吳 儀,譚周進

吳儀,譚周進,湖南中醫(yī)藥大學 湖南省長沙市 410208

0 引言

乳糖酶,又稱β-半乳糖苷酶,是腸道重要的功能酶之一,能分解乳糖成單糖為機體供能,也可將乳糖催化成低聚半乳糖,促進腸道益生菌增殖,對維持腸道健康有重要意義.乳糖酶主要由小腸絨毛刷狀緣及腸道細菌分泌,與腹瀉密切相關.研究表明,機體缺乏乳糖酶時會出現乳糖不耐受的癥狀,如嚴重的腹瀉、腹脹、排氣增多等,或伴有嘔吐、乳酸尿癥,嚴重者可出現脫水、酸中毒、營養(yǎng)不良及生長障礙等.中醫(yī)中藥治療腹瀉效果明顯,本課題組發(fā)現對使用抗生素后的慢性腹瀉,中藥治療有較大的優(yōu)勢.中藥可能通過改善腸道黏膜屏障、調節(jié)腸道菌群,提高腸道乳糖酶活性,中藥對腹瀉療效與乳糖酶基因的關系值得進一步探究.故本文論述不同原因導致的腹瀉與腸道乳糖酶活性表達的關系,以及中藥治療腹瀉的療效與腸道乳糖酶活性表達之間的關系.

1 腸道乳糖酶與腹瀉的相關性

1.1 腸道乳糖酶的構成與來源 乳糖是人乳中存在的唯一雙糖,由半乳糖和葡萄糖通過1,4-糖苷鍵的表達更科學連接而成,是絨毛刷狀緣表達的乳糖酶-根皮苷水解酶(lactase-phlorizinhydrolase,LPH)的主要底物,在腸黏膜呈灶塊狀分布,在空腸中部表達最高.乳糖酶又稱為β-半乳糖苷酶、乳糖酶-根皮苷水解酶,由兩條相同的胞外160 kDa多肽鏈和一個短的胞質內部分組成.乳糖酶的α-葡萄糖苷酶活性將乳糖分解成單糖葡萄糖和半乳糖,然后由鈉(+)/葡萄糖(半乳糖)共轉運蛋白(Na+/glucose cotransporter,SGLT1)主動轉運到上皮細胞(腸細胞)中[1],此外乳糖酶具有轉糖基活性,可將乳糖催化形成低聚半乳糖[2].

人體腸道乳糖酶主要來源于以下3個途徑:(1)主要由宿主乳糖酶基因合成,分布在小腸絨毛刷狀緣的黏膜表面;(2)腸道菌群能少量合成乳糖酶,如雙歧桿菌、乳桿菌、大腸桿菌,酵母菌和霉菌;(3)服用外源乳糖酶補充[3,4].因此,乳糖酶以人體胃腸黏膜(gastrointestinal mucosa,GIT)分泌為主,同時也由腸道微生物所分泌.乳糖酶宿主基因與微生物的互作經歷了長久的過程.首先在宿主基因不斷地選擇壓力下,由乳糖不持久性(lactase non persistence,LNP)變?yōu)槿樘浅志眯?lactase persistence,LP),同時宿主基因會優(yōu)先與有益的微生物合作.最初的自然條件下,人乳是乳糖唯一的來源,乳糖酶基因會在斷乳后逐漸關閉[5],但畜牧業(yè)發(fā)展以來人類能更普遍的攝入含乳糖制品,掀起了腸道內部一場巨變.在沒有LP等位基因的情況下,代謝乳糖的細菌發(fā)揮了分解乳糖的巨大作用[6],后來有益的宿主等位基因才出現并取代了微生物群功能,并在部分人體內穩(wěn)定下來[7,8].但這種分布具有種族與地域差異,西歐及高加索地區(qū)的人更多的攜帶了乳糖酶基因,而亞洲人則普遍缺乏.另一方面,腸道內微生物仍在發(fā)揮著乳糖代謝的作用,雙歧桿菌[9,10]、乳桿菌、大腸桿菌、酵母菌和霉菌是主要產乳糖酶的菌種.雖然微生物代謝乳糖產能較少,且乳糖酶在GIT分泌為主,宿主與微生物間存在乳糖酶位點競爭關系,但微生物產乳糖酶可以減少乳糖酶基因型之間的適應性差異,減輕LP等位基因的選擇壓力,從而保持人群中乳糖酶基因的多樣性.綜上所述,乳糖酶活性表達與機體腸道黏膜完整情況及細菌多樣性相關.

1.2 腹瀉與腸道乳糖酶活性的關系 乳糖酶作為重要的腸道功能酶之一,與腹瀉密切相關.腹瀉過程中普遍存在腸道黏膜破壞、菌群失調、胃腸動力障礙等腸道失調機制.腸道黏膜受損,刷狀緣表達的乳糖酶水平降低,或正常腸道菌群構成的破壞,產腸道乳糖酶菌株受到抑制,都會降低乳糖酶活性.此外破壞或抑制乳糖酶基因的表達也會降低腸道乳糖酶活性.經過課題組的研究,發(fā)現不同干預因素(包括藥物、飲食、溫度濕度等)誘導的腹瀉乳糖酶的表達有差異.

1.2.1 藥物誘導的腹瀉與腸道乳糖酶活性:抗生素抗生素相關性腹瀉(antibiotic-associated diarrhea,AAD)是臨床使用抗生素治療最容易發(fā)生的不良反應之一,AAD主要與黏膜的破壞和腸道微生物組成及功能失調有關.如表1[11-16]中所示,我們的前期研究證明使用混合抗生素溶液灌胃后小鼠腸道內容物及黏膜乳糖酶活性自第一天開始下降,直至第5天差異達到極致[11].楊春富等[16]發(fā)現嬰幼兒肺炎用藥后尿半乳糖含量或活性下降,乳糖不耐受陽性率達81.8%.進一步對AAD小鼠腸道內容物及腸道黏膜細菌進行16Sr RNA測序,結果表明抗生素降低了腸道細菌多樣性,盡管抗生素處理后殺死一些致病菌,如支原體和幽門螺旋桿菌,但更為嚴重的是抗生素導致了變形菌門的擴張[17,18].據報道[19],變形菌門近來被證明可作為腸道上皮功能障礙的診斷特征,腸道炎癥或抗生素處理可增加結腸上皮的氧化作用,從而破壞厭氧環(huán)境,驅動兼性厭氧的變形菌門的擴張.過量混合抗生素的使用降低了腸道乳酸桿菌的豐度,減弱了腸道黏膜的定植抗力,增加其他機會致病菌對腸道黏膜的破壞作用(如腸球菌屬及梭菌屬),降低腸道黏膜乳糖酶活性.另一方面,混合抗生素導致了腸道內容物菌群失調[17],降低了腸道內容物乳酸菌豐度、減少了腸道乳酸桿菌數量[20],并通過抑制乳糖酶產生菌而降低乳糖酶活性.

表1 腹瀉與腸道乳糖酶活性的相關性

課題組對細菌乳糖酶基因的研究發(fā)現了抗生素可能通過破壞或抑制腸道內容物乳糖酶基因的形成與表達,降低細菌乳糖酶基因的多樣性[21];黏膜細菌乳糖酶基因多樣性增加,可能與黏膜結構被破壞,腸道定植抗力減弱,大量菌群遷移至黏膜層有關[22].我們的研究證明抗生素的使用并未影響小鼠細菌乳糖酶基因13910位點多態(tài)性[23].

總之,過量混合抗生素的使用破壞了腸道黏膜屏障,改變了菌群在黏膜與內容物中的構成,增加了細菌的多樣性,但減少了產乳糖酶關鍵菌群的菌群.乳糖酶以黏膜分泌為主,故腸道黏膜的破壞是抗生素導致乳糖酶活性下降的主要原因.抗生素的使用會影響細菌乳糖酶基因多樣性,但具體機制需進一步研究.

番瀉葉誘導腹瀉的腸道機理主要是減少對水、電解質的吸收造成腸道非推進性收縮增強,以及改變腸道微生物菌群與代謝[24].本課題發(fā)現番瀉葉能明顯抑制腸道內容物乳糖酶活性,而對腸道黏膜乳糖酶活性沒有影響,這可能是因為番瀉葉致瀉并非明顯的損傷了腸道黏膜,所以對腸道黏膜乳糖酶并無影響[15].

1.2.2 環(huán)境因素誘導的腹瀉與腸道乳糖酶活性水平相關性:多項研究證明,環(huán)境因素與物種基因是影響腸道菌群的重要因素,在同一物種中環(huán)境因素對腸道菌群的影響,甚至比宿主自身因素(年齡/性別)更顯著.這種環(huán)境因素包括季節(jié)氣候、居住條件、地域、食物構成等[25,26].中醫(yī)泄瀉是以排便次數增多,糞質溏薄或完谷不化,甚至瀉出如水樣為主癥的病證.從病因學角度,中醫(yī)認為外感寒濕或濕熱之邪,飲食不當,脾虛體質,情志變化等都是引起泄瀉的重要因素.從微生物學角度來看,這些因素都能對腸道菌群產生影響.

溫度、濕度、飲食都是影響機體腸道菌群的重要因素,溫熱環(huán)境增強了菌群的多胺生物合成,使乙酰亞精胺和腐胺等多胺水平升高[27].短暫的高糖飲食雖然不會促進小鼠腸炎的形成,但會改變腸道菌群的構成,增加黏液降解細菌,削弱腸道黏液屏障[28].Tian等人[29]發(fā)現高溫環(huán)境下的紹興鴨腸道內乳酸桿菌為優(yōu)勢菌屬;惠華英等[12]通過“高糖高脂+高溫高濕+白酒+冰水”的復合因素模擬中醫(yī)腸道濕熱證泄瀉,發(fā)現高脂高糖飲食損傷腸道黏膜,降低了腸道黏膜酶活性(表1),同時多種復合因素下改變了腸道菌群的構成,提高了腸道微生物產乳糖酶的能力,促細菌產乳糖酶的主要影響因素為高脂高糖飲食.

由上可知,腹瀉與腸道乳糖酶活性具有相關性,且與乳糖酶活性下降成呈正相關.AAD對腸道黏膜及腸道菌群的損傷最嚴重,降低了小腸黏膜與內容物的乳糖酶活性;環(huán)境與飲食誘導的腹瀉與乳糖酶關系密切,主要降低了腸道內容物乳糖酶活性;番瀉葉誘導的腹瀉主要降低了腸道黏膜乳糖酶活性.這提示我們不同因素誘導的腹瀉與乳糖酶活性降低相關,且具體因素影響下的活性變化有區(qū)別.

2 中藥治療腹瀉與乳糖酶活性的相關性及療效機制

中醫(yī)藥對腹瀉具有明顯的治療優(yōu)勢,但其療效機制尚不明確,尤其中醫(yī)學認為腹瀉具有不同的方證,這使研究變得更加復雜.賀璐等[30]認為中草藥對腸道消化酶水平具有調控作用,主要是通過修復腸道黏膜損傷、改善腸道環(huán)境及調整腸道微生物調節(jié)腸道消化酶活性水平.表2[12-14,31-32]說明了中藥對腸道乳糖酶具有調控作用,中醫(yī)藥治療腹瀉后腸道乳糖酶活性會明顯提高.從消化酶活性水平著手,探究中藥對泄瀉的腸道療效機制及微生態(tài)調節(jié)機制具有創(chuàng)新性,根據課題組實驗結果表明,中藥提高腹瀉下腸道乳糖酶的活性可能通過以下兩個主要途徑:腸道黏膜修復與腸道菌群調整(圖1).

表2 中藥對腹瀉療效與腸道乳糖酶活性的相關性

圖1 七味白術散治療AAD腹瀉的療效機理.QWBZS:七味白術散;IL-6:白細胞介素6;IL-8:白細胞介素8;IL-4:白細胞介素4;IL-10:白細胞介素10;TNF-α:腫瘤壞死因子-α;SIgA:分泌型免疫球蛋白A;CH4:甲烷;CO2:二氧化碳.

2.1 中藥通過修復腸道黏膜提高乳糖酶活性治療腹瀉腸道黏膜是飲食消化吸收的重要場所,同時也是腸道免疫的重要防線.一旦腸黏膜屏障受損,腸上皮細胞間的完整連接結構受損,腸上皮通透性增加.宿主乳糖酶主要由腸黏膜上皮細胞分泌,因此黏膜乳糖酶的活性高低與腸道黏膜的損傷狀態(tài)密切相關.惠華英等[31]證明七味白術散能恢復且提高AAD小鼠腸道黏膜乳糖酶活性,吳儀等[32]使用痛瀉要方治療肝氣乘脾泄瀉小鼠,發(fā)現中藥組小鼠腸黏膜乳糖酶、蔗糖酶等二糖酶活性明顯提高,對治療腹瀉具有一定作用.腸黏膜上肥大細胞活化分數反映腸道黏膜炎癥,研究證明痛瀉要方能降低肥大細胞活化分數,幫助修復腸黏膜[33].蛋白酶激活受體2是一種絲氨酸蛋白酶受體,廣泛分布于腸上皮細胞上.腸道PAR-2受體信號與腸上皮細胞屏障損傷密切相關.譚許鵬等發(fā)現痛瀉要方及防風能改善腸上皮Caco-2細胞屏障,這與方中有效活性成分如槲皮素等密切相關.惠華英等[12]實驗證明,葛根芩連湯明顯提高了腸道濕熱證泄瀉小鼠腸道黏膜乳糖酶活性,能促進腸道黏膜分泌乳糖酶,這與葛根芩連湯參與修復腸黏膜屏障有關.張寧等[34]實驗證明加味葛根芩連湯明顯降低黏膜低氧誘導因子-1α(HIF-1α)、二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸(D-LA),對重度濕熱型潰瘍性結腸炎具有黏膜修復的作用.

2.2 中藥通過調控“腸道菌群-代謝產物”提高腸道乳糖酶活性 中藥所含成分非常復雜,除含有大量的活性成分外,還有多糖、蛋白質、脂類等大分子物質及微生物、微量元素等.中藥成分進入腸道后,某些機體無法消化的物質需要腸道內龐大的微生物參與,這些成分會直接刺激對應菌群的增長,從而改變腸道菌群的構成,調整腸道菌群的平衡.厚壁菌門是產乳糖酶的主要菌門[35],Akkermansia muciniphila(Akk菌)、腸道乳酸桿菌及腸道共生的多形擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron,BT)也被證實能產生β-半乳糖苷酶[36,37].研究證明[20],QWBZS能增加AAD小鼠黏膜乳酸菌和擬桿菌S24-7的豐度,抑制內容物中擬桿菌和Ochrobactrum的增長,增加Osillospir,Dorea,Coprococcus and Blautia豐度,調整腸道菌群的結構分布及多樣性;葛根芩連湯通過增加乳酸菌的數量,緩解AAD;痛瀉要方能促進益生菌的增長和抑制病原菌、條件致病菌(普雷沃氏菌和理研菌、腸桿菌等)[38];四君子湯能增加小鼠腸道內乳酸桿菌和雙歧桿菌的數量[39].FDA法測定腸道總微生物活性簡便快捷,能迅速地反應腸道內微生物的活躍程度,實驗證明痛瀉要方能提高肝氣乘脾泄瀉小鼠的腸道微生物活度,說明中藥能整體提高腸道內酶活性水平[40].

2.3 中藥調控腸道乳糖酶活性與腸道細菌乳糖酶基因的關系 β-半乳糖苷酶基因編碼是由4個亞基組成的四聚體.從不同物種提取的β-半乳糖苷酶的蛋白質序列有著較高的同源性和相似性.人體胃腸道微生物組蘊含著豐富的微生物酶類基因資源,共有基因支持著微生物日常生存的基本功能,如酶的消耗和分解,能量轉換和代謝[41].乳糖酶基因的多樣性可為物種進化提供材料,從而提高乳糖酶的催化效率.中藥能調控乳糖酶活性治療腹瀉,在酶量及酶基因表達水平都有可能發(fā)揮作用.從乳糖酶基因的表達水平有助于深入認識中藥的療效機制[31].

哺乳動物乳糖酶基因存在多個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點,其基因多態(tài)性與乳糖酶活性存在顯著相關性.課題組研究證明與QWBZS對AAD療效的發(fā)揮與乳糖酶基因13910位點多態(tài)性沒有相關性,可能存在其他多態(tài)性位點或其他方面的調控機制[23].此外,我們的研究表明QWBZS能促進腸道黏膜乳糖酶基因的多樣性恢復至正常水平,同時QWBZS能調節(jié)腸道黏膜細菌的構成,說明QWBZS主要通過改變細菌的結構,幫助修復腸屏障黏膜,調節(jié)乳糖酶活性治療腹瀉[42].QWBZS處理沒有增加細菌乳糖酶基因的多樣性,其對腹瀉的療效可能與其促進新的或一些關鍵的產乳糖酶菌株的生長有關[43].

3 結論

不同的干預因素及中藥治療改變了腸道菌群的組成與特定腸道菌群,尤其影響了產乳糖酶細菌.不同的干預因素不同程度的降低了腸道內容物或黏膜的乳糖酶活性,與腸道黏膜狀態(tài)及腸道菌群的變化差異有關.中藥調控腸道黏膜以及腸道菌群,提高腸道乳糖酶活性,與腹瀉的療效成正相關.乳糖酶基因表達水平及酶基因編碼功能的研究需要進一步深入.未來應該繼續(xù)研究中藥對腹瀉療效的物質基礎,重點是尋找不同干預因素下的與乳糖酶活性密切相關的腸道產乳糖酶細菌,對細菌乳糖酶基因的研究值得進一步深入.