趙 利，李海燕，王書(shū)霞

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是臨床常見(jiàn)的一種神經(jīng)系統(tǒng)退變性疾病，調(diào)查顯示PD病人伴有輕度認(rèn)知功能障礙，神經(jīng)元損傷可造成認(rèn)知功能損害，隨著疾病進(jìn)展可發(fā)展為帕金森病癡呆[1-3]。因此，探尋PD發(fā)生及發(fā)展相關(guān)的基因或蛋白有助于減緩疾病進(jìn)展。有研究表明，微小RNA-543-3p(microRNA-543-3p，miR-543-3p)在PD小鼠模型中表達(dá)上調(diào)，但關(guān)于其作用機(jī)制尚未闡明[4]。相關(guān)報(bào)道指出，微小RNA-124(microRNA-124，miR-124)在PD病人中呈低表達(dá)，并可能作為PD治療的潛在生物標(biāo)志物[5]。有研究表明，胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin like growth factor-1，IGF-1)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)水平降低與認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)[6]。本研究以PD病人為觀察對(duì)象，檢測(cè)血清miR-543-3p、miR-124的表達(dá)水平，探究其與PD發(fā)生、發(fā)展及IGF-1、BDNF、NGF水平的相關(guān)性，為揭示PD發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2017年5月—2018年5月本院收治的PD病人80例為PD組，所有病人均符合PD診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。其中，男46例，女34例，年齡(63.54±9.58)歲。收集同期本院體檢中心的健康志愿者50名為對(duì)照組，其中男27名，女23名，年齡(64.32±8.95)歲。兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料完整；未合并高血壓、糖尿病等疾病者。排除標(biāo)準(zhǔn)：心、肺、腎等臟器嚴(yán)重?fù)p傷；合并全身感染性疾??；阿爾茨海默病；血管性癡呆；心、肺等導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙；焦慮、抑郁等心理疾??；意識(shí)障礙。根據(jù)Hoehn-Yahr分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[8]對(duì)PD病人進(jìn)行評(píng)分，將病人分為1期16例，2期24例，3期13例，4期15例，5期12例。帕金森評(píng)定量表(UPDRS)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0～<50分為輕度；50～<100分為中度；100～199分為重度[9]，根據(jù)UPDRS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)將PD病人分為輕度27例、中度31例、重度22例。根據(jù)蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表(Montreal Cognitive Assessment，MoCA)將PD病人分為輕度認(rèn)知功能障礙(PD-MCI)33例，無(wú)認(rèn)知功能障礙(PD-NCI)47例。MoCA評(píng)分≥26分為認(rèn)知功能正常，MoCA評(píng)分<26分為認(rèn)知功能障礙[10]。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 采集血液樣本 所有研究對(duì)象均采集清晨空腹靜脈血5 mL，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，吸取血清放入EP管內(nèi)，置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)miR-543-3p、miR-124的表達(dá)水平 根據(jù)Trizol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)說(shuō)明書(shū)提取血清中的總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度與純度，RNA OD260/OD280為1.8～2.0。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)(北京天根生化科技有限公司生產(chǎn))將總RNA合成cDNA，miR-543-3p正向引物5′-ATTCGCGGTGCACTTCTTTT-3′，反向引物5′-GCATCGACT AGCTGGCATC-3′；miR-124正向引物5′-CCTGGTATCCACTGTAGGCC-3′，反向引物5′-TCAGCTCAGCATCGACTAGG-3′；U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCA CATATACT-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。以cDNA進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)(北京天根生化科技有限公司)，擴(kuò)增反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物0.8 μL，cDNA 2 μL，雙蒸水(ddH2O)補(bǔ)足體系至20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃、2 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共40次循環(huán)。miR-543-3p、miR-124以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-543-3p、miR-124相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清IGF-1、BDNF、NGF水平 采用ELISA法檢測(cè)血清IGF-1、BDNF、NGF水平，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物研究所，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 PD組與對(duì)照組血清miR-543-3p、miR-124表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，PD組血清miR-543-3p表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，miR-124表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 PD組與對(duì)照組血清miR-543-3p、miR-124表達(dá)水平比較(±s)

2.2 不同Hoehn-Yahr分期PD病人血清miR-543-3p、miR-124表達(dá)水平比較 與1期、2期比較，3期、4期、5期PD病人血清miR-543-3p的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，miR-124的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與3期比較，4期、5期PD病人血清miR-543-3p的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，miR-124的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與4期比較，5期PD病人血清miR-543-3p的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，miR-124的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 不同Hoehn-Yahr分期PD病人血清miR-543-3p、miR-124表達(dá)水平比較(±s)

2.3 不同UPDRS評(píng)分組PD病人血清miR-543-3p、miR-124表達(dá)水平比較 與輕度組比較，中度組、重度組血清miR-543-3p的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，miR-124的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與中度組比較，重度組血清miR-543-3p的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，miR-124的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 不同UPDRS評(píng)分組PD病人血清miR-543-3p、miR-124表達(dá)水平比較(±s)

2.4 PD組與對(duì)照組血清IGF-1、BDNF、NGF水平比較 與對(duì)照組比較，PD組血清IGF-1、BDNF、NGF水平明顯降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表4。

表4 PD組與對(duì)照組血清IGF-1、BDNF、NGF水平比較(±s) 單位：ng/mL

2.5 PD病人血清miR-543-3p、miR-124與IGF-1、BDNF、NGF水平的相關(guān)性分析 采用Pearson法分析PD病人血清miR-543-3p、miR-124與IGF-1、BDNF、NGF水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示，miR-543-3p與IGF-1、BDNF、NGF呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，miR-124與IGF-1、BDNF、NGF呈正相關(guān)(P<0.05)。詳見(jiàn)表5。

表5 PD病人血清miR-543-3p、miR-124與IGF-1、BDNF、NGF水平的相關(guān)性

2.6 PD-MCI組與PD-NCI組血清miR-543-3p、miR-124表達(dá)水平比較 與PD-NCI組比較，PD-MCI組血清miR-543-3p的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，miR-124的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表6。

表6 PD-MCI組與PD-NCI組血清miR-543-3p、miR-124表達(dá)水平比較(±s)

3 討 論

miRNA可通過(guò)調(diào)控下游靶基因表達(dá)從而參與神經(jīng)系統(tǒng)性疾病等多種疾病發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，研究表明miR-543-3p表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)炎癥性疾病及膀胱癌等多種疾病發(fā)生及發(fā)展[11-13]。本研究結(jié)果顯示，PD病人血清miR-543-3p的表達(dá)水平明顯升高，隨著Hoehn-Yahr分級(jí)、UPDRS評(píng)分的增高，血清miR-543-3p的表達(dá)水平明顯升高，提示miR-543-3p表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)PD發(fā)生及發(fā)展，并可能在PD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。miR-124表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)PD小鼠神經(jīng)元細(xì)胞增殖[14]。miR-124在PD小鼠模型中表達(dá)下調(diào)，并可在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用[15-16]。本研究結(jié)果顯示，PD病人血清miR-124的表達(dá)水平明顯降低，隨著Hoehn-Yahr分級(jí)、UPDRS評(píng)分的增高，血清miR-124的表達(dá)水平明顯降低，提示miR-124表達(dá)量降低與PD疾病進(jìn)展密切相關(guān)，并可在PD發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。血清學(xué)生物標(biāo)記物廣泛應(yīng)用于認(rèn)知水平評(píng)估，IGF-1屬于多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子，并可促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化等，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元可分泌IGF-1，若病人腦組織損傷發(fā)生時(shí)IGF-1水平降低。BDNF屬于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員并可保護(hù)神經(jīng)元存活及生長(zhǎng)，腦組織中BDNF表達(dá)水平升高可反映神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)能力增強(qiáng)。NGF屬于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子并可促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育，其表達(dá)量減少預(yù)示腦神經(jīng)系統(tǒng)的損傷[17-18]。本研究結(jié)果顯示，PD病人血清IGF-1、BDNF、NGF水平明顯降低，與上述研究結(jié)果相似，提示PD病人伴有認(rèn)知功能損傷。本研究采用Pearson法檢測(cè)PD病人血清miR-543-3p、miR-124表達(dá)與IGF-1、BDNF、NGF的相關(guān)性，結(jié)果顯示，miR-543-3p與IGF-1、BDNF、NGF呈負(fù)相關(guān)，miR-124與IGF-1、BDNF、NGF呈正相關(guān)，說(shuō)明隨著miR-543-3p表達(dá)量升高與miR-124表達(dá)量降低PD病人認(rèn)知水平明顯降低，提示miR-543-3p、miR-124表達(dá)異?？赡芘cPD病人認(rèn)知功能密切相關(guān)。研究表明，PD病人認(rèn)知損害發(fā)生率較高且已威脅人類生命安全[19]。本研究結(jié)果顯示，PD-MCI組血清miR-543-3p的表達(dá)水平明顯高于PD-NCI組，血清miR-124的表達(dá)水平明顯低于PD-NCI組，說(shuō)明PD認(rèn)知功能障礙病人miR-543-3p表達(dá)上調(diào)、miR-124表達(dá)下調(diào)。提示miR-543-3p、miR-124可能成為診斷PD病人認(rèn)知功能障礙的重要指標(biāo)。

綜上所述，PD病人血清miR-543-3p的表達(dá)水平明顯升高，miR-124的表達(dá)水平明顯降低，并可參與PD發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，其表達(dá)量與IGF-1、BDNF、NGF水平密切相關(guān)，可作為判斷PD疾病進(jìn)展及評(píng)估病人認(rèn)知水平的重要輔助指標(biāo)。