甜瓣子發(fā)酵過程細(xì)菌菌群與發(fā)酵過程的對應(yīng)關(guān)系分析

張小鳳，胡濤，于松峰，夏夢雷，鄭宇，*，石磊，萬守朋*，王敏

（1.食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗室，天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津市利民調(diào)料有限公司，天津 300308）

豆瓣辣椒醬味美色艷又營養(yǎng)豐富，是川菜烹調(diào)中必不可少的調(diào)味品，以蠶豆、辣椒、鹽、小麥粉為主要原料[1]。其中，甜瓣子是豆瓣辣椒醬的重要組成，是以蠶豆為原料，浸泡蒸煮后拌以小麥粉并接種米曲霉（Aspergillus oryzae）后進(jìn)行制曲，隨后拌以食鹽進(jìn)行3～6個月的甜瓣子發(fā)酵[2-4]。甜瓣子的品質(zhì)是決定豆瓣辣椒醬品質(zhì)的關(guān)鍵，甜瓣子在自然發(fā)酵過程中受到發(fā)酵條件、微生物組成等多種因素的影響[5]。甜瓣子發(fā)酵過程中參與的微生物種類眾多，主要有霉菌、酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌等微生物，在蛋白酶、淀粉酶等酶系作用下將原料中大分子物質(zhì)分解，并代謝產(chǎn)生多肽、氨基酸、有機(jī)酸和各種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[5-7]。有報道采用傳統(tǒng)分離方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)相結(jié)合的手段從中分離出8個屬的微生物菌群，其中細(xì)菌主要為Bacillus屬、Lactobacillus屬、Weissella屬、Staphylococcus屬，優(yōu)勢細(xì)菌芽孢桿菌在發(fā)酵體系中具有豐富的類群，主要包括枯草芽孢桿菌（B.subtili）、解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefacuens）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B.methylotrophicus）等；真菌主要為 Aspergillus屬、Lichtheimia 屬、Zygosaccharomyces屬、Yarrowia屬，發(fā)酵過程中細(xì)菌濃度高于真菌[8]。微生物組成、鹽度和發(fā)酵模式等因素對產(chǎn)品品質(zhì)有很大影響，利用高效乳酸菌和米曲霉強(qiáng)化甜瓣子發(fā)酵，提高了甜瓣子風(fēng)味物質(zhì)含量，使終產(chǎn)品質(zhì)量有明顯提升[9-10]。鹽度對甜瓣子中總酸、氨基酸態(tài)氮和還原糖等成分有著顯著影響，12%鹽度下發(fā)酵甜瓣子感官品質(zhì)最佳，另外，采用先低鹽后高鹽、先低溫后高溫的分段發(fā)酵模式進(jìn)行甜瓣子發(fā)酵，可使產(chǎn)品品質(zhì)有明顯提高[11]。

以往研究更多關(guān)注甜瓣子發(fā)酵微生物組成，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)、非傳統(tǒng)培養(yǎng)及高通量測序的方法研究了不同醬類的細(xì)菌群落演替規(guī)律及風(fēng)味物質(zhì)組成[12-18]，但對甜瓣子發(fā)酵過程中微生物群落演替及其與發(fā)酵條件之間的關(guān)系認(rèn)識不夠深入。本研究利用高通量測序技術(shù)解析豆瓣辣椒醬甜瓣子發(fā)酵過程中細(xì)菌群落與發(fā)酵過程的對應(yīng)關(guān)系，挖掘甜瓣子發(fā)酵過程中核心功能性微生物，可以為傳統(tǒng)甜瓣子發(fā)酵過程和品質(zhì)管理提供理論依據(jù)，從而進(jìn)一步保障豆瓣辣椒醬品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集生產(chǎn)車間蠶豆曲發(fā)酵 0、7、60、120、240 d 的樣品，樣品依次標(biāo)記為T1～T5。自發(fā)酵池表面30 cm處五點(diǎn)法取樣，混勻后裝入無菌瓶中，放入冰盒中立即送往實(shí)驗室保存于4℃。每個發(fā)酵時間樣品取自3個發(fā)酵池，作為平行樣品。

DuGreen 核酸染料、6×DNA Loading dye：寶日醫(yī)生物工程（大連）有限公司；深加工食品DNA提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

微量紫外分光光度計（UVmini-1240）：日本島津儀器有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（5331）：德國 Eppendorf公司；凝膠成像儀（Gel Doc XR+）：美國BioRad公司；氣-質(zhì)聯(lián)用分析儀 （gas chromatography-mass spectroscopy，GC-MS）[6890N-5973，配有電噴霧離子源（electrospray ion source，ESI Source） 及 NIST（national institute of standards and technology）譜庫]：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 蠶豆曲發(fā)酵過程主要參數(shù)分析

稱取約5.0 g已研磨均勻的樣品置于100 mL小燒杯中，加去離子水?dāng)嚢杈鶆蚝蠖ㄈ葜?00 mL，備用。參照GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中相應(yīng)的規(guī)定對不同發(fā)酵階段樣品中的總酸、氨基酸態(tài)氮、pH值、鹽度、還原糖和水分進(jìn)行測定，采用DNS法測定樣品中的還原糖含量[19]。

1.3.2 蠶豆曲發(fā)酵過程中細(xì)菌群落組成分析

樣品預(yù)處理：取蠶豆曲發(fā)酵樣品10.0 g，放入50 mL的無菌離心管中，加入一定量的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）無菌水，漩渦振蕩后，8 000 r/min 離心10 min，棄上清液，用PBS洗滌沉淀，8 000 r/min離心15 min，棄上清液，收集菌體[20]。采用深加工食品DNA提取試劑盒按照說明書流程提取蠶豆曲發(fā)酵樣品基因組。

將細(xì)菌基因組，送金唯智基因公司測序，選擇相對豐度大于1%的主要微生物進(jìn)行分析，利用SILVA 123數(shù)據(jù)庫對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析，選擇同源性最高的菌種屬來解析微生物群落組成。根據(jù)測序與比對分析結(jié)果，計算微生物的多樣性指數(shù)，物種優(yōu)勢度-Berger-Parker（d）、物種豐富度-Margalef（dMa）、物種多樣性-Simpson（D）、群落多樣性-Shannon（H′）、群落的均勻程度-Pielou（Je）。

1.4 發(fā)酵條件與主要功能微生物之間的對應(yīng)關(guān)系分析

本研究分別采用典范對應(yīng)分析（canonical correspondence analysis，CCA）和 Person相關(guān)性檢驗，以發(fā)酵參數(shù)（pH值、總酸、氨基酸態(tài)氮、還原糖、鹽度、水分）為環(huán)境變量，研究微生物與環(huán)境因素之間的對應(yīng)關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓣子發(fā)酵過程主要理化參數(shù)變化規(guī)律

甜瓣子發(fā)酵過程中pH值、總酸、氨基酸態(tài)氮、還原糖、鹽度和水分的發(fā)酵過程曲線如圖1所示。

圖1 甜瓣子發(fā)酵過程曲線Fig.1 The time curves of Tianbanzi fermentation

甜瓣子的品質(zhì)影響著最終豆瓣辣椒醬的品質(zhì)的優(yōu)劣。氨基酸態(tài)氮是是衡量營養(yǎng)價值的一項重要指標(biāo)，也影響甜瓣子發(fā)酵品質(zhì)的一個重要參數(shù)[21]。如圖1所示，由于蠶豆中蛋白質(zhì)等物質(zhì)的水解，在甜瓣子發(fā)酵過程中其含量快速增加，隨后呈下降趨勢。在發(fā)酵前期蛋白質(zhì)會降解成多肽、氨基酸等物質(zhì)，在發(fā)酵中期和后期這些多肽和氨基酸與糖類等其它物質(zhì)發(fā)生復(fù)雜的生化反應(yīng)，從而形成各種風(fēng)味物質(zhì)。在此期間淀粉類物質(zhì)也會分解成小分子糖類等。還原糖等糖類物質(zhì)不僅是發(fā)酵過程微生物生長所需的碳源，也對蠶豆曲發(fā)酵及產(chǎn)品的色香味有重要影響。還原糖在發(fā)酵60 d時含量達(dá)到最高為（1.312±0.022）g/100 g，其后略有下降。總酸是甜瓣子發(fā)酵過程中一個重要指標(biāo)，適度的酸度，能增加產(chǎn)品風(fēng)味，產(chǎn)生爽口的感覺[22]，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，總酸的含量逐漸增加。發(fā)酵過程中乳酸菌等微生物可以發(fā)酵蠶豆曲中碳水化合物、脂肪等，產(chǎn)生乳酸、乙酸等小分子有機(jī)酸，使得總酸增加和pH值下降[23]。食鹽是生產(chǎn)豆瓣醬的重要原料之一，能與氨基酸共同呈鮮味，并且較高濃度的食鹽可以在一定程度上減少雜菌的污染，維持某些耐鹽菌的生長環(huán)境，并增加產(chǎn)品的風(fēng)味[5，11，18]。從圖 1 可以看出，成曲食鹽含量為（0.740 0±0.320 5）g/100 g，加入鹽水后保持在 11 g/100 g～13 g/100 g。圖1中還原糖、水分等部分指標(biāo)在發(fā)酵中后期誤差較大，其原因主要是由于甜瓣子采用自然發(fā)酵工藝，不同發(fā)酵池的3個平行樣品之間的誤差偏大，這也是許多傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)中存在的普遍現(xiàn)象。

2.2 發(fā)酵過程細(xì)菌群落分析

甜瓣子發(fā)酵過程細(xì)菌菌群組成分析結(jié)果如圖2所示。

圖2 甜瓣子發(fā)酵過程中細(xì)菌群落組成分析Fig.2 Composition of bacterial community during Tianbanzi fermentation

發(fā)酵初期（0 d）細(xì)菌相對濃度較高。乳酸菌是主要的微生物，主要有 La.plantarum、W.viridescens、W.diestrammenae、Le.citreum、La.siliginis等，其相對豐度分別達(dá)到10.35%、8.91%、4.99%、7.35%和10.65%。La.acidifarinae和T.halophilus同樣在發(fā)酵初期就存在，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行，其相對豐度呈先升高后降低的趨勢，且在發(fā)酵中期（60 d）時達(dá)到最高分別為12.79%和10.03%。E.faecium是到發(fā)酵中期（60 d）時才出現(xiàn)，其豐度隨后呈降低趨勢。除此之外，甜瓣子發(fā)酵過程的優(yōu)勢菌還有 B.ginsengihumi、B.amyloliquefaciens、B.atrophaeus、A.lipolyticus等，這些細(xì)菌一直伴隨于甜瓣子整個發(fā)酵過程中，并且具有較高的豐度。在發(fā)酵初期，細(xì)菌的濃度和種類較多，隨著鹽水的加入（圖1），多數(shù)細(xì)菌不適應(yīng)此類高鹽條件而死亡，同時發(fā)酵過程酸度逐漸增加，因此發(fā)酵后期細(xì)菌的濃度低于發(fā)酵初期，此結(jié)果與他人報道的結(jié)果一致[11，13，24]。細(xì)菌群落組成多樣性分析見圖3。

圖3 細(xì)菌群落組成多樣性分析Fig.3 Diversity analysis of bacterial community

進(jìn)一步，對甜瓣子發(fā)酵過程細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行了分析，由圖3可知，物種優(yōu)勢度指數(shù)（d）和物種豐富度指數(shù)（dMa）在發(fā)酵過程中呈先降低后升高的趨勢。物種多樣性指數(shù)（H′）和物種豐富度指數(shù)（dMa）變化趨勢相同，甜瓣子發(fā)酵過程中主要為乳酸菌和芽孢桿菌屬，其種類和數(shù)量先減少后增加，物種多樣性指數(shù)（H′）和豐富度指數(shù)（dMa）先降低后升高。成曲（發(fā)酵0 d）的物種多樣性指數(shù)（D）最高，這與成曲所在的環(huán)境有關(guān)，而物種均勻度指數(shù)（Je）在發(fā)酵過程差異不大。

2.3 甜瓣子發(fā)酵過程主要細(xì)菌演替機(jī)制分析

傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)多以經(jīng)驗為主，然而發(fā)酵過程與復(fù)雜的微生物群落結(jié)構(gòu)有很強(qiáng)的相關(guān)性?；谧罱⑸锷鷳B(tài)學(xué)研究進(jìn)展的啟發(fā)，采用典范對應(yīng)分析（CCA）結(jié)合Person相關(guān)性檢驗的方法探討甜瓣子發(fā)酵過程中細(xì)菌群落與發(fā)酵環(huán)境之間的關(guān)系。典范對應(yīng)分析甜瓣子發(fā)酵過程與細(xì)菌群落組成的關(guān)系見圖4。

如圖4所示，兩軸共解釋了92.6%的變量，每個參數(shù)箭頭的長短代表各因素影響的大小。在起始發(fā)酵（0 d）時期，pH值與Weissella和Lactobacillus表現(xiàn)出顯著的正相關(guān)性，但在發(fā)酵后期（120、240 d）與Weissella和Lactobacillus負(fù)相關(guān)。而氨基酸態(tài)氮、總酸和還原糖等參數(shù)在起始發(fā)酵時期與Bacillus、Leuconostoc、Tetragenococcus和Staphylococcus呈負(fù)相關(guān)，但在發(fā)酵后期卻與這些微生物呈正相關(guān)。鹽度和水分與Bacillus、Leuconostoc和Tetragenococcus之間具有較高的相關(guān)性，由于Bacillus和Tetragenococcus較強(qiáng)的耐鹽能力，存在于整個發(fā)酵過程，該結(jié)果與其他高鹽醬類產(chǎn)品的結(jié)果一致[11，25-26]。La.plantarum、La.acidifarinae、Le.citreum、T.halophilus等乳酸菌是發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌，CCA分析結(jié)果表明，還原糖和氨基酸態(tài)氮與這些微生物相關(guān)性較高。在傳統(tǒng)食品發(fā)酵過程中，乳酸菌能夠產(chǎn)生有機(jī)酸、丁二酮和細(xì)菌素等，具有抑制致病菌和腐敗菌的作用，對產(chǎn)品風(fēng)味，以及維持產(chǎn)品的色澤等具有重要作用[27-29]。結(jié)合甜瓣子發(fā)酵過程動態(tài)曲線可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，總酸含量升高及pH值下降，T.halophila相對豐度在發(fā)酵中期較高，推測其豐度的變化與總酸和pH值變化有關(guān)。K.oxytoca、La.plantarum、W.viridescens和B.ginsengihumi等微生物隨著發(fā)酵時間的增長而有減少的趨勢，說明這些微生物在高鹽環(huán)境下的生長受到抑制。

圖4 甜瓣子發(fā)酵過程與細(xì)菌群落組成的典范對應(yīng)關(guān)系分析Fig.4 Canonical correspondence analysis between fermentation process and bacteria compositions of Tianbanzi

甜瓣子發(fā)酵過程中主要細(xì)菌與發(fā)酵環(huán)境之間的Person相關(guān)性系數(shù)見表1。

甜瓣子發(fā)酵過程中主要細(xì)菌與發(fā)酵環(huán)境之間的Person相關(guān)性系數(shù)見表1，Person相關(guān)性檢驗表明，鹽度、水分、氨基酸態(tài)氮、總酸和還原糖等主要與Leuconostoc、Tetragenococcus、Bacillus、Klebsiella 和 Staphylococcus的相對豐度呈正相關(guān)，而與Lactobacillus和Weissella呈負(fù)相關(guān)，該結(jié)果也與CCA分析結(jié)果一致（圖4）。pH值與微生物之間的相關(guān)性表現(xiàn)出與鹽度、氨基酸態(tài)氮、總酸和還原糖相反的結(jié)果。Tetragenococcus是一種耐鹽細(xì)菌，在其他傳統(tǒng)發(fā)酵食品也被檢測到。在醬油的發(fā)酵過程中，Lactobacillus、Tetragenococcus 和Weissella均屬于優(yōu)勢菌群，在發(fā)酵過程產(chǎn)生有機(jī)酸，調(diào)節(jié)發(fā)酵體系的pH值，與總酸增加及pH值的下降相關(guān)，并且這些乳酸菌還賦予了產(chǎn)品良好的功能和風(fēng)味[30]。

表1 甜瓣子發(fā)酵過程中主要細(xì)菌與發(fā)酵環(huán)境之間的Person相關(guān)性系數(shù)Table 1 Pearson′s correlation coefficients between dominant bacterial and fermentation conditions during Tianbanzi fermentation process

3 結(jié)論

豆瓣辣椒醬甜瓣子發(fā)酵2個月的樣品中還原糖及氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最高，與微生物旺盛的代謝活動有關(guān)。乳酸菌以及芽孢桿菌屬是豆瓣辣椒醬甜瓣子發(fā)酵過程主要的細(xì)菌。發(fā)酵過程中，pH值、鹽度、氨基酸態(tài)氮、總酸和還原糖等發(fā)酵條件與Lactobacillus、Leuconostoc、Tetragenococcus、Bacillus、Klebsiella 和 Weissella具有較高的相關(guān)性，說明這些細(xì)菌是發(fā)酵過程中的主要功能微生物，它們對發(fā)酵過程和產(chǎn)品風(fēng)味的影響及其作用機(jī)制將是今后研究的重點(diǎn)。