辛 陽，辛彩蕊，孔 超，林子清通信作者

(1.中國刑事警察學院法醫(yī)學系，遼寧 沈陽 110035；2.西藏警官專科學?？蒲兴鞑?拉薩 850000)

0 引言

綿羊(domestic sheep，Ovis aries)因被人類馴化徹底，并可為人類社會提供大量的羊毛纖維、肉、奶制品，成為了世界上最主要的經(jīng)濟動物之一。但對它的研究主要集中在經(jīng)濟和畜牧業(yè)領域，對其骨組織學的研究很少，僅有張繼宗等對部分骨組織形態(tài)特征進行過簡單描述[1-2]。本文對綿羊的股骨骨密質組織切片制作條件進行了探索，并對其組織學形態(tài)特征進行了系統(tǒng)研究，其不僅可以為法醫(yī)學和考古學在微觀水平的種屬鑒別提供科學手段，還可以為綿羊的生物進化提供基礎材料。

1 材料與方法

1.1 材料

身體健康，骨骼健壯的成年綿羊(2～2.5歲) 50只，雌雄不限，體重20～50 kg，采取全身麻醉、頸動脈放血處死后，取其右后肢股骨中段備檢。處死的方法符合動物實驗的倫理要求。

1.2 方法

1.2.1 固定

取前述綿羊股骨中段，用鋼鋸鋸成厚3～5 mm的薄片，放入裝有10%福爾馬林溶液的容器中，室溫(20℃左右)放置3～5 d。

1.2.2 脫鈣

按照Murayama法和Alexander法分別配制甲酸脫鈣液和硝酸脫鈣液[3]，將同一個體的上述骨片分別放入2種溶液中，更換脫鈣液1次/d，第3、4、5、6、7、8、9、10天分別用脫鈣終點確定液滴定，檢驗脫鈣液中鈣質含量，確定骨質脫鈣程度，探索甲酸脫鈣和硝酸脫鈣2種方法的效果和所需時間。

1.2.3 包埋及切片

將脫鈣后的骨薄片流水沖洗24 h，用冷凍組織包埋劑(OCT)包埋后，放入冷凍切片機(英國BROTHER公司)冷凍室內(nèi)冷凍3～5 min，用切片機切成20 μm厚的薄片，放入無水乙醇中備用。

1.2.4 染色封片

將切好后放在無水乙醇中備用的骨切片放入事先按常規(guī)配制好的硫瑾/苦味酸染色液中，室溫放置12～20 min，然后放入苦味酸染色液中分別染色30 s、45 s和60 s，用70%和95%乙醇分色后觀察染色效果待封片。然后用二甲苯-石碳酸和純二甲苯溶液各透明3 min后，即可用中性合成樹膠封片[4]。

1.2.5 切片觀察指標及統(tǒng)計學分析

采用Nikon ECLIPSE 80i病理圖像處理系統(tǒng)×200鏡下觀察哈氏系統(tǒng)的數(shù)量、形態(tài)、直徑、排列及面積，間骨板的數(shù)量、形態(tài)、排列、面積百分比、環(huán)層骨板形態(tài)，內(nèi)、外環(huán)骨板的厚度及相對厚度，非哈氏管的數(shù)量。×400鏡下觀察哈氏系統(tǒng)環(huán)層骨板數(shù)，哈氏管直徑及面積，間骨板環(huán)層骨板數(shù)，骨陷窩數(shù)量、排列和面積。所有觀察數(shù)據(jù)利用SPSS軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1 骨單位

綿羊股骨的骨單位多呈圓形或橢圓形，與間骨板之間界限清晰，排列多無規(guī)律。哈氏系統(tǒng)環(huán)層骨板分層較清晰，中央管呈圓、橢圓型或串聯(lián)的長條形等。骨單位整體排列有一定的走向性，在第二代骨單位中常夾雜比較孤立、圓形、并且體積稍大、邊界清晰的骨單位。骨單位數(shù)量:在200×鏡下一個視野內(nèi)3～18個，平均7.59個。骨單位直徑:90～300 μm，平均175.16 μm。骨單位面積平均為16 662.73 μm2。哈氏管直徑:11～100 μm，平均30.16 μm。哈氏管面積平均為605.20 μm2。哈氏系統(tǒng)環(huán)層骨板數(shù)5～27個，平均12.86個。骨細胞多為短梭形或橢圓型。

2.2 間骨板

間骨板又稱舊骨單位，是第一代骨單位被第二代骨單位破壞后殘留的不完整骨單位。200×鏡下綿羊股骨中段的間骨板數(shù)量平均數(shù)為1.85，最多者為每個視野5個，最少者為每個視野0個。排列不規(guī)則，無規(guī)律性，大小不等，形狀近似于半弧形。間骨板的環(huán)層骨板排列比較整齊，其骨陷窩有層狀排列的趨勢，大小不均。

2.3 內(nèi)、外環(huán)骨板

股骨外環(huán)骨板多數(shù)(80%)有完整的外環(huán)骨板，形態(tài)多呈連續(xù)狀態(tài)，外環(huán)骨板厚薄不等，平均厚度為145.97 μm，外環(huán)骨板的平均相對厚度為0.097 31 μm。

內(nèi)環(huán)骨板的平均厚度為130.11 μm，內(nèi)環(huán)骨板的平均相對厚度為0.081 975 μm。內(nèi)環(huán)骨板厚薄不均，有骨單位的部分內(nèi)環(huán)骨板不連續(xù)，如圖1所示。

圖1 內(nèi)環(huán)骨板×200

2.4 非哈氏管的數(shù)量

200×顯微鏡下綿羊股骨中段的非哈氏管數(shù)量平均數(shù)為2.08。最多者每個視野中6個，最少者每個視野中0個。排列不規(guī)則，無規(guī)律性，大小不等，形狀不一。

2.5 骨陷窩

綿羊股骨的骨陷窩數(shù)量較多，在400×鏡下一個視野內(nèi)49～119個，平均為69.30個；絕大部分呈梭形、橢圓形、近圓形，不規(guī)則形，有層狀排列的趨勢，骨陷窩大小不均。最大者為 78.1 μm，最小者為13.1 μm，平均為30.37 μm。偶見骨陷窩周圍較多的呈放射狀排列的骨小管，如圖2所示。

圖2 骨陷窩×200

2.6 骨小梁

綿羊股骨中段50張切片中，偶見骨小梁。

2.7 叢狀骨

200×鏡下綿羊股骨中段典型叢狀股偶見，個體差異性大，排列不規(guī)則，無規(guī)律性，大小不等，形狀多近似彩虹狀，其骨陷窩有層狀排列的趨勢，大小不均。

2.8 骨單位帶

綿羊股骨中段在200×鏡下骨單位帶數(shù)量為0～3個，平均1.61個，其結構近似于骨單位，形狀多為橢圓形，中央管多數(shù)為2個，其股陷窩呈層狀排列，大小不均。

3 討論

3.1 骨切片制作及染色條件的分析

骨組織是一種堅硬的結締組織，含有大量固定的無機鹽，而無機鹽又是以羥基磷灰石結晶的形式存在，其中大部分為水合磷酸鈣[5]。因此，在骨組織切片制作過程中，從取材、組織處理、切片到染色等方面的要求都非常高，其中每一環(huán)節(jié)都會直接影響到組織制片的質量。首先骨組織取材不可太厚太大，厚薄不均，凹凸不平或太薄太碎。取材太厚，脫鈣液對它的穿透力必然受阻，而厚薄不均及凹凸不平則使組織在脫鈣過程中形成脫鈣不均勻現(xiàn)象，使組織中的鈣鹽部分脫盡，部分未脫盡，從而影響到后續(xù)步驟[6]。其次強酸脫鈣法雖然脫鈣速度較快，但由于其酸性過強，會導致組織結構破壞，時間過長將影響染色效果，因此應隨時觀察，檢測不出鈣質成分時則應立即終止脫鈣。弱酸脫鈣法脫鈣時間較長，脫鈣不完全切片時會感到阻力大，切片易碎、易裂、易產(chǎn)生皺折。

硫堇染色時間不確定，一般把切片染為棕黃色。因溫度、切片厚度、染色液使用次數(shù)等因素對硫堇染色的影響很大，所以硫堇染色時間不固定，要隨時觀察染色程度。經(jīng)對苦味酸 30 s、45 s和50 s染色效果的比較，發(fā)現(xiàn)染色時間為45 s的效果最好，因而確定其時間為45 s。經(jīng)乙醇脫水，二甲苯透明等步驟后，骨陷窩、骨小管呈棕黑色，骨基質為淡黃至棕黃色，結構比較清晰。

3.2 骨組織特征分析

綿羊股骨個體差異比較大，不論是骨單位的200×顯微鏡下同一視野下的個數(shù)，還是其大小、面積以及骨陷窩的面積個體間都存在明顯的差異，在同一個體數(shù)據(jù)也會存在明顯差異，出現(xiàn)兩種結構特點:在50只東北綿羊股骨切片中，大多數(shù)骨單位與間骨板分界清晰，骨單位呈橢圓和近圓形，排列多無規(guī)律。哈氏系統(tǒng)環(huán)層骨板分層比較清晰，哈氏系統(tǒng)環(huán)層骨板層數(shù)也較多，且相對比較恒定，骨細胞主要以呈層狀排列的梭形或橢圓形式存在，間骨板也比較常見，叢狀骨也可見到，但數(shù)量相對較少。少部分標本切片骨單位與間骨板分界不清晰，骨單位數(shù)量較多，形態(tài)近似橢圓形，哈氏系統(tǒng)環(huán)層骨板分層不明顯，骨單位整體排列有一定的走向性。但在總體上看東北綿羊股骨切片有其共同特點和規(guī)律:東北綿羊的股骨骨密質內(nèi)、外環(huán)骨板與骨單位，間骨板分界比較清楚，內(nèi)、外環(huán)骨板分層比較明顯，其形態(tài)多呈連續(xù)狀態(tài)，骨陷窩數(shù)量較多，且數(shù)量相對比較恒定。非哈弗系統(tǒng)，骨單位帶比較常見。

本研究的結果不僅可以為法醫(yī)學和考古學等領域提供微觀水平的種屬鑒別方法，還可以微動物骨組織形態(tài)的進化提供基礎數(shù)據(jù)。