陳小傲，朱建新，劉 洋,3，薛致勇，曲克明

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306； 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 200071；3.大連海洋大學(xué)，遼寧 大連 116023； 4.海陽市黃海水產(chǎn)有限公司，山東 煙臺 265100）

在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)實踐中，合適的養(yǎng)殖方法對于提高經(jīng)濟(jì)效益具有重大意義。Dada等[1]認(rèn)為，投喂方式、投喂頻率、投喂量等均會影響?zhàn)B殖生物的生長。研究發(fā)現(xiàn)，投喂頻率不僅影響水產(chǎn)動物的生長率和死亡率，還會影響?zhàn)B殖系統(tǒng)的水質(zhì)[2]。過高的投喂頻率會降低飼料利用率，殘余的飼料溶失到養(yǎng)殖水體中會影響水質(zhì)，增大了循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的凈水負(fù)荷和流水養(yǎng)殖系統(tǒng)的換水率，從而增加了養(yǎng)殖人員的勞動強(qiáng)度和生產(chǎn)成本[3-4]。為提高養(yǎng)殖效益，國內(nèi)外學(xué)者對一些水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的最佳投喂頻率進(jìn)行了探索性研究，如飼養(yǎng)密度、攝食頻率和攝食水平對珍珠龍膽石斑魚 (Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂) 特定生長速率、餌料轉(zhuǎn)化率和胃蛋白酶活性的綜合影響[5]，黑鰭髭鯛 (Hapalogenys nigripinnis) 幼魚的最優(yōu)投喂頻率[6]，大白姑魚 (Argyrosomus japonicas) 幼魚最佳投喂頻率[7]等。

牙鲆 (Paralichthys olivaceus) 隸屬于鰈形目、牙鲆科、牙鲆屬，俗稱牙片、偏口、左鲆等[8]，是中國北方主要海水魚類養(yǎng)殖品種，目前以工廠化養(yǎng)殖為主。對投喂頻率的研究通常以飼料系數(shù)和特定生長率為指標(biāo)[5]，但這兩個指標(biāo)不能從本質(zhì)上解釋投喂頻率對水產(chǎn)動物的影響。水產(chǎn)動物的特定生長率和飼料系數(shù)受腸道消化吸收能力的影響[9]，腸道結(jié)構(gòu)的完整性和消化酶活性是影響腸道消化吸收能力的重要因素[10]，因而腸道結(jié)構(gòu)的完整性和消化酶活性更能從本質(zhì)上揭示水產(chǎn)動物對食物的消化吸收情況。投喂頻率通過影響大黃魚(Pseudosciaena crocea)胰蛋白酶活性進(jìn)而能夠影響其生長率[3]，因此完整、健康的腸道是保證水產(chǎn)動物生長的重要基礎(chǔ)。

在牙鲆養(yǎng)殖過程中，疾病是影響成活率的一個重要因素。機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基 (·O2?) 可誘發(fā)一系列病變反應(yīng)，如機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)不能及時清除自由基，則會對機(jī)體造成嚴(yán)重的氧化損傷[11]。自然環(huán)境下，機(jī)體通過超氧化物歧化酶 (SOD) 與自由基間發(fā)生的歧化反應(yīng)來清除自由基。SOD是一種廣泛存在于動植物、微生物中的金屬酶，能將生物體內(nèi)轉(zhuǎn)化為氧氣 (O2) 和過氧化氫 (H2O2)，在生物體的自我保護(hù)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)中發(fā)揮極其重要的作用。歧化反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2可穿透大部分細(xì)胞膜，比有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。過氧化氫酶 (CAT) 存在于所有已知動物的各個組織中，在肝臟中的濃度最高[12]。CAT的作用是促使H2O2分解為分子氧和水，使細(xì)胞免受H2O2的毒害，維護(hù)細(xì)胞的穩(wěn)定性和完整性，起到保護(hù)細(xì)胞的作用[13]。因此，本研究將SOD和CAT活性作為反映魚體健康程度的指標(biāo)。

牙鲆在自然條件下的攝食規(guī)律已被充分研究，但在流水養(yǎng)殖條件下，其養(yǎng)成階段的最佳投喂頻率尚未確定。因此，本研究選擇1齡牙鲆為研究對象，探討了流水養(yǎng)殖條件下不同投喂頻率對牙鲆腸道組織結(jié)構(gòu)和生理生化指標(biāo)的影響，旨在從生理生化水平揭示投喂頻率對牙鲆生長的影響機(jī)制，為提升其養(yǎng)殖管理水平提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗魚與飼料

實驗魚由煙臺市海陽市黃海水產(chǎn)有限公司提供。實驗開始前在馴養(yǎng)池馴養(yǎng)15 d，馴養(yǎng)期間每天投喂2次 (07:00和17:00)。待實驗魚狀態(tài)穩(wěn)定后，挑選健康魚360尾，平均體長 (31.21±0.81) cm、平均體質(zhì)量 (308.71±7.61) g，隨機(jī)分配到9個養(yǎng)殖缸中，每缸40尾，停食1 d后開始實驗。

實驗用飼料為黃海水產(chǎn)有限公司飼料車間提供的自制軟顆粒飼料。具體加工方法：將冰鮮野雜魚粉碎，制成魚漿后混合魚粉、玉米粉，添加誘食劑、維生素、魚油等擠壓成型，于?20 °C冷庫中保存待用。

1.2 實驗系統(tǒng)與日常管理

本實驗于2019年9—11月在黃海水產(chǎn)有限公司進(jìn)行。實驗用容器為9個半徑1.5 m、高1.2 m的圓形玻璃缸，實驗用水為天然海水，經(jīng)砂濾、沉淀處理后通過管道注入實驗缸。實驗期間連續(xù)24 h不間斷充氣，采用自然光。每天用YSI儀(556MPS)檢測水溫 [(22.31±2.31) °C]、鹽度(32.14±3.16)、溶解氧質(zhì)量濃度 [(4.23±0.17) mg·L?1]和 pH (8.20±0.62)。

每次投喂0.5 h后徹底換水并清理糞便。實驗期間根據(jù)實驗缸內(nèi)壁清潔程度清理附著其上的污物，并及時隔離病魚，清除死魚。

1.3 實驗方法

設(shè)置投喂頻率為每天2、3、4次3個實驗組，分別編號為T2、T3、T4，每組設(shè)置3個平行。鮑枳月等[14]研究發(fā)現(xiàn)晨昏時段是牙鲆的攝食高峰期，故將實驗時間段設(shè)置在06:00—18:00。T2組間隔12 h投喂1次，投喂時間分別為06:00和18:00；T3組間隔6 h投喂1次，投喂時間分別為06:00、12:00和18:00；T4組間隔4 h投喂1次，投喂時間分別為06:00、10:00、14:00和18:00。每次均為飽食投喂。

為了計算攝食量 (投喂量?殘餌量)，在實驗開始前對不同數(shù)量的飼料稱質(zhì)量 (g)，并根據(jù)粒數(shù)與相應(yīng)飼料質(zhì)量建立回歸方程：y=0.283x?0.371,R2=0.981，y為殘餌質(zhì)量 (g)，x為殘餌個數(shù)。實驗期間嚴(yán)格按照預(yù)先設(shè)計的投喂策略定時定點投喂飼料，并詳細(xì)記錄每次投喂量。

1.4 樣本采集與處理

每15 d記錄一次實驗魚的體長和體質(zhì)量。從每個實驗缸中隨機(jī)抽取10尾魚，置于已稀釋的麻醉液中 [V(MS-222)∶V(水)=1∶30 000]，約 30 s后從麻醉液中取出，用毛巾擦干魚體表水分，用刻度尺測量體長，用電子天平 (樂祺電子天平，LQC12001，精度0.01 g) 稱質(zhì)量。

實驗結(jié)束后，所有實驗組停食24 h。每缸隨機(jī)抽取3尾魚，麻醉擦干后平放于解剖盤中，用注射器從尾靜脈取血2 mL，不加抗凝劑，置4 °C冰箱中過夜后，用離心機(jī) (賽洛捷克D3024R臺式離心機(jī)) 離心 10 min (4 °C、1 200 r·min?1) ，取上清液并迅速置于?80 °C冰箱保存，用于檢測CAT和總超氧化物歧化酶 (T-SOD)。采血后的解剖樣品魚，分離出胃、腸分別裝入密封袋并置于液氮中，然后轉(zhuǎn)移至?80 °C冰箱中保存；實驗結(jié)束后，將胃、腸解凍后，刮取胃中部和中腸黏液，用預(yù)冷后的生理鹽水稀釋至最佳檢測濃度。

每個實驗缸隨機(jī)取3尾魚解剖取出腸道，立即浸入4%多聚甲醛固定液中固定，送武漢塞維爾生物科技有限公司對中腸切片；將獲得的切片在光學(xué)顯微鏡 (WM-9950)下觀察，測量并統(tǒng)計腸道指標(biāo)。

胃蛋白酶 (PPS)、總蛋白、脂肪酶 (LPS)、CAT和T-SOD均由南京建成生物工程研究所提供的相關(guān)試劑盒測定。

1.5 計算與統(tǒng)計分析

成活率 (Survival rate, SR, %)、增重率(Weight gain rate, WGR, %)、飼料系數(shù) (Feed conversion ratio, FCR, %)、攝食量 (Food consumption, FC, g) 和特定生長率 (Specific growth rate, SGR, %·d?1) 等生長指標(biāo)的計算公式如下：

式中，Q為末期剩余魚數(shù) (尾)，M0為初始平均體質(zhì)量 (g)，F(xiàn)Q為投喂量，M1為末期平均體質(zhì)量 (g)，M2為實驗期間總攝食量(g)，d為總實驗天數(shù) (d)，x為殘餌粒數(shù) (個)。

數(shù)據(jù)采用OriginPro 2018、IBM SPSS Statistics 25.0 和Excel 2019軟件處理，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 ()”表示。結(jié)果經(jīng)單因素方差分析 (Oneway ANOVA)，若結(jié)果顯著，則進(jìn)行鄧肯事后多重比較 (P＜0.05)，檢驗組間差異性。

2 結(jié)果

2.1 投喂頻率對牙鲆攝食量的影響

投喂頻率對牙鲆平均每尾日攝食量有顯著影響，T3組最大 [(8.06±1.47) g]，且與T2組[ (5.63±1.36) g]、T4 組 [(6.07±1.08) g]之間差異顯著 (P＜0.05)；T2與T4組之間差異不顯著 (表1，P＞0.05)。相同時間點下，不同實驗組中每尾魚的平均攝食量逐漸下降；06:00時，T3和T4組的攝食量分別為 (2.24±0.96) g和 (2.00±0.59) g，兩者無顯著差異，但均顯著低于 T2 組 [(2.94±0.91) g，P＜0.05)]；18:00 時，T2和T3組的攝食量分別為 (2.70±0.86) g和(2.36±0.82) g，兩者差異不顯著 (P＞0.05)，但均顯著高于T4 組 [(1.11±0.87) g,P＜0.05]。

表1 投喂頻率對牙鲆攝食量的影響Table 1 Effect of feeding frequency on feeding of P.olivaceus

2.2 投喂頻率對牙鲆生長指標(biāo)的影響

T2和T3組的特定生長率分別為1.13 %·d?1和 1.17 %·d?1，顯著高于 T4 組 (P＜0.05)，T2 與T3組間無顯著差異 (P＜0.05)；T4組的飼料系數(shù)最大 (1.27%)，極顯著高于T2和 T3組 (P＜0.01)，T2和T3組間無顯著差異(P＞0.05)；T3、T2和T4組的增重率依次減小，分別為52.71%、45.37%和32.3%，且3組間差異顯著 [P＜0.05，其中T3和T4組間差異極顯著 (P＜0.01)]；T2和T3組的成活率分別為95%和94%，兩組間無顯著差異；T4組的成活率為80%，極顯著低于T2和T3組(P＜0.01，圖1)。

圖1 投喂頻率對牙鲆生長指標(biāo)的影響*.5%的顯著性水平；**.1%的顯著性水平；后圖同此Figure 1 Effect of feeding frequency on growth of P.olivaceus SGR.Specific growth rate; FCR.Feed conversion ratio; WGR.Weight gain rate; SR.Survival rate;*.Significance level of 5%; **.Significance level of 1%.The same below.

2.3 投喂頻率對牙鲆消化酶和抗氧化酶活性的影響

3組間淀粉酶 (AMY) 活性無顯著性差異(P＞0.05)。T4 組的 LPS 活性為 8.52 U·mg?1，極顯著低于T2和T3組 (P＜0.01，圖2)；T2和T3組間無顯著差異(P＞0.05)。T4組的CAT活性為2.03 U·mg?1，極顯著低于 T2 和 T3 組 (P＜0.01)；T2 和T3組間無顯著差異(P＞0.05)。T3、T2和T4組的PPS活性依次減小，分別為37.76、34.72和27.73 U·mg?1，3 組間差異顯著 (P＜0.05)，其中 T3 與T4組間差異極顯著 (P＜0.01)。T4組的T-SOD活性為 118.58 U·mg?1，顯著低于 T2 和 T3 組 (P＜0.05)；T2和T3間無顯著差異 (P＞0.05)。

圖2 投喂頻率對牙鲆腸道消化酶和抗氧化酶活性的影響Figure 2 Effect of feeding frequency on enzyme activity of intestinal digestive enzymes and immune-related enzymes of P.olivaceus

2.4 投喂頻率對牙鲆腸道組織形態(tài)的影響

牙鲆腸壁結(jié)構(gòu)由內(nèi)到外依次為黏膜層、黏膜下層、環(huán)肌層、縱肌層和漿膜層[15]。本實驗結(jié)果顯示，不同投喂頻率下的牙鲆腸道結(jié)構(gòu)有差異。T4組的腸壁厚度 (IWT) 最小 (202.06 mm)，與T2和T3組間差異極顯著 (P＜0.01)；T2和T3組間差異不顯著 (P＞0.05)。T4組的環(huán)肌厚度 (LMT) 最小 (152.41 mm)，與 T2和T3組間差異極顯著 (P＜0.01)；T2和T3組間差異不顯著 (P＞0.05)。T3組的上皮細(xì)胞厚度 (ETC) 最大 (57.26 mm)，且與T2和T4組間有顯著差異 (P＜0.05)；T2和T4組間差異不顯著 (P＞0.05)。T2和T3組的杯狀細(xì)胞數(shù)(GC) 分別為28.83和31.86，兩組間無顯著差異，但都極顯著高于T4組 (P＜0.01，圖3)。

在40×顯微鏡下，T4組腸絨毛較T2和T3組稀疏，且高度參差不齊，出現(xiàn)斷裂，分叉少，數(shù)量明顯少于T2和T3組，且T4組腸絨毛上皮細(xì)胞不完整，出現(xiàn)缺刻；T2和T3組黏膜層更厚，腸絨毛數(shù)量豐富，排列緊密，分叉多，外側(cè)光滑完整無缺刻，充滿整個腸腔 (圖4-a, 4-c, 4-e)。在100×顯微鏡下，T4組環(huán)肌層與縱肌層間分界線不明顯，肌層明顯薄于其他組；T2和T3組環(huán)肌層與縱肌層的分界線較T4組明顯；T4組肌層和黏膜層間出現(xiàn)空隙 (圖4-b, 4-d, 4-f)。

圖4 不同投喂頻率下牙鲆腸道組織切片觀察a.T2 組 (40×)；b.T3 組 (40×)；c.T4 組 (40×)；d.T2 組 (100×)；e.T3 組 (100×)；f.T4 組 (100×)Figure 4 Histological observation of intestinal structure of P. olivaceus at different feeding frequenciesa.T2 group (40×); b.T3 group (40×); c.T4 group (40×); d.T2 group (100×);e.T3 group (100×); f.T4 group (100×); IW.Intestinal wall; CM.Circular muscle;LM.Longitudinal muscle; GC.Goblet cell

3 討論

3.1 投喂頻率對牙鲆成活率的影響

研究發(fā)現(xiàn)，投喂頻率會影響大西洋鮭 (Salmo salar)[16]、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)[17-18]的成活率。本實驗結(jié)果也顯示投喂頻率影響了牙鲆的成活率。生物體自身的抗逆能力是影響其成活率的因素之一。生物體在代謝過程中會產(chǎn)生超氧自由基和H2O2，二者有毒害作用，若未被及時清除，會影響其對不利環(huán)境的抗逆能力[12-13]。T-SOD和CAT是生物體產(chǎn)生的、專門清除超氧自由基和H2O2的酶，若活性不足會影響其抗逆能力。本實驗結(jié)果顯示，T4組T-SOD和CAT活性顯著低于其他組，因此，較低的T-SOD和CAT活性是導(dǎo)致T4組成活率低的原因之一。

腸黏膜是腸腺和杯狀細(xì)胞等單細(xì)胞腺體生長的組織基礎(chǔ)，其完整性在一定程度上決定了腺體數(shù)量的多少，腸黏膜越完整，腺體數(shù)量則越多[19]。杯狀細(xì)胞是一種單細(xì)胞腺體，其分泌的黏液在腸壁內(nèi)層形成黏膜以保護(hù)上皮細(xì)胞，杯狀細(xì)胞數(shù)量減少會破壞黏膜的完整性，導(dǎo)致腸道抵抗外源性刺激和致病菌入侵的能力降低；杯狀細(xì)胞數(shù)量越少，腸道受外源因素侵染的可能性就越大[20]。從牙鲆腸道的石蠟切片可以看出，T4組腸黏膜的完整性明顯不及其他組，杯狀細(xì)胞數(shù)量也顯著少于其他組。腸道結(jié)構(gòu)不完整是腸道受侵染的結(jié)果，腸黏膜是免疫系統(tǒng)的第一道屏障，該屏障受到破壞后會影響成活率，T4組的低成活率也證實了這一點。

3.2 投喂頻率對牙鲆消化吸收的影響

不同攝食頻率對漠斑牙鲆 (P.lethostigma) 消化道組織結(jié)構(gòu)有顯著影響[21]。本研究發(fā)現(xiàn)投喂頻率越高，對腸道結(jié)構(gòu)和消化酶活性的影響越顯著。牙鲆消化道由口咽腔、食道、胃、幽門垂、小腸和直腸等構(gòu)成[22]。腸壁和肌層起支撐腸道的作用，是腸道消化吸收的組織基礎(chǔ)，T4組的腸壁不如其他組厚，而較薄的腸壁會影響腸道的蠕動[22]。腸黏膜中含有大量腸腺，腸腺是一種能夠分泌腸液的腺體，腸液中含有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等消化酶，因此消化酶活性可以反映腸腺數(shù)量的多少[23]。T4組的腸道脂肪酶活性顯著低于其他組，說明T4組腸黏膜中的腸腺數(shù)量不及其他組。消化道中的消化液除少量在腸腺中合成外，大部分由消化腺合成分泌。消化腺是消化系統(tǒng)中具有分泌消化液功能的腺體。胰腺、肝臟、胃腺和腸腺均可分泌消化液，消化液中含有胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等消化酶[22]。當(dāng)投喂頻率每天超過3次時，牙鲆胃蛋白酶和脂肪酶活性受到抑制，但淀粉酶活性未受影響。魚類消化道中淀粉酶活性較低，投喂頻率對淀粉酶的影響不顯著。魚體中胰島素的分泌量不足、受體少，不能對糖代謝進(jìn)行有效調(diào)控，因此相對于畜禽類，魚類對糖類的利用能力較差[24]。投喂頻率對不同水生動物的影響有差異，如投喂頻率會引起瓦氏黃顙魚(Pseudobagrus vachelli) 消化酶活性變化[25]，高投喂頻率使凡納濱對蝦的消化酶和抗氧化酶活性更高[26]，投喂頻率每天超過2次時條石鯛 (Oplegnathus fasciatus) 幼魚的消化酶活性受到抑制[27]。

腸道蠕動能力和消化酶活性會影響生物體對食物的消化吸收，蠕動能力強(qiáng)、消化酶活性高的生物對食物的消化吸收能力更強(qiáng)[22]。飼料系數(shù)反映了生物體對食物的轉(zhuǎn)化能力，T4組的高飼料系數(shù)和低攝食量也證明了不完整的腸道結(jié)構(gòu)和低消化酶活性不利于牙鲆消化吸收食物中的營養(yǎng)物質(zhì)。消化道是生物體從外界獲取營養(yǎng)物質(zhì)的唯一途徑[28]，消化道受損，生物體無法獲取生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，其生長將受到抑制。T4組的低特定生長率和低增重率也證明了這一點。當(dāng)投喂頻率增加到3次·d?1時，實驗魚的攝食量顯著增加，但投喂頻率對該組魚的腸道結(jié)構(gòu)和消化酶活性無顯著影響，因此相對于T2組，T3組增加的飼料能夠被消化吸收。由于T3組吸收了更多的營養(yǎng)物質(zhì)，故其增重率顯著高于T2組。本實驗顯示，投喂頻率為3 次·d?1時，日攝食量最大。這一結(jié)果與Lee等[29]、鮑枳月等[14]和林利民等[30]的研究結(jié)果有差異，可能由實驗方法和實驗魚規(guī)格不同所致，后者研究的是牙鲆仔、稚、幼魚，實驗方法未考慮投喂頻率，而本實驗使用平均體質(zhì)量為308.71 g的成年魚，實驗變量即為投喂頻率。

魚類對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收是其生長發(fā)育的基礎(chǔ)，而消化和吸收主要依靠消化系統(tǒng)完成[31]。消化系統(tǒng)由消化道和消化腺兩部分組成。消化酶活性和消化道結(jié)構(gòu)的完整性在一定程度上決定了水生動物對食物的消化吸收能力，消化酶活性高、消化道結(jié)構(gòu)完整的生物對食物有更高的吸收率，營養(yǎng)物質(zhì)的積累速度更快，因此攝食量也更大。

4 結(jié)論

合適的投喂頻率有助于提高飼料利用率、降低飼料系數(shù)，但投喂頻率過高不利于飼料的轉(zhuǎn)化，且未被攝入的飼料溶解到養(yǎng)殖水體中，會造成水質(zhì)惡化，從而降低養(yǎng)殖動物的成活率。綜上所述，每天投喂2～3次時牙鲆有較高的特定生長率和成活率、較低的飼料系數(shù)，但綜合考慮增重率，投喂頻率為3次·d?1時，牙鲆對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和增重率達(dá)到最大。建議每天在06:00、12:00和18:00共3個時間點投喂3次，日投喂量為體質(zhì)量的1.9%。