張友冬

摘 要 目的：驗(yàn)證總有機(jī)碳法測(cè)定鹽酸林可霉素清潔殘留物的準(zhǔn)確性。方法：根據(jù)總有機(jī)碳法中測(cè)定值與濃度正相關(guān)的特性來(lái)判定林可霉素殘留量。結(jié)果：該檢驗(yàn)方法在0.5～2.0 μg/ml濃度范圍有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 6，檢測(cè)限與定量限分別為0.504 9 和1.530 3 μg/ml，最低擦拭回收率為73.5%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確，適合林可霉素注射液生產(chǎn)結(jié)束清潔后殘留量的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 總有機(jī)碳法 林可霉素 清潔殘留 驗(yàn)證 方法學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)：R951 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2021）09-0067-04

Determination of lincomycin hydrochloride residue in cleaning verification by TOC method

ZHANG Youdong*

（Shanghai Sine-Jinzhu Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 201506， China）

ABSTRACT Objective： To validate the accuracy of determination of lincomycin hydrochloride residue after cleaning by total organic carbon （TOC） method. Methods： The residue concentrations were determined based on the positive correlation between the measured value and the concentration in the TOC method. Results： A good linear relationship was shown when lincomycin hydrochloride concentrations were in the range of 0.5-2.0 mg/ml， with correlation coefficient R2=0.998 6. The limits of detection and quantification were 0.504 9 and 1.530 3 mg/ml， with minimum wipe recovery rate 73.5%. Conclusion： This method is simple， quick and accurate and is suitable for the detection of the cleaning residue after lincomycin hydrochloride production.

KEy WORDS total organic carbon method； lincomycin hydrochloride； cleaning residue； validation； methodology

藥品的生產(chǎn)過(guò)程中，由于不同產(chǎn)品共用一條生產(chǎn)線，因此在更換產(chǎn)品時(shí)如不注意極易造成微量交叉污染，需要對(duì)生產(chǎn)條線重新進(jìn)行清潔驗(yàn)證，其前提是需要有合適的方法對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行檢驗(yàn)，即檢驗(yàn)分析方法學(xué)驗(yàn)證。在我們的生產(chǎn)線上，根據(jù)產(chǎn)品清潔的難易程度及綜合溶解度和濃度檢測(cè)[1]，發(fā)現(xiàn)鹽酸林可霉素是最難清潔的殘留藥物。按照清潔驗(yàn)證分別采用MTDD法、10 ppm法和LD50法[2]進(jìn)行計(jì)算，選擇最低殘留濃度為≤1.72 mg/ml，在此殘留濃度下我們通過(guò)HPLC方法測(cè)試，無(wú)法滿(mǎn)足方法學(xué)驗(yàn)證要求，通過(guò)對(duì)總有機(jī)碳（TOC）法測(cè)定林可霉素殘留物的分析方法驗(yàn)證開(kāi)發(fā)[3]，以保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

1 材料和方法

1.1 儀器

HTY-DI1500總有機(jī)碳分析儀（浙江泰林生物技術(shù)有限公司）；BASA124S分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)130432-201911）、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)111507-201704）和1，4-對(duì)苯醌標(biāo)準(zhǔn)品（101197-201904）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.3 方法

根據(jù)《藥品生產(chǎn)驗(yàn)證指南》采用10 ppm法，以日治療量的1/1 000及基于毒性半數(shù)致死量確認(rèn)最低殘留檢測(cè)限度為1.72 mg/ml，用鹽酸林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品（以C18H37N5O9計(jì)）配制成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用總有機(jī)碳（TOC）測(cè)試儀檢測(cè)不同濃度溶液所對(duì)應(yīng)的TOC響應(yīng)值，將所測(cè)得的TOC響應(yīng)值和鹽酸林可霉素濃度關(guān)系式建立TOC測(cè)定值與鹽酸林可霉素含量之間的線性關(guān)系[4-8]。

1.3.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

使用蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品（111507-201704）配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，作為易氧化的有機(jī)物，并測(cè)定其響應(yīng)值（Rs）。使用1，4-對(duì)苯醌標(biāo)準(zhǔn)品（101197-201904）配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的1，4-對(duì)苯醌標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為系統(tǒng)適用性難氧化的有機(jī)化合物，并測(cè)定其響應(yīng)值（Rss）。同時(shí)測(cè)定用于配制兩瓶標(biāo)準(zhǔn)溶液的空白試劑注射用水的響應(yīng)值（Rw）。當(dāng)響應(yīng)效率R=（Rss-Rw）/（Rs-Rw）×100%達(dá)到85%～115%，則符合要求。

1.3.2 鹽酸林可霉素的校準(zhǔn)曲線

用注射用水配制鹽酸林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品母液的質(zhì)量濃度為100 mg/ml，然后稀釋成系列供試液，測(cè)定每種濃度的溶液總有機(jī)碳值，并將林可霉素溶液濃度為橫坐標(biāo)、總有機(jī)碳值為縱坐標(biāo)作線性圖。

1.3.3 擦拭回收率

稱(chēng)取林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量，用注射用水分別配制成質(zhì)量濃度為68.8、86.0、103.2 mg/ml的鹽酸林可霉素溶液。

分別精密量取上述溶液1.0 ml，均勻涂布在劃有多個(gè)與設(shè)備表面材質(zhì)相同的10 cm×10 cm方塊的不銹鋼板上，每種濃度各涂3塊，于40 ℃恒溫干燥箱中烘干6 h后取出，放冷。用潤(rùn)濕的棉簽用力且平穩(wěn)緩慢地逐一擦拭10 cm×10 cm方塊的不銹鋼板表面，在向前移動(dòng)的同時(shí)將其從一邊移到另一邊并覆蓋整個(gè)表面，翻轉(zhuǎn)棉簽頭，將棉簽頭的另一面也在10 cm×10 cm方塊的不銹鋼板表面上與前次方向垂直擦拭整個(gè)表面（圖1）。擦拭完后將棉簽頭小心剪下，分別置50 ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

1.3.4 準(zhǔn)確度

分別精密量取上述68.8、86.0、103.2 mg/ml三種濃度的林可霉素溶液1.0 ml各3份，置于50 ml量瓶中，用注射用水稀釋至刻度，搖勻。按照TOC測(cè)試儀操作規(guī)程，測(cè)試低、中、高3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品的TOC值。

1.3.5 精密度

精密量取上述86.0 mg/ml的鹽酸林可霉素溶液5 ml置于250 ml量瓶中，用注射用水稀釋至刻度，搖勻。按照TOC測(cè)試儀操作規(guī)程，連續(xù)測(cè)試?yán)碚摑舛葹?.72 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品6次，記錄TOC值。

2 結(jié)果

2.1 儀器性能確認(rèn)

系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明0.5 mg/L蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液與1，4-對(duì)苯醌標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)效率分別為98.9%與98.6%，符合響應(yīng)效率R達(dá)到85%～115%要求（表1）。

2.2 鹽酸林可霉素的校準(zhǔn)曲線

采用TOC法測(cè)定不同濃度下的鹽酸林可霉素溶液總有機(jī)碳值，將表2數(shù)據(jù)經(jīng)線性回歸分析，其回歸方程y=0.356 8x+0.054 6，R2=0.998 6，相關(guān)系數(shù)R2>0.98[2]。檢測(cè)限：LOD=3.3 SD/B；定量限：LOQ=10 SD/B（SD為校正曲線的截距作為標(biāo)準(zhǔn)差；B為校正曲線的斜率）[3]。通過(guò)計(jì)算得出檢測(cè)限和定量限分別為0.504 9和1.530 3 mg/ml，表明這兩者均低于鹽酸林可霉素注射液實(shí)際殘留檢測(cè)限度。

按照TOC測(cè)試儀操作規(guī)程，測(cè)試供試品的TOC值。由于配制鹽酸林可霉素溶液含有試劑空白水和鹽酸林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品中的有機(jī)雜質(zhì)，所以直接用線性關(guān)系式計(jì)算鹽酸林可霉素濃度，棉簽、鋼板、試管、及鹽酸林可霉素中有機(jī)雜質(zhì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于空白試劑注射用水的TOC值，故忽略不計(jì)。當(dāng)y=0時(shí)，x=0.153 mg/L即為標(biāo)準(zhǔn)溶液配制背景TOC含量，來(lái)源于空白試劑水及鹽酸林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品中有機(jī)雜質(zhì)。

2.3 擦拭回收率

考察了在三種濃度下TOC測(cè)試值與理論濃度的回收率，結(jié)果證實(shí)本方法的回收率較高（表3），能夠滿(mǎn)足回收率>50%且RSD<20%的要求。

2.4 準(zhǔn)確度

選擇3種不同濃度的樣品進(jìn)行測(cè)試，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定鹽酸林可霉素含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠滿(mǎn)足準(zhǔn)確度RSD≤1%的要求（表4）。

2.5 精密度

選擇理論殘留限度作為精密度濃度的測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)，平行測(cè)定6次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RSD為1.23%，符合準(zhǔn)確度RSD≤2%驗(yàn)證檢驗(yàn)要求（表5）。

3 討論

鹽酸林可霉素（以C18H37N5O9計(jì)）分子量為461.02，其含碳百分比為46.85%，TOC可以在一個(gè)很高的靈敏度條件下檢測(cè)總有機(jī)碳。TOC分析儀可以檢測(cè)所有的有機(jī)殘留，包括培養(yǎng)基和淸洗工藝中的降解物質(zhì)。由于TOC檢測(cè)的是所有有機(jī)成分，很難區(qū)分檢測(cè)的物質(zhì)是產(chǎn)品有機(jī)殘留還是其他有機(jī)混合物，所以，TOC方法代表的是“最差情況”；另一方面，在取樣和測(cè)試的過(guò)程中也有可能會(huì)引入污染物，所以所有的取樣人員必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的培訓(xùn)并掌握淸洗取樣的技術(shù)，尤其要注意取樣工具不要對(duì)檢測(cè)結(jié)果帶來(lái)干擾。本研究建立的這種非特定方法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、且對(duì)多成分化合物有效，缺點(diǎn)是缺乏識(shí)別具體分析物的專(zhuān)屬性、測(cè)定結(jié)果可受其他殘留物的干擾；文獻(xiàn)報(bào)道的一些特定方法（高效液相法、滴定法）靈敏度高、能用于相關(guān)化合物的定量測(cè)定，但其缺點(diǎn)是不能檢查更大范圍的化合物、研究成本高、結(jié)果也可能受殘留物干擾[9]。

參考文獻(xiàn)

[1] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部令第79號(hào). 藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010年修訂）[EB/OL]. （2011-01-17）[2020-05-19]. http：//www.gov.cn/gongbao/content/2011/content_1907093. htm.

[2] 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品安全監(jiān)管司， 藥品認(rèn)證管理中心. 藥品生產(chǎn)驗(yàn)證指南[M]. 北京： 化學(xué)工業(yè)出版社， 2003： 195-208.

[3] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典2015年版四部[M]. 北京： 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 2015： 85； 374-377.

[4] 羅佳， 周曉龍， 王春民， 等. 超高效液相-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè)定蜂蜜中的林可霉素殘留[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志， 2019， 29（13）： 1551-1552； 1563.

[5] 王雅娟. 禽組織、禽蛋及豬肉中大觀霉素和林可霉素殘留氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法的研究[D]. 揚(yáng)州： 揚(yáng)州大學(xué)， 2019.

[6] 阮祥春， 曾明華， 趙明. HPLC-ESI-MS/MS檢測(cè)蜂蜜中林可霉素殘留[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009， 37（5）： 1889-1891.

[7] 趙明. 蜂蜜中林可霉素殘留檢測(cè)方法的研究[D]. 合肥： 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2008.

[8] Sin DW， Wong YC， Ip AC. Quantitative analysis of lincomycin in animal tissues and bovine milk by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. J Pharm Biomed Anal， 2004， 34（3）： 651-659.

[9] 何國(guó)強(qiáng). 制藥工藝驗(yàn)證實(shí)施手冊(cè)[M]. 北京： 化學(xué)工業(yè)出版社， 2012： 245.