陳曉旭,吳玥琨,張燕*
(1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室,天津 300457;2.南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院,天津市食品科學(xué)與健康重點實驗室,天津 300071)
近年來,人們對于食物過敏的關(guān)注度越來越高。常見的食物過敏原包括花生、大豆、奶、蛋、魚、貝類、堅果等,食品標(biāo)識委員會將其定義為八大食物過敏原[1]。其中大豆為人們膳食提供了豐富的植物蛋白,而致敏性是它的主要劣勢,阻礙其在食品加工中的應(yīng)用。大豆致敏蛋白中β-伴大豆球蛋白約占大豆蛋白總量的30%[2],是大豆主要的過敏原[3]。β-伴大豆球蛋白是由α、α′和β亞基組成的三聚體結(jié)構(gòu),每個亞基由酸性肽鏈和堿性肽鏈組成,結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定,因此β-伴大豆球蛋白的致敏性相對穩(wěn)定。
目前已經(jīng)報道了很多用來降低蛋白質(zhì)的致敏性的食品加工方法[4-6],包括發(fā)酵、煎炸、烘烤等,主要是通過蛋白質(zhì)分子內(nèi)、分子間的共價鍵或非共價鍵相互作用,導(dǎo)致二級或三級結(jié)構(gòu)改變,從而影響蛋白質(zhì)的致敏性。糖基化反應(yīng)是在酶的作用下,蛋白質(zhì)的氨基和還原糖的羰基之間形成糖蛋白的過程[7]。在食品加工中糖基化反應(yīng)可能引起蛋白質(zhì)功能特性發(fā)生改變,并對蛋白質(zhì)具有一定的修飾作用,可修飾蛋白質(zhì)的抗原表位,從而影響蛋白質(zhì)的致敏性[8]。據(jù)報道,經(jīng)糖基化反應(yīng)后降低了花生過敏原的致敏性[9]。劉俊等將牛血清蛋白和α-乳白蛋白經(jīng)超聲波輔助糖基化處理后,發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)發(fā)生了改變,并降低了α-乳白蛋白的致敏性[10]。糖基化反應(yīng)中,蛋白質(zhì)的抗原表位發(fā)生了變化,從而影響蛋白質(zhì)的致敏性[11]。
目前,評價糖基化修飾對過敏原的影響,主要是通過酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測過敏原免疫活性,但這類方法缺乏嚴(yán)謹(jǐn)性,還有待進(jìn)一步完善。因此本研究選擇食品加工中常用的配料葡萄糖和β-伴大豆球蛋白,通過幾種典型的熱加工條件,制備β-伴大豆球蛋白的糖基化修飾產(chǎn)物,并進(jìn)行體內(nèi)動物實驗,探討加熱過程中葡萄糖對β-伴大豆球蛋白的糖基化修飾作用,以及對β-伴大豆球蛋白致敏性的影響,為通過食品加工方式降低蛋白致敏性奠定了一定理論基礎(chǔ)。
β-伴大豆球蛋白:自制;葡萄糖:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;霍亂毒素(cholera toxin,CT):美國 Sigma-Aldrich公司;組胺、免疫球蛋白(immunoglobulin E,IgE)、類胰蛋白酶試劑盒:南京建成有限公司。以上試劑均為分析純。
Milli-Q超純水儀:德國默克密理博公司;FE20K型PH計:瑞士梅特勒-托利多公司;5804R離心機(jī):美國Beckman公司;MS3渦旋混合器:德國IKA公司;SB-4200D超聲波清洗機(jī):中國新芝生物科技股份有限公司;BL610電子天平:德國Sartorius公司;UF-110烘箱:上海美墨爾特貿(mào)易有限公司;Evolution 300紫外分光光度計:美國Thermo公司;SBH200D/3干浴器:英國Stuart公司。
1.3.1 β-伴大豆球蛋白的制備
參考文獻(xiàn)[12]中方法對β-伴大豆球蛋白進(jìn)行分離及提純。
1.3.2 β-伴大豆球蛋白糖基化產(chǎn)物的制備
將50 mg純度為92.46%的β-伴大豆球蛋白加入10 mL磷酸鹽緩沖溶液,葡萄糖與β-伴大豆球蛋白的質(zhì)量比為4∶1,反應(yīng)的條件分別為低溫糖基化:70℃加熱8 h;蒸煮糖基化:100℃加熱30 min;高壓滅菌糖基化:121℃加熱15 min。所有條件下反應(yīng)后的糖基化產(chǎn)物需透析處理除掉游離糖等小分子。
1.3.3 免疫方法
雌性、4周齡、質(zhì)量在(20±5)g的BALB/c小鼠,飼養(yǎng)在溫度(25.5±2)℃和濕度70%的條件下。將50只小鼠,隨機(jī)分為5組,每組10只。第1周小鼠正常飲食,第2周開始,灌胃小鼠300 μL生理鹽水(空白組,n=10)、灌胃小鼠 300 μL β-伴大豆球蛋白(1 mg/mL)和霍亂毒素(CT)(0.01 mg/mL)混合液(過敏組,n=10)、灌胃小鼠300 μL低溫糖基化產(chǎn)物(1 mg/mL)和CT(0.01 mg/mL)混合液(低溫糖基化組,n=10)、灌胃小鼠300 μL 蒸煮糖基化產(chǎn)物(1 mg/mL)和 CT(0.01 mg/mL)混合液(蒸煮糖基化組,n=10)和灌胃小鼠300 μL高壓滅菌糖基化產(chǎn)物(1 mg/mL)和 CT(0.01 mg/mL)混合液(高壓滅菌糖基化組,n=10),以上灌胃的所有混合液溶劑均為生理鹽水。每周灌胃1次,第5次激發(fā),觀察過敏癥狀后,處死,取血清-80℃保存待測。
1.3.4 過敏癥狀評分
每組小鼠激發(fā)后30 min~50 min,仔細(xì)觀察小鼠的行為及體貌特征并依照表1中表述的內(nèi)容進(jìn)行評價[13]。
表1 小鼠過敏癥狀評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Scoring standard for allergic mouse symptoms
1.3.5 血清中組胺含量的測定
采用組胺含量測定試劑盒進(jìn)行測定。
1.3.6 血清中免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)含量的測定
采用IgE含量測定試劑盒試劑盒進(jìn)行測定。
1.3.7 血清中類胰蛋白酶含量的測定
采用類胰蛋白酶含量測定試劑盒進(jìn)行測定。
1.3.8 糖基化產(chǎn)物接枝度的測定
參照文獻(xiàn)[14]中的方法測定β-伴大豆球蛋白糖基化產(chǎn)物的接枝度。將2 mg/mL 200 μL β-伴大豆球蛋白糖基化產(chǎn)物溶液(溶劑為pH 7.4的磷酸鹽緩沖液)加入4 mL鄰苯二甲醛試劑,并在35℃下水浴2 min,用紫外分光光度計分別測其在340 nm處的吸光值??瞻坠芾锓謩e加入4 mL鄰苯二甲醛和200 μL磷酸鹽緩沖液。
接枝度(grafting degree,DG)計算公式如下。
式中:At為接枝物溶液的吸光值;A0為單一蛋白溶液在同一反應(yīng)條件下的吸光值。
1.3.9 糖基化產(chǎn)物內(nèi)源熒光性的測定
參照文獻(xiàn)[15]中的方法測定糖基化產(chǎn)物內(nèi)源熒光性。用磷酸鹽緩沖液溶解,配制成濃度為0.2 mg/mL的β-伴大豆球蛋白溶液。熒光儀參數(shù)設(shè)置激發(fā)波長為295 nm,掃描速度為60 nm/min。最終測定β-伴大豆球蛋白的熒光發(fā)射光譜范圍在300 nm~400 nm。
1.3.10 糖基化產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)的測定
分別準(zhǔn)確的稱取2mg的β-伴大豆球蛋白和150mg的溴化鉀,充分的研磨,再將研磨后的混合粉均勻的放于壓片機(jī)中,進(jìn)行紅外光譜掃描。以溴化鉀作為空白樣,充分研磨后放置壓片機(jī)中,再進(jìn)行紅外光譜掃描。紅外光譜分別進(jìn)行背景掃描和樣品掃描,參數(shù)設(shè)置掃描的波段為4 000 cm-1~1 000 cm-1、分辨率為4 cm-1。采用OMNIC 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。
每組試驗至少3次重復(fù),本試驗所有數(shù)據(jù)通過軟件SPSS 14.0中單因素ANOVA檢驗和Duncan test進(jìn)行分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±SD)表示,p<0.05表示有顯著差異,所用作圖軟件為Origin 9。
不同糖基化條件對小鼠過敏癥狀的影響,見圖1。
圖1 小鼠過敏癥狀評分Fig.1 Mouse allergy symptom score
如圖1所示,與空白組相比,過敏組的小鼠過敏癥狀評分極顯著升高;與過敏組相比,蒸煮糖基化組過敏癥狀評分顯著降低;與低溫糖基化組相比,高壓滅菌糖基化組過敏癥狀評分差異不顯著。空白組小鼠無異?,F(xiàn)象;過敏組小鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的口唇腫脹、毛發(fā)豎立、運(yùn)動活力下降等癥狀;低溫糖基化組中有部分小鼠出現(xiàn)運(yùn)動活力下降、毛發(fā)豎立、抓撓面部等癥狀;灌胃蒸煮糖基化產(chǎn)物和高壓滅菌糖基化產(chǎn)物小鼠過敏反應(yīng)癥狀不明顯,說明過敏反應(yīng)較弱。
不同糖基化條件對小鼠體重的影響,見圖2。
圖2 小鼠體重的測定Fig.2 Determination of mouse body weight
由圖2可知,與空白組相比,過敏組小鼠體重極顯著降低。與低溫糖基化組和蒸煮糖基化組相比,灌胃高壓滅菌糖基化產(chǎn)物的小鼠體重差異不顯著??赡苁且驗楣辔覆煌庸l件下糖基化產(chǎn)物的小鼠發(fā)生了不同程度的過敏反應(yīng),導(dǎo)致小鼠體重不同程度的降低[16]。結(jié)果表明,高壓滅菌糖基化組中的小鼠體重降低程度最小,過敏反應(yīng)程度最弱。
不同糖基化條件對小鼠血清中組胺含量的影響,見圖3。
圖3 小鼠血清中組胺含量測定Fig.3 Determination of histamine in mouse serum
如圖3所示,小鼠血清中組胺水平過敏組和低溫糖基化組相比,過敏組小鼠組胺含量顯著升高。與低溫糖基化組相比,蒸煮糖基化組和高壓滅菌糖基化組中的小鼠組胺含量差異不顯著。不同條件下的糖基化組中小鼠的組胺含量出現(xiàn)不同程度的降低可能是因為肥大細(xì)胞脫顆粒作用降低,因此減少了組胺的釋放[17]。結(jié)果表明,高壓滅菌糖基化組中小鼠的組胺含量最低,導(dǎo)致過敏反應(yīng)程度最弱。
不同糖基化條件對小鼠血清中IgE含量的影響,見圖4。
圖4 小鼠血清中IgE含量測定Fig.4 Determination of IgE in mouse serum
如圖4所示,與空白組相比,過敏組小鼠IgE含量極顯著升高。與低溫糖基化組相比,蒸煮糖基化組和高壓滅菌糖基化組的小鼠IgE含量差異不顯著。IgE含量是衡量過敏反應(yīng)程度的重要指標(biāo)[18]。結(jié)果表明,灌胃高壓滅菌糖基化產(chǎn)物的小鼠血清中IgE含量最低,導(dǎo)致小鼠的過敏反應(yīng)程度最弱。
不同糖基化條件對小鼠血清中類胰蛋白酶含量的影響見圖5。
圖5 小鼠血清中類胰蛋白酶含量測定Fig.5 Determination of tryptase content in mouse serum
如圖5所示,與空白組相比,過敏組小鼠的類胰蛋白酶含量極顯著升高。與過敏組相比,各糖基化組小鼠的血清中類胰蛋白酶含量均有不同程度的降低。與低溫糖基化組相比,灌胃高壓滅菌糖基化產(chǎn)物小鼠的類胰蛋白酶含量差異顯著。因為類胰蛋白酶含量是過敏患者血清中檢測的重要指標(biāo),可以一定程度上反應(yīng)過敏的程度[19],結(jié)果表明高壓滅菌組的小鼠類胰蛋白酶含量最低,過敏反應(yīng)程度最弱。
不同條件下的糖基化產(chǎn)物對接枝度的影響,見圖6。
圖6 糖基化產(chǎn)物接枝度測定Fig.6 Determination of the degree of grafting of glycosylation products
從圖6中可看出,β-伴大豆球蛋白與葡萄糖在低溫、蒸煮和高壓滅菌條件處理后的接枝度分別為10.46%、15.06%和35.17%。與低溫糖基化組相比,高壓滅菌糖基化組的接枝度極顯著升高。結(jié)果表明,隨著加工溫度的升高接枝度也呈顯著升高的趨勢,原因可能是β-伴大豆球蛋白是三聚糖蛋白,反應(yīng)溫度越高,導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)越容易發(fā)生改變[14]。由此表明,高壓滅菌糖基化產(chǎn)物的接枝度最高,從而導(dǎo)致蛋白致敏性最弱。
蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光性是通過測定生物大分子的熒光發(fā)色團(tuán),從而獲得生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能等信息。蛋白質(zhì)分子中能發(fā)射熒光的氨基酸主要有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸[20]。因此,通過內(nèi)源熒光光譜測定蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度,可以判斷蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變。不同條件下的糖基化產(chǎn)物對熒光強(qiáng)度的影響,見圖7。
圖7 糖基化產(chǎn)物內(nèi)源熒光性的測定Fig.7 Determination of endogenous fluorescence of glycosylation products
從圖7可以看出,與低溫糖基化產(chǎn)物比較,蒸煮糖基化和高壓滅菌糖基化產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度明顯降低。原因可能有以下幾種:1)熱處理后蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,色氨酸殘基埋藏到疏水的環(huán)境中[21];2)葡萄糖側(cè)鏈的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對色氨酸殘基具有屏蔽作用[22];3)色氨酸發(fā)生熒光淬滅[23];4)因為反應(yīng)溫度太高,蛋白質(zhì)分子迅速展開聚集,色氨酸殘基大量損失[24],導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降。結(jié)果說明,高壓滅菌糖基化產(chǎn)物熒光強(qiáng)度最低,導(dǎo)致蛋白致敏性最弱。
蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是肽鏈中有規(guī)則的重復(fù)的構(gòu)象,主要有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲[25]。不同條件下的糖基化產(chǎn)物對二級結(jié)構(gòu)的影響見表2。
從表2可以發(fā)現(xiàn),與蒸煮糖基化和高壓滅菌糖基化產(chǎn)物相比,低溫糖基化產(chǎn)物α-螺旋含量顯著降低。與低溫糖基化和蒸煮糖基化產(chǎn)物相比,高壓滅菌糖基化產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)中β-折疊和β-轉(zhuǎn)角的含量顯著降低,無規(guī)則卷曲的含量顯著增加。隨著反應(yīng)溫度的升高,蛋白質(zhì)中有序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成無序結(jié)構(gòu)。在糖基化反應(yīng)中蛋白質(zhì)與糖之間以共價鍵聚集,其中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角等通常情況下存在于肽鏈的內(nèi)部,熱處理后可能會導(dǎo)致二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[26]。結(jié)果表明,高壓滅菌糖基化產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)中β-折疊、β-轉(zhuǎn)角含量最低和無規(guī)則卷曲含量最高,導(dǎo)致蛋白致敏性最弱。
表2 糖基化產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)的測定Table 2 Determination of the secondary structure of glycosylation products
通過評估典型過敏指標(biāo)以及糖基化產(chǎn)物結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)與低溫糖基化產(chǎn)物和蒸煮糖基化產(chǎn)物相比,高壓滅菌糖基化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)變化最顯著,導(dǎo)致蛋白致敏性最弱。本研究評價了不同加工條件下β-伴大豆球蛋白糖基化產(chǎn)物的致敏性,為有效降低食品熱加工中大豆制品的致敏性提供重要的參考。