袁濤，劉文杰，王蕾，王樹玉，劉英*

(首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院，1.生殖醫(yī)學科；2.產(chǎn)科，北京 100026)

間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSC)存在于多種組織內(nèi)，是組織工程和再生醫(yī)學中理想的種子干細胞[1]。近年來，許多研究人員已經(jīng)將注意力集中在臍帶來源的MSC。人臍帶間充質(zhì)干細胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)應(yīng)用于生物工程的優(yōu)越性在于：(1)臍帶是醫(yī)療廢棄物，來源廣泛；(2)分離、培養(yǎng)方法簡便，易于傳代擴增獲取大量細胞；(3)臍帶受到胎盤屏障功能的保護，被污染的可能性??；(4)臍帶免疫原性低；(5)可塑性強；(6)無倫理及法律方面的爭論[2-3]。與其他MSC一致，hUC-MSCs在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下可以被誘導分化成各胚層的功能細胞，如神經(jīng)細胞、軟骨和骨細胞、脂肪細胞、橫紋肌細胞、胰島分泌細胞、心肌細胞、生殖細胞等[4-7]。以上特性使hUC-MSCs成為科學家們的研究熱點。

目前，hUC-MSCs的分離和培養(yǎng)方法尚無統(tǒng)一標準，對現(xiàn)有的方法進行比較分析，可幫助研究人員找到更合理有效的方法。本課題選擇足月順產(chǎn)中獲得的新鮮臍帶，用組織塊法和酶消化法兩種方法分離、培養(yǎng)hUC-MSCs，并對其進行傳代擴增及鑒定，觀察兩種方法獲得的細胞形態(tài)、生長曲線、免疫標志物等指標特征。

材料和方法

一、研究對象

選取本院產(chǎn)科自然分娩的健康足月新生兒5例，獲得其雙親知情同意后取5根臍帶組織，每根臍帶均用兩種方法分離hUC-MSCs。產(chǎn)婦無妊娠并發(fā)癥，HBV、HIV、梅毒等抗體檢測均為陰性。本研究獲得首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的審核批準。

二、主要試劑

MEM培養(yǎng)液、PBS 緩沖液(Gibco公司，美國)，雙抗、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、0.25%EDTA-胰蛋白酶(Sigma公司，美國)，胎牛血清(Hyclone公司，美國)，鼠抗人CD90-FITC、CD105-PerCP-CyTM、CD73-APC、CD44-PE、HLA-DR-PE、CD34-PE、CD19-PE、CD45-PE等抗體(BD Biosciences公司，美國)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

三、研究方法

1.hUC-MSCs的分離和原代培養(yǎng)：取新生兒臍帶后及時放入含有1%雙抗的PBS緩沖液內(nèi)，4 h內(nèi)用以下兩種方法進行處理。(1)組織塊法：將臍帶用PBS洗滌數(shù)遍至白色后剪為2～3 cm的小段，去除臍帶內(nèi)的血管及被膜，將其剪為2～3 mm3的組織塊，置于100 mm的培養(yǎng)皿內(nèi)，加入hUC-MSCs培養(yǎng)液(MEM+10%胎牛血清)，放入5% CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3 d換液。(2)酶消化法：按上述方法將臍帶剪為2～3 mm3組織塊，將其放在培養(yǎng)皿內(nèi)，加入0.125%胰蛋白酶，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化20 min。終止消化后離心棄上清，按1∶8的比例加入0.075%Ⅱ型膠原酶，置于37℃水浴箱內(nèi)消化1 h，每隔10 min晃動一次。洗滌后加入0.25%胰蛋白酶，37℃的水浴中消化0.5 h，離心棄上清，加入細胞培養(yǎng)液重懸，過濾，收集細胞懸液。將未消化的組織塊繼續(xù)重復之前的消化步驟，直至組織塊基本消失。將細胞洗滌后重懸，接種于培養(yǎng)皿，37℃、5%CO2培養(yǎng)，每3 d換液。

2.hUC-MSCs的傳代和擴增：當細胞鋪滿皿底的80%～90%時，棄上清(用組織塊法原代培養(yǎng)則棄掉上清及組織塊)，PBS洗滌2次，加入0.25%EDTA-胰蛋白酶，于37℃培養(yǎng)箱消化3 min。終止消化，離心棄上清，加培養(yǎng)液重懸細胞，按1∶3接種培養(yǎng)，每天換液，3 d可進行下次傳代。

3.細胞增殖活性檢測：選取兩種培養(yǎng)方法中生長狀態(tài)較好的P0、P3細胞，按5×104/ml的密度接種于12孔板，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。P0細胞在接種后的d5、d7、d12、d15同一時間消化為單細胞懸液，P3細胞在接種后24 h、48 h、72 h消化為單細胞懸液，取少量細胞懸液，按1∶1的比例加入0.4%臺盼藍染液，顯微鏡下用細胞計數(shù)板計數(shù)未被染成藍色的活細胞數(shù)。每次取3孔計數(shù)，取平均值。計算細胞倍增情況，繪制每組細胞的生長曲線。

4.流式細胞儀檢測hUC-MSCs表面抗原：選取第3代生長活躍的細胞，0.25%EDTA-胰蛋白酶消化制備濃度為1×106個/ml的單細胞懸液，分別加入以下相應(yīng)流式抗體：鼠抗人CD90-FITC、鼠抗人CD105-PerCP-CyTM、鼠抗人CD73-APC、鼠抗人CD44-PE、鼠抗人HLA-DR-PE、鼠抗人CD34-PE、鼠抗人CD19-PE、鼠抗人CD45-PE。4℃孵育30 min，PBS洗滌2次，重懸細胞，流式細胞儀上機檢測。

四、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、兩種方法原代培養(yǎng)hUC-MSCs的形態(tài)比較

使用組織塊附著方法分離培養(yǎng)hUC-MSCs(圖1A-D)，在倒置顯微鏡下觀察，組織塊培養(yǎng)5 d后，在組織塊周圍可觀察到散在的長梭形和紡錘形的細胞(圖1B)。培養(yǎng)10 d后，每個小集落中的細胞數(shù)達到幾百至幾千(圖1C)，細胞形狀逐漸變?yōu)榫鶆虻募忓N形。約2周后，細胞在培養(yǎng)皿融合達80%以上。3次傳代后，細胞生長旺盛，形態(tài)均一，成纖維樣平行排列或放射狀排列(圖1D)。

使用酶消化法分離培養(yǎng)hUC-MSCs(圖1E-H)，5 d后在顯微鏡下見到細胞開始貼壁，呈短梭形及不規(guī)則形(圖1F)。培養(yǎng)10 d后細胞形狀逐漸變?yōu)殚L梭形(圖1G)。約2周后，細胞在培養(yǎng)皿中達到40%～50%匯合。3次傳代后，細胞大部分為長梭形，小部分為多角形(圖1H)。

A-D：組織塊法原代培養(yǎng)的第1天(A)、第5天(B)、第10天(C)和第3代細胞(D)(×40)；E-H：酶消化法原代培養(yǎng)的第1天(E)、第5天(F)、第10天(G)和第3代細胞(H)(×40)圖1 原代培養(yǎng)hUC-MSCs的細胞形態(tài)觀察

二、兩種方法原代培養(yǎng)hUC-MSCs的增殖活性比較

組織塊法原代培養(yǎng)的hUC-MSCs第5天有細胞從組織塊內(nèi)爬出來，第7天開始呈指數(shù)增長，第15天細胞量是第5天的14倍左右；而酶消化法第5天時有少量細胞貼壁，第12天開始倍增。在原代培養(yǎng)的第7、12、15天兩組細胞量均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)(圖2A)。組織塊法培養(yǎng)的P3hUC-MSCs解凍后接種的當日即可貼壁達80%，第2天開始倍增，細胞呈指數(shù)增長，第3天細胞融合達90%；酶消化法培養(yǎng)的P3 hUC-MSCs解凍后接種的當日可貼壁達70%，細胞增殖速度較慢，第2天未見倍增，第3天細胞融合達50%。兩組P3細胞在第48和72 h細胞量均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)(圖2B)。

三、兩種方法原代培養(yǎng)hUC-MSCs的免疫特性分析

通過上述方法分離的hUC-MSCs被培養(yǎng)擴增并通過流式細胞術(shù)進行鑒定。組織塊法分離培養(yǎng)的第3代(P3)細胞CD34、CD45、HLA-DR標志物呈陰性(<1%)，而CD44、CD73、CD90和CD105標志物呈陽性(>95%)(圖3A)。酶消化法分離培養(yǎng)的P3細胞CD34、CD45、HLA-DR、CD105標志物呈陰性(<1%)，而CD73、CD90標志物呈陽性(>95%)(圖3B)。

A：兩種方法原代培養(yǎng)hUC-MSCs的增殖情況比較；B：兩種方法P3代培養(yǎng)hUC-MSCs的增殖情況比較。同一時間點兩組比較，*P<0.05圖2 hUC-MSCs細胞增殖情況

A：組織塊法分離培養(yǎng)的P3細胞CD34、CD45、HLA-DR、CD44、CD73、CD90及CD105標志物表達；B：酶消化法分離培養(yǎng)的P3細胞CD34、CD45、HLA-DR、CD105、CD73及CD90標志物表達圖3 流式細胞術(shù)檢測hUC-MSCs免疫標志物表達

討 論

一、兩種培養(yǎng)方法的效果比較

人們越來越需要恢復、維持和增強器官功能的新技術(shù)。干細胞，尤其是MSC，已成為再生醫(yī)學的新希望。MSC有高度的自我再生能力、多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)特性[8]，可通過歸巢到靶組織、修復受損細胞、刺激宿主細胞再生、自分泌、旁分泌作用及免疫調(diào)節(jié)作用治療疾病[9]。hUC-MSCs來源于早期中胚層，具有多向分化的潛能，而且無倫理的爭議，具有廣闊的研究前景[10]。獲取hUC-MSCs的方法主要有組織塊法和酶消化法，選擇合適的分離和培養(yǎng)方法是獲得質(zhì)量和產(chǎn)量最佳細胞的關(guān)鍵一步[8]。臍帶的生理功能取決于其被膜與動靜脈之間的華通膠組織中的豐富的MSC和膠原纖維，故進行原代培養(yǎng)時選取華通膠部分更能有效的培養(yǎng)出純化的hUC-MSCs[10-11]。

本研究選取臍帶華通膠組織，用組織塊法和酶消化法兩種方法進行了原代培養(yǎng)對比，發(fā)現(xiàn)：(1)從細胞最初生長來看，原代培養(yǎng)5 d后，組織塊法可見細胞從組織塊內(nèi)呈放射狀爬出，而酶消化法只可見少量形態(tài)不規(guī)則的貼壁細胞；(2)從細胞形態(tài)來看，組織塊法的細胞形態(tài)相對一致，呈長梭形，可見細胞核，而酶消化法的細胞比較稀疏，呈多邊形，細胞核不明顯；(3)從細胞生長速度來看，組織塊法的細胞培養(yǎng)2周左右，細胞融合可達到80%，而酶消化法的細胞培養(yǎng)2周后細胞融合才達到40%～50%。在王菲等[12]的研究中，組織塊法與酶消化法分離培養(yǎng)的MSC增殖情況無顯著差異，但在本研究中，組織塊法分離的細胞增殖情況顯著優(yōu)于酶消化法(P<0.05)。從方法學上比較，組織塊培養(yǎng)法要優(yōu)于酶消化法，因為其更高效、廉價且簡便。

二、兩種培養(yǎng)方法優(yōu)劣比較

在酶消化法中，細胞不但受到機械應(yīng)力和蛋白水解的雙重影響，而且酶處理還可能會降解細胞外基質(zhì)和細胞膜黏附分子，使細胞分離后不易粘附在培養(yǎng)底物上，導致其不易貼壁[6]和粘附時間延長[13]。另外，胰蛋白酶也能影響細胞表面抗原、細胞形狀、細胞骨架成分和細胞膜內(nèi)顆粒分布。酶消化法在細胞存活力、細胞密度以及增殖效率等方面的結(jié)果取決于所用酶的類型和濃度[14]，因此，選擇合適的酶及控制酶的劑量和消化時間尤為重要[8]。而在組織塊法中，細胞與相關(guān)組織一起從體內(nèi)轉(zhuǎn)移到體外，從某種意義上講，細胞沒有脫離原來的穩(wěn)定環(huán)境，有助于更好地應(yīng)對分離方法帶來的損害；而且，組織塊還可釋放細胞因子和生長因子到培養(yǎng)基中，刺激細胞生長[15]。據(jù)報道，與酶消化法相比，組織塊法可以收獲更少的異種細胞群，并具有更高的增殖率和細胞活力[8]；其次，組織塊法無需使用胰蛋白酶，可降低培養(yǎng)的成本。但是，需要注意的是，組織塊的大小將直接影響細胞培養(yǎng)的結(jié)果，減小組織塊的體積有助于氣體和營養(yǎng)物質(zhì)向塊內(nèi)細胞擴散[7]，但過度的切碎則會導致細胞的機械破壞，從而影響培養(yǎng)結(jié)果。

三、分離培養(yǎng)的hUC-MSCs連續(xù)傳代能力的討論

評估MSC在再生醫(yī)學及組織工程上的應(yīng)用前景，取決于其是否能在體外長期傳代后仍能保持干細胞特性和多向分化能力。根據(jù)目前的報道，hUC-MSCs能否在體外長期傳代并保持干細胞特性和多向分化能力，仍無明確結(jié)論，尚需進一步研究。有報道，經(jīng)過組織塊分離培養(yǎng)法獲得的hUC-MSCs可穩(wěn)定傳代并保持干細胞的特性，且其染色體核型仍能保持正常。但另有研究發(fā)現(xiàn)，hUC-MSCs在體外培養(yǎng)長時間后細胞形態(tài)會發(fā)生改變，早期細胞大多呈長梭形，傳至P20后出現(xiàn)呈多角不定形且體積變大的細胞，胞漿也明顯增加[10]。體外的傳代擴增會增加MSC的衰老和老化，主要表現(xiàn)為MSC表面標志物的表達降低、標志物的改變、細胞表型的改變和多向分化潛能的喪失[16]。本實驗結(jié)果顯示，將組織塊法分離的hUC-MSCs連續(xù)傳代至P10時形態(tài)仍保持長梭形，且仍能保持MSC特性，與報道一致[17]。

四、hUC-MSCs表面標志物檢測結(jié)果的討論

表面標志物是鑒定hUC-MSCs的關(guān)鍵，體現(xiàn)細胞的一些基本特征，并與細胞功能相關(guān)。MSC的CD29、CD44、CD90、CD73、CD105和人類白細胞抗原(HLA)-ABC呈陽性，內(nèi)皮細胞標志物CD31、造血細胞標志物CD34、CD45、CD117和HLA-DR呈陰性[2]。本研究選取生長狀態(tài)較好的P2、P3 hUC-MSCs，用流式細胞儀檢測其表面標志物。組織塊法分離培養(yǎng)的hUC-MSCs其CD44、CD73、CD90和CD105表達呈陽性，CD34、CD45、HLA-DR表達呈陰性，與MSC表面標志物表達一致。而酶消化法分離培養(yǎng)的hUC-MSCs其CD73、CD90表達呈陽性，而CD105呈陰性，CD34、CD45、HLA-DR標記物亦呈陰性。CD105呈陰性的結(jié)果與之前的報道有所不同[4]，可能是由于本實驗中胰酶消化時間過長或濃度過高導致，需進一步研究。據(jù)報道，分離和傳代培養(yǎng)方法的差異可能導致其表面標志物基因表達不同[18]。在Salehinejad等[7]研究中，組織塊法所獲得的細胞與酶消化法相比，其CD73的表達更高；用膠原酶/胰蛋白酶法所獲得的細胞與用膠原酶/透明質(zhì)酸酶/胰蛋白酶法相比，CD90的表達更高。CD44、CD73、CD90及CD105是MSC表面的特異抗原，已被認為是鑒定hUC-MSCs的重要標記[4，19]。CD34是造血干細胞的標志分子，CD45是白細胞共同抗原，本實驗培養(yǎng)的hUC-MSCs不表達CD34和CD45，不表達HLA-DR，說明分離出的hUC-MSCs免疫原性弱，不容易引起免疫排斥反應(yīng)，異體移植幾乎不受影響，有可能適宜不同個體之間的移植[20-21]。

五、經(jīng)驗總結(jié)

合理而規(guī)范的培養(yǎng)方法對于獲得hUC-MSCs非常重要，本實驗室的經(jīng)驗及教訓總結(jié)如下：(1)臍帶的處理：處理臍帶時應(yīng)完全去除被膜和血管，因被膜會影響細胞貼壁，而血管會影響細胞純度；(2)組織塊的接種：組織塊有三種平面即靠近血管面、靠近被膜面、及剪刀切面，本實驗室分別將3種平面朝下貼于培養(yǎng)皿以培養(yǎng)細胞，發(fā)現(xiàn)以靠近血管面貼壁的組織塊貼壁較其他兩種更牢固、細胞爬出更快、以及細胞量更多；(3)組織塊的大?。航M織塊大小在2～3 mm3時細胞爬出更快、細胞量更多；(4)原代培養(yǎng)：培養(yǎng)時應(yīng)先在每個組織塊上加一滴培養(yǎng)基后放于孵箱中，給予組織塊充分的時間來貼壁，4 h后可補充培養(yǎng)基，加液量以可鋪滿皿底但不沒過組織塊為宜，換液時應(yīng)稍稍傾斜培養(yǎng)皿，防止組織塊脫離；(5)培養(yǎng)基的選用：本實驗室曾比較DMEM+10%FBS和MEM+10%FBS兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，發(fā)現(xiàn)MEM+10%FBS培養(yǎng)的組織塊細胞爬出時間早、細胞量多；(6)細胞的傳代：細胞生長密度達100%時會接觸抑制，繼續(xù)生長會成簇聚集，最終脫離皿底，因此在細胞生長密度達80～90%時應(yīng)及時傳代；另一方面，hUC-MSCs會分泌功能因子相互作用促進增長，因此接種細胞時密度不宜過低，否則會影響細胞分裂增殖；(7)細胞的凍存：細胞凍存密度應(yīng)在1～5×106為宜，過多或過少均會導致細胞復蘇率低。

綜上，我們的結(jié)果表明，與酶消化法相比，組織塊培養(yǎng)法能獲得較純的hUC-MSCs，且方法簡單，成本低，是大量獲得hUC-MSCs的理想培養(yǎng)方法。