周云花 ， 趙志軍， 楊 紅 ， 康 佳 ， 蘇雅靜 ， 喬 霞 ， 于 欣

（1.寧夏醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院 寧夏病原微生物重點實驗室，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院醫(yī)學實驗中心，銀川 750004； 4.寧夏醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院醫(yī)學檢驗系，銀川 750004）

金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌是醫(yī)院感染最常見的病原體，與人類多種疾病相關(guān)，且對大多數(shù)抗生素表現(xiàn)出極高的耐藥性，由此引發(fā)感染者病死率大幅上升，給臨床抗感染治療帶來諸多問題[1-5]?？股孛舾行詫嶒炇悄壳肮J的針對細菌耐藥性和敏感性的檢測方法，其通過測定抗菌藥物在體外抑制病原微生物生長的效力，以確定細菌對抗生素的敏感性[6]。臨床現(xiàn)有較多抗生素敏感性實驗可用于細菌藥敏檢測，如紙片擴散法、稀釋法、抗生素濃度法、VITEK2 全自動細菌鑒定儀等，以上方法均可為臨床檢測細菌耐藥性提供有效依據(jù)，但仍存在操作煩瑣、成本高、儀器依賴性強等問題，且培養(yǎng)過程需要耗費大量時間實現(xiàn)細菌富集[7-9]，從而增加臨床耐藥菌株感染者的病死率，影響感染者的預后。

本研究設(shè)計了一種改良微量肉湯藥敏實驗（熒光法），利用熒光二抗分別捕獲與金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌特異性結(jié)合的一抗，通過檢測細菌是否產(chǎn)生熒光來判定最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。本文通過比較改良微量肉湯藥敏實驗（熒光法）、VITEK2 全自動細菌鑒定儀和微量肉湯稀釋法檢測金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌耐藥性的實驗結(jié)果，驗證三種方法的有效性和統(tǒng)一性，為臨床提供一種快速藥敏實驗備選方法。

1 資料與方法

1.1 菌株與主要試劑

金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸埃希菌ATCC25922 購自上海漢尼生物技術(shù)有限公司；臨床分離金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌來自寧夏醫(yī)科大學醫(yī)學實驗中心微生物組；LB 肉湯培養(yǎng)基購自中國北京索萊寶科技有限公司（貨號：L1010）；MH 肉湯培養(yǎng)基購自中國北京索萊寶科技有限公司（貨號：M8556）；苯唑西林、利奈唑胺、環(huán)丙沙星、青霉素、紅霉素、亞胺培南、頭孢曲松、哌拉西林和妥布霉素均購自中國大連美侖生物技術(shù)有限公司；山羊抗小鼠IgGH&L（FITC）購自英國 Abcam 公司（批號：6785）；Lipid ALPS Poly-clonal Antibody（貨號：PA1-73178）、Alexa Fluor 488 Protein Labeling Ki（t貨號：A10235）、96 孔酶標板均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 實驗儀器

多功能微孔板監(jiān)測儀購自美國BioTek 公司（型號：SYNERGY2）；VITEK2 全自動細菌鑒定儀購自法國生物梅里埃股份有限公司（型號：VITEK2COMPACT60）。

1.3 方法

1.3.1 細菌培養(yǎng)定量 分別挑取標準菌株金黃色葡萄球菌ATCC29213、標準菌株大腸埃希菌ATCC25922、5 株臨床分離金黃色葡萄球菌和5株臨床分離大腸埃希菌的單個菌落于LB 肉湯培養(yǎng)基中搖菌過夜（37 ℃，180 r·min-1），再分別加入生物素標記的一抗捕獲并于0.9%生理鹽水中定量為 1×108CFU·mL-1。

1.3.2 改良微量肉湯藥敏實驗（熒光法） 用MH肉湯培養(yǎng)基分別稀釋1.3.1 中定量的標準菌株和5 株臨床分離的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌菌懸液至 1×106CFU·mL-1。在 96 孔板第 1～10 列配制 100 μL 藥物濃度依次為 64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 和 0.125 μg·mL-1的抗生素，再分別加入100 μL 制備好的菌懸液至終濃度為1×105CFU·mL-1，第 11 列加入 200 μL MH 肉湯培養(yǎng)基作陰性對照，第12 列加入200 μL 菌懸液作陽性對照[10]。接種好的藥敏板置于35 ℃溫箱中培養(yǎng)4、6、8 和 10 h 后，在接種金黃色葡萄球菌的孔內(nèi)加入 5 μL 山羊抗小鼠 IgG 熒光抗體（1∶2500），在接種大腸埃希菌的孔內(nèi)加入5 μL 經(jīng)Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit 標記的Lipid ALPS Polyclonal Antibody（1∶30），35 ℃溫箱繼續(xù)培養(yǎng)30 min，利用多功能微孔板監(jiān)測儀檢測熒光強度值，并根據(jù)CLSIM100 文件判斷確定MIC，實驗重復3 次。

1.3.3 VITEK2 全自動細菌鑒定儀 將標準菌株和5 株臨床分離的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的純菌落分別制成0.5 麥氏濁度的菌懸液，經(jīng)充填機將菌懸液注入試卡內(nèi)，封口后放入讀數(shù)器恒溫培養(yǎng)箱，根據(jù)試卡各生化反應(yīng)孔中的生長變化情況，最后鑒定結(jié)果在顯示器上自動顯示。

1.3.4 微量肉湯稀釋法 標準菌株和5 株臨床分離的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的微量肉湯稀釋法藥敏板配制流程同1.3.2；將分別接種好的藥敏板置于35 ℃溫箱中培養(yǎng)18～22 h，通過觀察MH 肉湯培養(yǎng)基的濁度并檢測OD 值，根據(jù)CLSIM100 文件判斷確定MIC，實驗重復3 次。

1.3.5 三種抗生素敏感性實驗的MIC、檢測周轉(zhuǎn)時間（turn-around time，TAT）結(jié)果比較 根據(jù)上述抗生素敏感性實驗結(jié)果，通過統(tǒng)計學方法比較其MIC 一致性與TAT 差異性。其中，金黃色葡萄球菌ATCC29213 和大腸埃希菌ATCC25922 是美國臨床標準化實驗室（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）和歐盟藥敏實驗委員會（European Committeeon Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）規(guī)定的微量肉湯稀釋法藥敏實驗中的質(zhì)控菌株，其質(zhì)控范圍在3個倍比濃度梯度以內(nèi)。由于藥敏實驗影響因素很多，所以誤差范圍定義為3 個藥物倍比濃度梯度[11-13]。因此，本文中對比VITEK2 系統(tǒng)、微量肉湯稀釋法與改良微量肉湯藥敏實驗（熒光法）的MIC 也遵循此原則。

1.4 統(tǒng)計學方法

資料運用SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計分析，三種抗生素敏感性實驗結(jié)果之間的一致性比較由Cohen’s kappa 值表示（差：k＜0.20；一般：0.21＜k＜0.40；中等：0.41＜k＜0.60；較強：0.61＜k＜0.80；強：k≥0.81）。計量資料以均值±標準差（）表示，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三種抗生素敏感性實驗檢測金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的MIC 結(jié)果比較

在對標準菌株金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌進行的3 次重復對比實驗中，三種方法對兩種菌株檢測的MIC 在3 個藥物濃度梯度以內(nèi)的吻合率幾乎為100%，且均在質(zhì)控范圍內(nèi)。在對5 株臨床分離金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌進行的3 次重復對比實驗中，三種方法對兩種菌株檢測的MIC 在3 個藥物濃度梯度以內(nèi)的吻合率也幾乎為100%。結(jié)果顯示，三種方法對標準菌株金黃色葡萄球菌（表1）、大腸埃希菌（表2）和臨床分離金黃色葡萄球菌（表3）、大腸埃希菌（表4）檢測的MIC 均未超出3 個藥物倍比濃度梯度。三種方法檢測結(jié)果的Cohen’s kappa 值為1.000，P=0.083。因此三種抗生素敏感性實驗檢測金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的結(jié)果高度吻合。

2.2 三種抗生素敏感性實驗檢測金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌藥敏的TAT 結(jié)果比較

三種藥敏方法對金黃色葡萄球菌藥敏實驗結(jié)果顯示，VITEK2 全自動細菌鑒定儀的TAT 需17 h 以上；微量肉湯稀釋法的TAT 一般需要22 h左右；與這兩種方法相比，改良微量肉湯藥敏實驗（熒光法）TAT 縮短，僅為 8～10 h（P＜0.01），見圖1A。三種方法對大腸埃希菌藥敏TAT 實驗結(jié)果顯示，改良的微量肉湯藥敏實驗（熒光法）和VITEK2 全自動細菌鑒定儀的TAT 均為10 h 左右，而微量肉湯稀釋法TAT 長達22 h 左右，三種方法的TAT 差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1B。

表1 三種抗生素敏感性實驗檢測標準菌株金黃色葡萄球菌ATCC29213 的MIC（μg·mL-1）

表2 三種抗生素敏感性實驗檢測標準菌株大腸埃希菌ATCC25922 的MIC（μg·mL-1）

表3 三種抗生素敏感性實驗檢測臨床分離金黃色葡萄球菌的MIC（μg·mL-1）

3 討論

金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌是臨床常見耐藥菌株[14]，且其耐藥性與細菌感染導致的高發(fā)病率和高病死率密切相關(guān)。因此，快速、準確發(fā)布臨床高?；颊叩募毦囵B(yǎng)和抗生素敏感性實驗結(jié)果，對于提高患者預后及避免易感微生物抗生素的濫用至關(guān)重要[15-17]。但目前醫(yī)院常用的VITEK2 全自動細菌鑒定儀成本高，不適用于基層醫(yī)療，微量肉湯稀釋法操作煩瑣，且以上兩種方法均是通過檢測菌種與抗生素孵育后濁度判定細菌對藥物的敏感性，孵育耗時長，一般需要22 h 左右[7-9]。本研究設(shè)計的一種改良微量肉湯藥敏實驗（熒光法），總時長僅10 h，相對VITEK2全自動細菌鑒定儀與微量肉湯稀釋法耗時較短，同時該方法利用熒光抗體分別捕獲與金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌特異性結(jié)合的抗體，通過檢測細菌是否產(chǎn)生熒光可直接、準確判定MIC。因此，改良微量肉湯藥敏實驗（熒光法）耗時短，結(jié)果判讀更客觀簡便，更適用于基層醫(yī)療，可為臨床醫(yī)生提供及時的用藥方案，有效降低患者細菌感染病死率。

表4 三種抗生素敏感性實驗檢測臨床分離大腸埃希菌的MIC（μg·mL-1）

圖1 三種抗生素敏感性實驗檢測細菌藥敏的TAT 比較

本文使用改良微量肉湯藥敏實驗（熒光法）分別對金黃色葡萄球菌ATCC29213 平行進行3次苯唑西林、利奈唑胺和環(huán)丙沙星的藥敏實驗，對大腸埃希菌ATCC25922 平行進行3 次慶大霉素、環(huán)丙沙星和亞胺培南的藥敏實驗，同樣對臨床分離金黃色葡萄球菌進行苯唑西林、利奈唑胺、青霉素、紅霉素的藥敏實驗，對臨床分離大腸埃希菌進行亞胺培南、頭孢曲松、哌拉西林、妥布霉素的藥敏實驗，在沒有出現(xiàn)跳孔的情況下，通過分析細菌在含有不同抗生素的MH 肉湯中培養(yǎng)不同時間點后是否產(chǎn)生熒光來確定MIC。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，利用改良微量肉湯藥敏實驗（熒光法）檢測上述兩種菌株的MIC 與VITEK2 全自動細菌鑒定儀及微量肉湯稀釋法的藥敏結(jié)果一致，且尚未發(fā)現(xiàn)超出3 個藥物倍比濃度的差異值。因此，研究認為改良微量肉湯藥敏實驗（熒光法）具有良好的準確性，可為臨床檢測細菌耐藥性提供有力依據(jù)。

綜上所述，改良微量肉湯藥敏實驗（熒光法）主要通過檢測是否產(chǎn)生熒光判斷細菌MIC，雖然藥敏實驗前需手工配制藥敏板，但該方法具有結(jié)果判讀更直接客觀、耗時短等優(yōu)點，在臨床快速、精準選擇抗生素治療方面具有較大潛力，可為臨床危重患者提供更快速、可靠的藥敏結(jié)果。改良微量肉湯藥敏實驗（熒光法）是一種快速檢測細菌耐藥性的創(chuàng)新技術(shù)，與其他臨床常規(guī)藥敏方法的對比尚未見報道。后續(xù)實驗中，將通過增加實驗重復對比次數(shù)、臨床分離菌株數(shù)進一步優(yōu)化該實驗的檢測流程，使其能夠作為常規(guī)藥敏檢測方法廣泛應(yīng)用于臨床。