潘承慧，齊東月，趙大云

（上海交通大學農業(yè)與生物學院，上海 200240）

大豆皂苷（Soyasaponin）是由非極性的苷元（Soyasapogenol）和極性的低聚糖鏈組成，主要來源于豆類植物[1-2]。根據苷元結構，一般將大豆皂苷分為A類、B類、C類、E類和DDMP類[3]。目前大豆皂苷的性質、功能以及應用的研究以A類和B類為主[4-8]。大豆皂苷具有降血脂[9]、降血壓[10]、減少肝細胞損傷[11]、抑制癌細胞增殖[12]以及抗氧化抗炎[13]等多種生理功能?；钚猿煞衷隗w內的生物利用度對其功效發(fā)揮具有重要意義[14-15]。體內外代謝研究表明，大豆皂苷在體內無法直接被吸收，而是進一步降解為苷元發(fā)揮功效，且口服生物利用度不理想[16-18]。

腸道是消化吸收的主要部位，研究功能性食品及藥物的腸道吸收特性，可指導選擇適宜的制劑方式，從而提高制劑的生物利用度。腸吸收的研究方法包括離體外翻腸囊模型、Caco-2細胞模型、在體循環(huán)腸灌流和在體單向腸灌流模型[19-22]。在體單向腸灌流模型因簡單、易操作，實驗條件與實際腸道內環(huán)境接近，國內外廣泛應用該技術于研究各種化學藥物的吸收行為，在中藥及功能食品研究中也日益普及，成為預測活性成分在體內吸收特征的重要手段[23-24]。當前，苷元在腸道的吸收、分布、代謝和排泄等規(guī)律研究尚未見報道，而吸收是苷元可利用的關鍵階段，直接影響其生理功效作用[25]。因此，研究苷元在腸道的吸收特征對提高其在實際應用中的附加值具有關鍵的指導意義。

本研究以大豆皂苷元A和B為研究對象，建立了大豆皂苷元A和B的HPLC分析方法和可靠的在體單向腸灌流模型，并通過該模型考察了腸段、苷元劑量和膽汁等因素對其在大鼠腸道的表觀滲透系數(shù)和吸收速率常數(shù)的影響，以闡明苷元在小腸中的吸收特征和吸收機制，為其在食品和制藥行業(yè)的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆皂苷苷元A和B樣品 純度＞98%，由實驗室制備[26]；大豆皂苷苷元A標準品（批號：79086525）、大豆皂苷苷元B標準品（批號：SLCC1104） 純度＞98%，戊巴比妥鈉 分析純，美國Sigma公司；生理鹽水 山東康寧藥業(yè)有限公司；Krebs-Ringer緩沖液 北京雷根生物技術有限公司；其他有機試劑 均為分析純，上海凌鋒化學試劑有限公司；雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（6～8周齡，共24只）體質量（250±20） g，北京維通利華有限公司，經上海交通大學實驗動物倫理與使用委員會批準（IACUC），批準號：A2019086，飼養(yǎng)在12 h光照12 h黑暗循環(huán)條件下，室溫保持24 ℃，飼喂不含大豆制品的飼料，適應性喂養(yǎng)一周后開始實驗。

HL-1S型恒流泵 上海青浦滬西儀器廠；R-300型超高效液相色譜儀（UPLC-PDA-ELSD） 美國Waters公司；DM 4000型光學顯微鏡 德國Leica公司；Sirion型高分辨場發(fā)射掃描電子顯微鏡 美國FEI公司；Tecnai G2型生物型透射電鏡美國Thermoscientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制

1.2.1.1 大豆皂苷苷元標準液的配制 準確稱取大豆皂苷苷元A和B標準品1.00 mg，分別用甲醇定容至10 mL容量瓶中，配制成100 μg/mL的母液，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.1.2 大豆皂苷苷元灌流液的配制 準確稱取適量大豆皂苷苷元A和B，溶解于Krebs-Ringer緩沖液，配制成10 mg/L（低劑量）和50 mg/L（高劑量）的灌流液。空白灌流液為Krebs-Ringer緩沖液。

1.2.2 液相色譜條件及方法學考察

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS C18柱 (i.d.250 mm×4.6 mm，5 μm)，進樣體積：10 μL，柱溫：25 ℃，流 動 相：乙 腈-正 丙 醇-水-乙 酸（80:6:13.9:0.1，v:v:v:v），流速：0.9 mL/min，等度洗脫；紫外檢測范圍200～600 nm，檢測波長205 nm；蒸發(fā)光檢測器參數(shù)：漂移管溫度52 ℃，增益值1，氣體壓力35 psi。

1.2.2.2 專屬性考察 分別吸取空白灌流液、大豆皂苷苷元標準液和灌流液適量進行液相檢測，得到色譜圖，考察該色譜方法的專屬性。

1.2.2.3 標準曲線制作 精密吸取大豆皂苷苷元標準母液（100 μg/mL）適量，制備系列濃度標準液，分別為10、20、30、40、50、70、100 μg/mL，精密吸取各濃度標準液10 μL進行色譜測定，得到苷元A和B的峰面積。以苷元質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制雙對數(shù)坐標，并進行線性回歸，計算苷元A和B的標準曲線方程。

1.2.2.4 精密度考察 分別吸取濃度為20、50和100 μg/mL的大豆皂苷苷元標準液進樣測定，每個濃度日內間隔測定5次，連續(xù)測定5 d，得到苷元A和B的峰面積，計算其含量，考察該方法日內和日間精密度。

1.2.2.5 回收率考察 分別精密吸取濃度為20、50和100 μg/mL的大豆皂苷苷元標準液，進樣檢測，得到峰面積代入標準曲線方程計算其實測質量濃度，以實測濃度與配制濃度的比值計算該方法的回收率。

1.2.2.6 穩(wěn)定性考察 取濃度為10 mg/L的大豆皂苷苷元灌流液，置于37 ℃恒溫水浴，分別測定0、30、60、90、120 min時間點下苷元A和B的峰面積，計算其濃度，并與0 min時測得的濃度作百分比，考察灌流液在試驗過程中的穩(wěn)定性。

1.2.3 大鼠在體單向腸灌流實驗 實驗前，將SD大鼠禁食12 h，自由飲水。腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）進行麻醉，麻醉后置于電熱墊，保持體溫37 ℃，并將背位固定于手術臺上。沿腹中線剪開腹腔部位，切口為3～4 cm，確定四個腸段部位：十二指腸段在距幽門1 cm處開始向下取5 cm，空腸腸段在距十二指腸出口端4 cm處開始向下取5 cm，回腸腸段在距和盲腸連接處上端2 cm處開始向上取5 cm，結腸腸段在距和盲腸連接處開始向下取10 cm。四個腸段兩端切口插管并用手術線結扎，用37 ℃生理鹽水緩慢將腸內容物沖洗干凈，排空生理鹽水后，連接恒流泵，先用Krebs-Ringer緩沖液（提前37 ℃預熱）以0.2 mL/min 的流速平衡各腸段30 min，再切換為大豆皂苷苷元灌流液開始試驗，分別在15、30、45、60、75、90、105、120 min時間點收集流出液于已知質量離心管中，灌流期間用浸濕生理鹽水的棉布覆蓋腹腔，保持濕潤，間斷給予1%戊巴比妥鈉維持麻醉狀態(tài)。實驗結束后，再次稱取收集后的離心管質量，剪取各灌流腸段部位，分別測量內徑及長度。

1.2.4 大鼠小腸形態(tài)學變化實驗 驗證大鼠在體單向腸灌流模型的可靠性，采用50 mg/L苷元灌流液，在有膽汁情況下按1.2.3灌流操作，分別取灌流前（0 h）、灌流2和4 h的大鼠腸段1 cm，生理鹽水清洗除去表面雜垢后，立即投入預先配好的固定液中保存24 h后，進行形態(tài)學觀察。

1.2.4.1 光學顯微鏡 將切下的空腸段投入預先配好的4%多聚甲醛溶液保存過夜，經脫水、石蠟包埋、切片（厚度3 μm）以及HE染色，光學顯微鏡低倍鏡下觀察切片并測量空腸壁厚度、粘膜厚度、皺襞高度、皺襞表面積，平行測定5次，計算其平均值。

1.2.4.2 掃描電鏡 將切下的空腸段投入預先裝有2.5%戊二醛固定液的小瓶固定過夜，脫水程序如下：0.1 mol/L PBS緩沖液漂洗，10 min×4次；用1%四氧化鋨0.2 mL二次固定2 h；再次用0.1 mol/L PBS緩沖液漂洗，10 min×4次；用50%、70%、90%乙醇清洗15 min；最后用90%乙醇：90%丙酮（1:1）和90%丙酮各脫水20 min。將樣品放進CO2干燥機進行臨界干燥3 h，干燥后噴金，進行掃描電鏡觀察。

1.2.4.3 透射電鏡 將切下的空腸段投入預先裝有2.5%戊二醛固定液的小瓶固定過夜，按照1.2.3.2脫水程序處理方法，再用100%丙酮進一步脫水，15 min×3次；丙酮：環(huán)氧樹脂（1:1）0.5 mL浸泡1 h，再用丙酮：環(huán)氧樹脂（1:2）0.5 mL浸泡過夜；用環(huán)氧樹脂0.4 mL置換，4 h×2次，經樹脂包埋后在60 ℃烘箱里聚合48 h，取出進行超薄切片（大小1 mm3），最后用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，進行透射電鏡觀察。

1.2.5 苷元腸吸收特性的單因素影響實驗 探究不同因素對大豆皂苷苷元在腸道的吸收影響，將大鼠分為低劑量組和高劑量組（10 、50 mg/L，有膽汁）、有膽汁組和無膽汁組（不結扎膽管，結扎膽管，50 mg/L），分別考察不同腸段、劑量和膽汁對大豆皂苷苷元灌流液在大鼠小腸的吸收能力。

1.2.6 灌流液樣品HPLC測定 準確吸取灌流液樣品200 μL，置于1.5 mL離心管，再加入800 μL內標液，渦旋混勻1 min后，12000 r/min下離心10 min，取上清液，50 ℃水浴加熱氮吹至干后，加入100 μL甲醇溶解，經0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾液進行色譜分析，得到灌流液中苷元濃度，并計算苷元在體的吸收速率常數(shù)Ka（s-1）和表觀滲透系數(shù)Papp（cm/s）。

采用重量法，校正因腸內水分吸收引起的灌流液質量變化。吸收速率常數(shù)Ka（s-1）、表觀滲透系數(shù)Papp（cm/s）計算公式如下：

式中：Cin和Cout分別表示腸道進口灌流液和出口收集液的樣品濃度，mg/L；Vin和Vout分別表示腸道進口灌流液和出口收集液的樣品體積，mL；Qin表示灌流速度，0.2 mL/min；r表示灌流腸段的內徑，cm；l表示灌流腸段的長度，cm。

1.3 數(shù)據處理

采用Origin軟件進行繪圖，采用SPSS 24.0軟件系統(tǒng)進行方差分析，結果以表示，采用Tukey HSD檢驗組間顯著性，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

HPLC色譜參考Rupasinghe等[27]的方法，分別將空白灌流液、大豆皂苷苷元標準液和灌流液進行檢測，結果如圖1所示?？瞻坠嗔饕褐械奈镔|在4.11 min洗脫出來，而苷元A和B的保留時間分別為8.34和12.45 min，且分離度較好，無其他物質干擾，說明此色譜方法適于兩種苷元及其灌流液的分析。

圖1 大豆皂苷苷元標準液及灌流液的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of soyasapogneols standard and intestinal liquid

蒸發(fā)光散射檢測器信號與峰面積的關系符合Y=aXb，兩者的對數(shù)呈線性關系[28]。對檢測得到的系列濃度苷元峰面積和對應的標準液濃度取對數(shù)，經線性回歸計算，得到苷元A的標準曲線方程為：Y=0.062X1.610（R2=0.9997），苷元B的標準曲線為：Y=0.225X1.466（R2=0.9994），說明苷元A和B在濃度范圍10～100 μg/mL內擬合度較好。苷元A和B的檢測限（LOD，S/N=3）分別為4.06和2.17 μg/mL，定量限（LOQ，S/N=10）為10.81和5.77 μg/mL。

大豆皂苷苷元的精密度、回收率和穩(wěn)定性結果如表1所示。在20、50、100 μg/mL濃度時，苷元A和B的日內和日間精密度RSD（n=5）均小于9%，苷元A提取回收率在98.42%～103.43%，RSD小于6%，苷元B提取回收率在94.56%～104.32%，RSD小于7%，說明此HPLC條件下的精密度良好，回收率符合苷元的檢測要求。苷元A和B在37 ℃水浴不同時間點測得的濃度百分比RSD分別為3.23%和4.56%，表明苷元在37 ℃水浴時熱穩(wěn)定性良好。

2.2 大鼠空腸的形態(tài)學變化

選取空腸段，考察灌流前（0 h）、灌流2和4 h時的形態(tài)學變化，光鏡測量空腸各結構的結果見表2，掃描電鏡和透射電鏡觀察結果見圖2。

由表2可知，隨著灌流時間的增長，空腸腸壁厚度、粘膜厚度減小，皺襞高度以及表面積都呈現(xiàn)降低的趨勢，灌流2 h組參數(shù)分別為646.42、524.57、391.93 μm和63930.46 μm2，空腸腸壁厚度、皺襞表面積與灌流前差異不顯著（P＞0.05），其他差異顯著；而灌流4 h組顯著減少（P＜0.05），這說明，此實驗采用的單向在體灌流模型在2 h內腸壁受到的機械損傷程度較低，從而更好地減小實驗誤差，測得的吸收參數(shù)可靠。

掃描電鏡觀察灌流內壁結果發(fā)現(xiàn)，灌流前大鼠空腸皺襞表面光滑，腺體大小一致，呈有序排列，隱凹結構明顯；受灌流機械作用，皺襞表面易出現(xiàn)破裂，灌流2 h組有輕微裂口，隱凹深度變淺；灌流4 h組破裂程度加重，粘膜內物質有溶出現(xiàn)象，隱凹結構難以觀察。

透射電鏡觀察內部細胞結構發(fā)現(xiàn)，灌流前大鼠空腸粘膜杯狀細胞數(shù)量多，排列整齊；隨著灌流時間的延長，粘膜杯狀細胞和上皮吸收細胞數(shù)量減少，灌流2 h組細胞結構保留相對完整，灌流4 h組細胞結構破壞嚴重，細胞膜破裂，細胞器分散明顯。

從空腸表觀和內部形態(tài)觀察結果來看，由于灌流的機械作用，大鼠腸道存在不同程度的損傷，且灌流時間越長，損傷越嚴重，為保證苷元腸吸收實驗的可靠性，選擇灌流2 h為實驗時長。

表1 大豆皂苷苷元HPLC的精密度、回收率和穩(wěn)定性考察（n=5）Table 1 Accuracy, recovery and stability of soyasapogenol by HPLC (n=5)

表2 空腸結構形態(tài)學變化Table 2 Morphological changes of jejunum structure

圖2 掃描和透射電鏡下空腸形態(tài)學變化Fig.2 Morphological changes of jejunum by scanning and transmission electron microscope

2.3 不同因素對大豆皂苷苷元A和B腸吸收特性的影響

2.3.1 不同腸段對腸吸收的影響 50 mg/L下苷元A和B在不同腸段的表觀滲透系數(shù)Papp及吸收速率常數(shù)Ka結果如表3所示。

大鼠腸道包括十二指腸、空腸、回腸和結腸，各部小腸絨毛和粘膜皺襞結構存在差異，因此，成分在不同腸道的吸收具有部位特異性。苷元A在不同腸段的表觀滲透系數(shù)Papp大小為：空腸＞十二指腸＞回腸＞結腸，空腸滲透系數(shù)最高，50 mg/L劑量時為15.34×10-5cm/s，是十二指腸的1.64倍、回腸的2.75倍、結腸的4.10倍，顯著優(yōu)于其他腸段（P＜0.05）；吸收速率常數(shù)Ka大小為：空腸＞十二指腸＞回腸＞結腸，空腸與十二指腸吸收能力接近，50 mg/L劑量時分別為3.06×10-5、2.74×10-5s-1，無顯著差異（P＞0.05）。苷元B在不同腸段的滲透和吸收情況與苷元A相似，均為空腸優(yōu)于十二指腸、回腸、結腸，但滲透和吸收參數(shù)低于苷元A。苷元A和B在各腸段均存在吸收，且空腸段吸收效果最優(yōu)，可考慮將其制為空腸特定部位靶向制劑[29]。

2.3.2 不同劑量對腸吸收的影響 從表3來看，大豆皂苷苷元A高劑量組的表觀滲透系數(shù)Papp和吸收速率常數(shù)Ka均高于低劑量組，在空腸段高劑量組的滲透和吸收能力是低劑量組的1.54、1.15倍，有顯著性差異（P＜0.05），說明苷元A在腸道的吸收存在濃度依賴性，吸收機制為被動擴散[30]。空腸段苷元B高、低劑量組的表觀滲透系數(shù)Papp分別為6.32×10-5、11.36×10-5cm/s，差異明顯（P＜0.05），而吸收速率常數(shù)Ka分別為2.42×10-5、2.74×10-5s-1，無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3.3 膽汁對腸吸收的影響 如表4可知，苷元A和B有膽汁組在十二指腸部位的表觀滲透系數(shù)Papp分別為9.76×10-5、3.77×10-5cm/s，在空腸部位分別為16.56×10-5、12.01×10-5cm/s，在十二指腸部位吸收速率常數(shù)Ka分別為3.96×10-5、1.82×10-5s-1，在空腸部位分別為3.06×10-5、2.97×10-5s-1，均顯著高于無膽汁組（P＜0.05），說明膽汁的分泌對苷元吸收具有特殊吸收機制，苷元在體內吸收形式為腸肝循環(huán)，膽汁中的膽汁酸對苷元在小腸部位的消化吸收具有促進作用[31]。膽汁在回腸段和結腸段的促進效果不明顯，說明膽汁主要作用部位于腸部上端。

表3 各劑量對大豆皂苷苷元在各腸段Papp和Ka的影響（D，n=4）Table 3 Effect of concentration on soyasapogenol absorptivity at different intestines ( D, n=4)

表3 各劑量對大豆皂苷苷元在各腸段Papp和Ka的影響（D，n=4）Table 3 Effect of concentration on soyasapogenol absorptivity at different intestines ( D, n=4)

注：不同字母表示表觀滲透系數(shù)Papp和吸收速率常數(shù)Ka的高低劑量組間顯著差異，P＜0.05。

苷元 劑量 吸收參數(shù) 十二指腸 空腸 回腸 結腸苷元A 10 mg/L（低） Papp*10-5(cm/s) 4.81±1.08b 9.99±2.71b 3.01±1.23b 2.70±0.15b Ka*10-5(s-1) 2.61±0.31b 2.66±0.14a 3.41±0.23a 0.70±0.01a 50 mg/L（高） Papp*10-5(cm/s) 9.37±0.95a 15.34±0.60a 5.58±0.70a 3.74±0.38a Ka*10-5(s-1) 3.05±0.09a 3.06±0.13b 2.51±0.09b 0.72±0.01a 10 mg/L（低） Papp*10-5(cm/s) 2.63±0.03b 6.32±1.14b 1.90±0.58b 1.38±±0.35b Ka*10-5(s-1) 2.03±0.16a 2.42±0.23a 1.38±0.35a 0.48±0.08a 50 mg/L（高） Papp*10-5(cm/s) 3.77±1.51a 11.36±0.70a 3.18±0.66a 1.64±0.27a Ka*10-5(s-1) 2.34±0.33a 2.74±0.02a 1.59±0.24a 0.55±0.05a苷元B

表4 有無膽汁對大豆皂苷苷元在各腸段Papp和Ka的影響（D，n=4）Table 4 Effect of bile on soyasapogenol absorptivity at different Intestines (D, n=4)

表4 有無膽汁對大豆皂苷苷元在各腸段Papp和Ka的影響（D，n=4）Table 4 Effect of bile on soyasapogenol absorptivity at different Intestines (D, n=4)

注：不同字母表示表觀滲透系數(shù)Papp和吸收速率常數(shù)Ka的有無膽汁組間顯著差異，P＜0.05。

苷元 組別 吸收參數(shù) 十二指腸 空腸 回腸 結腸苷元A有膽汁 Papp*10-5(cm/s) 9.76±0.34a 16.56±0.73a 9.27±1.85a 3.42±0.01b Ka*10-5(s-1) 3.96±0.13a 3.06±0.46a 2.46±0.28a 0.63±0.02a無膽汁 Papp*10-5(cm/s) 8.60±0.74b 12.90±1.05b 7.21±1.97b 4.47±0.80a Ka*10-5(s-1) 3.03±1.26b 2.34±0.01b 2.60±0.25a 0.91±0.03a有膽汁 Papp*10-5(cm/s) 3.77±0.42a 12.01±0.16a 3.29±1.28a 1.57±0.09a Ka*10-5(s-1) 1.82±0.05a 2.97±0.43a 1.58±0.49a 0.48±0.01a無膽汁 Papp*10-5(cm/s) 3.09±0.45a 9.67±0.99b 2.54±1.14b 1.80±0.73a Ka*10-5(s-1) 1.73±0.30a 2.30±0.04a 1.68±0.44a 0.68±0.14a苷元B

3 結論

形態(tài)學研究顯示，大鼠空腸的結構在灌流2 h和灌流前無顯著差異，表明在體單向腸灌流模型在實驗期間保持良好的腸道環(huán)境，通過該模型評估大豆皂苷苷元A和B時可行的。在體腸吸收結果表明，大豆皂苷苷元A和B在不同腸段的吸收能力為：空腸＞十二指腸＞回腸＞結腸，主要吸收部位為空腸，提示在開發(fā)苷元制劑時，可考慮空腸特定靶向產品，以提高苷元的生物利用度；苷元A的在體腸滲透和吸收能力均具有顯著的濃度依賴性，推測其吸收機制為被動擴散；而苷元B滲透參數(shù)隨濃度變化明顯，吸收情況的濃度依賴性不顯著，提示苷元B的吸收機制不是簡單的被動擴散，可能還存在跨膜、載體蛋白等多種形式的結合方式；內源物膽汁對苷元A和B的吸收起促進作用，且主要作用于腸部上端。本研究為苷元以后的深度開發(fā)利用提供了科學依據。