梁建梅，劉曉旭，盧雪景，秦麗欣，王亞凡

(石家莊市婦幼保健院，石家莊 050051)

宮頸癌是常見婦科惡性腫瘤之一，由于宮頸癌早期癥狀不明顯，多數(shù)患者在確診時(shí)已是晚期，嚴(yán)重威脅女性健康[1]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，大多數(shù)早期宮頸癌患者預(yù)后有了很大的改善，然而晚期宮頸癌患者仍具有較低的5年生存率，主要原因是治療后復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移性疾病的存在[2]。因此準(zhǔn)確評(píng)估宮頸癌患者預(yù)后、減少?gòu)?fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是降低宮頸癌死亡率的關(guān)鍵措施。FIGO分期、腫瘤病理特征等能夠反映患者嚴(yán)重程度，對(duì)判斷患者預(yù)后程度有一定幫助，然而準(zhǔn)確率不高，且只有當(dāng)患者出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)才會(huì)進(jìn)行病理學(xué)檢查，此時(shí)患者可能已處于癌癥晚期，而臨床分期的判斷易受主觀和經(jīng)驗(yàn)的影響[3]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，與預(yù)后有關(guān)的分子標(biāo)志物已被研究和使用[4-5]。拓?fù)洚悩?gòu)酶IIA(Topoisomerase II A，TOP2A)是一種基因編碼DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IIAα，能夠控制和改變轉(zhuǎn)錄過程中DNA拓?fù)錉顟B(tài)的酶，與DNA復(fù)制、染色體分離及染色體濃縮等細(xì)胞生物學(xué)過程有關(guān)[6]。研究表明TOP2A可能是宮頸癌潛在的癌基因及預(yù)后的生物標(biāo)志物[7]。根據(jù)組織分型宮頸癌可分為鱗狀細(xì)胞癌和腺癌，其中宮頸鱗癌占多數(shù)。本研究通過分析TOP2A在宮頸鱗癌患者中的表達(dá)情況，探討其與患者臨床病理特征和預(yù)后之間的關(guān)系，可能為宮頸鱗癌預(yù)后發(fā)生分子機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

收集2014年2月至2016年9月在本院宮頸活檢或手術(shù)中取得的宮頸鱗癌組織標(biāo)本74例，選取同期在本院進(jìn)行宮頸活檢并經(jīng)病理證實(shí)正常的宮頸組織標(biāo)本53例為對(duì)照組。

宮頸鱗癌組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有標(biāo)本均經(jīng)組織病理學(xué)確診為宮頸鱗癌；(2)患者術(shù)前未進(jìn)行放、化療等一些抗腫瘤手段治療；(3)臨床資料完整；(4)同意參與本次研究且簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有心、肝、腎等重大疾病者；(2)患有自身免疫性疾病者；(3)患有精神疾病患者；(4)合并其他惡性腫瘤患者。

本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、主要試劑及儀器

RNA提取試劑盒(貨號(hào)DP431，北京天根生化科技)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)RR047A)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(貨號(hào)RR820B)(Takara，日本)，兔抗人TOP2A單克隆抗體(ab52934)、羊抗兔二抗IgG(ab150077)(上海艾博抗)；qRT-PCR儀(CFX96，BIO-RAD，美國(guó))，Nanodrop one 2000分光光度計(jì)(賽默飛世爾科技)。

三、研究方法

1.qRT-PCR檢測(cè)組織中TOP2A mRNA表達(dá)水平：利用RNA提取試劑盒對(duì)所有宮頸組織RNA進(jìn)行提??；對(duì)所提取RNA濃度進(jìn)行測(cè)定，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(qRT-PCR)對(duì)TOP2A mRNA進(jìn)行擴(kuò)增(引物見表1，上海生工生物工程合成)，循環(huán)條件為：95℃ 45 s；95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算組織中TOP2A mRNA的相對(duì)表達(dá)量。嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

表1 qRT-PCR引物序列

2.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)組織蛋白TOP2A的表達(dá)：宮頸組織常規(guī)石蠟包埋，石蠟標(biāo)本脫蠟至水，修復(fù)抗原，室溫進(jìn)行封閉后，加入兔抗人TOP2A(稀釋比1∶500)，4℃孵育過夜；加入羊抗兔二抗IgG(稀釋比1∶1 000)，37℃孵育1 h，利用DAB染色試劑盒進(jìn)行染色，蘇木素復(fù)染，酸酒精進(jìn)行短暫分化，之后進(jìn)行脫水、透明及封片。

以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒為陽(yáng)性。由3名資深病理醫(yī)師利用雙盲法對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞0分，陽(yáng)性細(xì)胞占比<25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，占比>75%為4分；染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)染色0分，淺黃色1分，黃褐色2分，棕褐色3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比及染色強(qiáng)度評(píng)分乘積即為染色指數(shù)(Staining index，SI)。以SI≤3分為陰性，SI>3分為陽(yáng)性。

3.患者隨訪：通過電話、電子通訊或門診復(fù)查等方式對(duì)宮頸癌患者出院5年內(nèi)進(jìn)行隨訪，記錄患者生存狀態(tài)。隨訪時(shí)間以患者出院日開始，隨訪時(shí)間截止于2020年6月30日。以患者死亡作為終點(diǎn)事件，患者生存日期為患者死亡日或末次隨訪截止日期。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者一般資料

本研究納入宮頸鱗癌組患者74例，同期正常宮頸患者53例。宮頸鱗癌組患者年齡為32～68歲，平均年齡(47.53±6.81)歲；對(duì)照組患者年齡為31～67歲，平均年齡(46.88±5.92)歲。兩組患者年齡比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)[8]對(duì)宮頸鱗癌患者進(jìn)行臨床分期，其中Ⅰ期25例、Ⅱ期32例、Ⅲ期17例；對(duì)宮頸鱗癌患者進(jìn)行組織分級(jí)，其中低分化13例、中分化36例、高分化25例；浸潤(rùn)程度以腫瘤浸潤(rùn)子宮頸肌層≤1/2為淺層浸潤(rùn)、>1/2為深層浸潤(rùn)，其中淺層浸潤(rùn)患者32例，深層浸潤(rùn)患者42例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者16例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者58例。

二、宮頸組織中TOP2A mRNA表達(dá)水平分析

宮頸鱗癌組TOP2A mRNA相對(duì)表達(dá)水平為(1.84±0.16)，對(duì)照組為(1.02±0.02)。與對(duì)照組比較，宮頸鱗癌組TOP2A mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(圖1)。

與對(duì)照組比較，*P<0.05圖1 宮頸組織TOP2A mRNA表達(dá)情況

三、宮頸組織中TOP2A蛋白表達(dá)水平分析

宮頸鱗癌組TOP2A蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為78.4%，對(duì)照組TOP2A蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為17.0%。與對(duì)照組比較，宮頸鱗癌組蛋白TOP2A陽(yáng)性表達(dá)率顯著增加(P<0.05)(表2、圖2)。

圖2 宮頸組織中TOP2A蛋白表達(dá)(免疫組化染色 ×400)

表2 宮頸組織中TOP2A蛋白表達(dá)水平[(-±s)，n(%)]

四、TOP2A蛋白表達(dá)與宮頸鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系

FIGO分期Ⅱ～Ⅲ期宮頸鱗癌組織TOP2A陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于FIGO分期Ⅰ期組織(P<0.05)；深肌層浸潤(rùn)宮頸鱗癌組織TOP2A陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于低肌層浸潤(rùn)組織(P<0.05)(表3)。

表3 TOP2A表達(dá)水平與宮頸鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系

五、TOP2A蛋白表達(dá)與宮頸鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系

對(duì)宮頸鱗癌患者進(jìn)行隨訪，5年內(nèi)共有39例患者死亡，生存率為47.3%。TOP2A陽(yáng)性表達(dá)組患者58例，陰性表達(dá)患者16例，Kaplan-Meier法生存曲線分析結(jié)果表明，TOP2A陽(yáng)性表達(dá)組患者5年內(nèi)生存率(39.7%)低于陰性表達(dá)組(75.0%)(圖3)。

圖3 TOP2A蛋白表達(dá)與宮頸鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系

六、COX回歸分析影響宮頸鱗癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素

單因素COX分析表明，年齡、FIGO分期、腫瘤直徑、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分化及TOP2A表達(dá)均是影響宮頸鱗癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)；多因素COX分析表明，肌層浸潤(rùn)深度、TOP2A陽(yáng)性表達(dá)是影響宮頸鱗癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)(表4)。

表4 COX回歸分析影響宮頸鱗癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素

討 論

宮頸鱗癌高發(fā)年齡為35～53歲，人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染是引起宮頸癌發(fā)生的主要致病因素。近年來(lái)，宮頸癌發(fā)病趨勢(shì)已逐漸年輕化，臨床主要表現(xiàn)為陰道流血或陰道排液及一些非特異性癥狀，然而出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)，可能已是腫瘤晚期。目前主要是通過手術(shù)治療、放化療等方式對(duì)患者進(jìn)行治療；隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，早期宮頸癌的治療已有了很大的進(jìn)展，但晚期宮頸癌患者腫瘤復(fù)發(fā)率高，預(yù)后較差，有較高的死亡率。因此，尋找能夠有效評(píng)估宮頸癌預(yù)后的生物分子標(biāo)志物至關(guān)重要。

TOP2A是TOP2家族的主要成員之一，能夠催化DNA雙鏈斷裂，在有絲分裂過程中誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄[9]。TOP2A與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。Kou等[10]研究表明，與正常組織比較，肺腺癌組織中TOP2A表達(dá)顯著升高，且與體外肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲有關(guān)；Song等[11]研究表明，人類巨細(xì)胞病毒感染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，TOP2A的表達(dá)顯著增加；Wang等[12]研究表明，與癌旁組織比較，TOP2A在宮頸癌組織中存在過表達(dá)，且其可通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲；馬菁雯等[13]研究表明，與正常宮頸組織比較，宮頸鱗癌組織中TOP2A存在過表達(dá)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌患者癌組織中TOP2A mRNA表達(dá)水平及蛋白TOP2A陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于對(duì)照組，與以上研究結(jié)果一致，提示TOP2A可能與宮頸鱗癌的發(fā)生有關(guān)。

較晚的臨床分期、肌層浸潤(rùn)深度、低分化以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均是腫瘤晚期的標(biāo)志。研究表明臨床分期、肌層浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等與宮頸癌的預(yù)后有關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，高FIGO分期及深肌層浸潤(rùn)宮頸鱗癌組織TOP2A陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于低FIGO分期和淺肌層浸潤(rùn)組織，原因可能是TOP2A影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移增加腫瘤浸潤(rùn)程度，從而導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)展，具體機(jī)制有待進(jìn)一步的分析。Zhao等[7]通過生物信息學(xué)分析共鑒定出188個(gè)在宮頸癌組織和正常宮頸組織中差異表達(dá)的基因，其中TOP2A基因在宮頸癌組織中表達(dá)顯著高于正常宮頸組織，且與TOP2A低表達(dá)患者比較，TOP2A高表達(dá)患者無(wú)進(jìn)展生存期時(shí)間顯著減短，推測(cè)TOP2A可能是宮頸癌預(yù)后不良的生物標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，TOP2A高表達(dá)組患者5年內(nèi)生存率遠(yuǎn)低于低表達(dá)組，與以上研究結(jié)果一致。本研究COX多因素回歸分析結(jié)果表明，肌層浸潤(rùn)深度、TOP2A陽(yáng)性表達(dá)是影響宮頸鱗癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，提示TOP2A可能與宮頸鱗癌的發(fā)展及預(yù)后有關(guān)，可能是預(yù)測(cè)宮頸鱗癌患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分化是影響宮頸鱗癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素[15]，而在本研究中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分化并不是影響宮頸鱗癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素，可能是因?yàn)楸狙芯窟x取病例數(shù)較少，這也是本研究的不足之處。

綜上所述，TOP2A在宮頸鱗癌患者中存在過表達(dá)，且與患者FIGO分期、肌層浸潤(rùn)深度及5年生存率有關(guān)，可能是宮頸癌患者潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物；根據(jù)TOP2A表達(dá)水平對(duì)患者進(jìn)行密切隨訪，可能有利于改善患者生活質(zhì)量、延長(zhǎng)患者生存期限。然而本研究?jī)H從臨床水平探索了TOP2A在宮頸鱗癌患者中的表達(dá)，其在宮頸鱗癌發(fā)生及預(yù)后的具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。