至刻度,搖勻,即得混合對照品溶液,各成分質(zhì)量濃度均為0.10 mg/ml。

1.2.2.2 供試品溶液的制備 取本品3袋內(nèi)容物,研細(xì),混勻,取15.0 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入50%乙醇50 ml,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率100 W,頻率100 Hz) 30 min,取出,放冷,再稱定質(zhì)量,用50%的乙醇補(bǔ)足其減失的質(zhì)量,搖勻,以0.22 μm的微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液得到供試品溶液。

1.2.3 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液(批號010001),連續(xù)進(jìn)樣5次,分別對共有峰的相對保留時間和相對峰面積進(jìn)行分析考察。計(jì)算各共有峰的相對保留時間與相對峰面積RSD值。

1.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(批號010001),分別于各時間點(diǎn)即0,2,4,8,12,24 h進(jìn)樣,考察共有峰的相對保留時間和相對峰面積。計(jì)算各共有峰相對保留時間與相對峰面積RSD值。

1.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份供試品(批號010001),按供試品溶液的制備與色譜條件進(jìn)行分析,分別對共有峰的相對保留時間和相對峰面積進(jìn)行分析考察。計(jì)算各共有峰相對保留時間與相對峰面積RSD值。

1.2.6 特征圖譜建立及相似度分析 取10批益腦心顆粒樣品,分別按供試品溶液的制備與色譜條件進(jìn)行分析,進(jìn)樣量10 μl,記錄色譜圖,建立特征圖譜。計(jì)算10批樣品共有色譜峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD值。參考文獻(xiàn)[21]對10批益腦心顆粒的特征圖譜進(jìn)行相似度分析,將色譜工作站數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥特征圖譜相似度計(jì)算軟件,通過計(jì)算得出樣品對照特征圖譜的共有模式,并以此共有模式為對照譜圖R,進(jìn)行整體相似度評價。

1.3 特征峰定性鑒別

1.3.1 色譜條件 同1.2.1項(xiàng)。

1.3.2 混合對照品溶液的制備 同1.2.2.1項(xiàng)。

1.3.3 供試品溶液的制備 同1.2.2.2項(xiàng)。

1.3.4 川芎供試品溶液的制備 取川芎粉末1 g于燒瓶中加蒸餾水100 ml,加熱回流1 h,濾過,收集濾液,減壓濃縮后,加入50%乙醇50 ml,超聲處理(功率100 W,頻率100 Hz))30 min,取出,放冷,再用50%乙醇補(bǔ)足其減失的質(zhì)量,搖勻,0.22 μm的微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液得到供試品溶液。

1.3.5 天麻供試品溶液的制備 取天麻粉末1 g置具塞錐形瓶中,加入50%乙醇50 ml,余同1.2.2.2項(xiàng)。

1.3.6 制首烏供試品溶液的制備 取制首烏粉末1 g于燒瓶中加蒸餾水100 ml,余同1.3.4項(xiàng)。

1.3.7 丹參供試品溶液的制備 取丹參粉末1 g于燒瓶中加蒸餾水100 ml,余同1.3.4項(xiàng)。

1.3.8 郁金供試品溶液的制備 取郁金粉末1 g于燒瓶中加蒸餾水100 ml,余同1.3.4項(xiàng)。

1.3.9 山楂供試品溶液的制備 取山楂粉末1 g于燒瓶中加蒸餾水100 ml,余同1.3.4項(xiàng)。

1.3.10 特征峰鑒別 分別取混合對照品、益腦心顆粒供試品以及川芎、制首烏、天麻、丹參、郁金、山楂藥材供試品按色譜條件1.2.1項(xiàng)進(jìn)樣測定,對特征峰進(jìn)行指認(rèn)。

2 結(jié)果

2.1 精密度試驗(yàn)

35個共有峰的相對保留時間與相對峰面積RSD值分別小于2.0%和5.0%(見表2,3)。表明該方法精密度良好。

表2 精密度試驗(yàn)相對保留時間測定結(jié)果

表3 精密度試驗(yàn)相對峰面積測定結(jié)果

2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

35個共有峰相對保留時間與相對峰面積RSD值分別小于2.0%和5.0%(見表4,5),表明供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)相對保留時間測定結(jié)果

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)相對峰面積測定結(jié)果

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

35個共有峰相對保留時間與相對峰面積RSD值分別小于1.0%和5.0%(見表6,7),表明該方法重復(fù)性良好。

表6 重復(fù)性試驗(yàn)相對保留時間結(jié)果

表7 重復(fù)性試驗(yàn)相對峰面積結(jié)果

2.4 特征圖譜建立及相似度分析

10批樣品共有色譜峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD值均分別小于1.0%和5.0%(見表8,9),以峰18為參比物(S),對選定35個共有色譜峰進(jìn)行譜峰匹配,生成對照譜圖R(見圖1,2),整體相似度結(jié)果相似度在0.900-0.998之間(見表10)。

1-35.特征指紋峰;1.腺苷;3.天麻素;5.沒食子酸;6.5-羥甲基糠醛;17.巴利森苷A;18.二苯乙烯苷(作為參照物的色譜峰);22.迷迭香酸;24.丹酚酸B圖1 益腦心顆粒HPLC對照特征圖譜Figure 1 HPLC reference characteristic chromatogram of Yinaoxin granules

表8 10批樣品相對保留時間結(jié)果

R. 10批擬合特征圖譜;S1-10.生產(chǎn)批號分別為010001,010002,010003,010004,010005,010006,010007,010008,010009,010010圖2 10批益腦心顆粒的HPLC特征圖譜Figure 2 HPLC characteristic chromatogram of 10 batches of Yinaoxin granules

表9 10批樣品相對峰面積結(jié)果

表10 10批制劑相似度測定結(jié)果

2.5 特征峰定性鑒別

特征峰1-35來自不同藥材,川芎中出現(xiàn)特征峰1,2,4,9-11,13-16,20,23,32-34;制首烏中出現(xiàn)特征峰1,4,5,10,11,14-16,18,19,25,27,31-33,35;天麻中出現(xiàn)特征峰1-4,6-12,14,16,17,20,25,32;丹參中出現(xiàn)特征峰6,8,11-13,15,20-31,33;郁金中出現(xiàn)特征峰9,10,20,29,30-33;山楂中出現(xiàn)特征峰5,8,11,13,14,16,32。指認(rèn)出8個特征峰分別是:峰1為腺苷、峰3為天麻素、峰5為沒食子酸、峰6為5-羥甲基糠醛、峰17為巴利森苷A、峰18為二苯乙烯苷、峰22為迷迭香酸、峰24為丹酚酸B(見圖3)。

A.益腦心顆粒;B.制首烏;C.川芎;D.天麻;E.郁金;F.丹參;G.山楂;H.混合對照品;1.腺苷;3.天麻素;5.沒食子酸;6.5-羥甲基糠醛;17.巴利森苷A;18.二苯乙烯苷;22.迷迭香酸;24.丹酚酸B圖3 供試品、混合對照品及各藥材HPLC色譜圖Figure 3 HPLC chromatogram of test substance, mixed reference substance and medicinal materials

3 討論

特征圖譜測定實(shí)驗(yàn)是使用二極管陣列檢測器對益腦心顆粒樣品進(jìn)行全波長掃描,比較樣品分別在210,220,230,240,250,260,270,280,290,300,310,320,330 nm波長處時測定結(jié)果,比較不同波長下色譜峰信息,如色譜峰數(shù)量、各色譜峰的分離度等,結(jié)果在270 nm時較為理想,故作為該制劑特征圖譜的測定波長。主要活性成分鑒別實(shí)驗(yàn)依據(jù)各成分出峰時間與紫外最大吸收值,參比物二苯乙烯苷最大吸收值分別在217 nm和311 nm處,定性鑒別的其他幾個成分的最大吸收值分別為腺苷(217,265 nm)、天麻素(220,269 nm)、沒食子酸(218,271 nm)、5-羥甲基糠醛(232,281 nm)、二苯乙烯苷(217,311 nm)、巴利森苷A(220,270 nm)、迷迭香酸(219,311 nm)、丹酚酸B(219,288,309 nm),在270 nm時均能良好地顯示色譜峰且分度符合要求。因此,綜合考察后確定益腦心顆粒特征圖譜檢測波長為270 nm。

本制劑為中藥復(fù)方,成分復(fù)雜,極性不一,所以采用梯度洗脫方法。曾選擇不同品牌的反相C18色譜柱(如安捷倫XDB-C18、ZORBAX Eclipse Plus C18、Ultimate?XB C18、Intersil C18、Kromasil C18),不同規(guī)格(如250 mm×4.6 mm, 5 μm 、150 mm×4.6 mm, 5 μm)進(jìn)行過比較;選擇不同流動相系統(tǒng)[如甲醇-水、乙腈-磷酸水溶液(0.1%,0.2%,0.5%,1.0%)、乙腈-水、乙腈-醋酸水溶液(0.2%,0.5%,1.0%)等],不同柱溫(25,30,35,40 ℃)、不同流速(0.5,0.8,1.0,1.2 ml/min)等;最終結(jié)果采用Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)與流動相系統(tǒng)乙腈-0.1%磷酸水溶液、柱溫為30 ℃、流速為1.0 ml/min,在此條件下各特征峰分離度較好、經(jīng)過方法考察具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性,故將此條件作為本方法的色譜條件。

制備供試品溶液方法的選擇,本制劑中天麻為生藥粉入藥,其余藥味均為水提取。比較了不同溶劑(乙醇、甲醇、水)及溶劑不同濃度(即0,50%,100%)、不同處理方法(加熱回流,超聲及其不同處理時間15,30,45,60 min)等,結(jié)果加熱回流與超聲提取比較,超聲提取時間短且色譜峰信息豐富;而選用50%乙醇作為溶劑優(yōu)于50%甲醇。因此,選擇50%乙醇超聲處理30 min作為本方法供試品溶液的制備方法。

在特征峰鑒別實(shí)驗(yàn)中,特征峰個數(shù)依次為丹參中19個>天麻中17個>制首烏中16個>川芎中15個>郁金中8個>山楂中7個。在35個特征峰中,指認(rèn)出8個特征峰即腺苷、天麻素、沒食子酸、5-羥甲基糠醛、巴利森苷A、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B,為繼續(xù)研究該制劑的藥代動力學(xué)奠定了基礎(chǔ)。本文引言已論述,它們均具有不同的藥理活性,是制劑的功效成分之一。

綜上所述,經(jīng)上述研究建立了益腦心顆粒的HPLC特征圖譜測定方法,該方法穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性良好,操作簡單、易于實(shí)施,能夠較為整體全面地反映益腦心顆粒的化學(xué)成分信息,因此該方法為益腦心顆粒質(zhì)量的評價提供了參考,為制劑臨床研究提供了依據(jù)。