基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討康婦炎膠囊治療盆腔炎的分子作用機(jī)制Δ

趙靜霞，高宏杰，貢磊磊，李 君

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院麻醉科，北京 100091；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥信息研究所，北京 100700；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院藥事部，北京 100026)

盆腔炎(pelvic inflammatory disease，PID)是指女性上生殖道(子宮內(nèi)膜、輸卵管、卵巢或盆腔腹膜)感染引起的炎癥，是一種具有嚴(yán)重生殖后遺癥的女性生殖道疾病[1]。2013—2014年美國(guó)國(guó)家健康與營(yíng)養(yǎng)調(diào)查結(jié)果顯示，250萬(wàn)18～44歲女性獲得過(guò)PID診斷[2]；2004年，由北京大學(xué)第一醫(yī)院牽頭組織的全國(guó)14家醫(yī)院的調(diào)查結(jié)果顯示，婦科門診就診患者中，PID患病率約為10.1%[3]。PID是育齡女性的常見病、多發(fā)病，若未得到及時(shí)、積極、正確診療，可引起輸卵管囊腫、肝周圍炎等近期后遺癥和不孕癥、異位妊娠、慢性盆腔炎及PID反復(fù)發(fā)作等遠(yuǎn)期后遺癥，嚴(yán)重影響女性健康及生活質(zhì)量，增加家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)。PID的治療主要以廣譜、經(jīng)驗(yàn)性抗菌藥物治療為主，必要時(shí)進(jìn)行手術(shù)治療[4-6]。但臨床上在治療PID時(shí)，存在抗菌藥物應(yīng)用不當(dāng)、治療療程不夠以及濫用抗菌藥物等問(wèn)題，使得常規(guī)西醫(yī)治療存在一定的局限性。中藥治療PID療效確切、不良反應(yīng)小，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[7]。

根據(jù)臨床表現(xiàn)，PID屬于中醫(yī)學(xué)中“熱入血室”“婦人腹痛”及“帶下病”等范疇，其病機(jī)為濕熱之邪趁虛入體，與沖任之氣血相搏，瘀滯胞宮，或積郁肝經(jīng)，致氣滯血瘀，久則成癥，而瘀阻沖任胞脈，不通則痛[8]?？祴D炎膠囊是由蒲公英、敗醬草、薏苡仁、赤芍、蒼術(shù)、當(dāng)歸、川芎、香附、延胡索、澤瀉和白花蛇舌草11味中藥組成的復(fù)方制劑，具有清熱解毒、化瘀行滯和除濕止帶的功效，針對(duì)PID，藥證相符，臨床療效確切[7]。梁旭東等[9]的研究納入了438例PID患者，隨機(jī)觀察不同治療方案的療效，發(fā)現(xiàn)康婦炎膠囊聯(lián)合抗菌藥物治療PID的療效顯著，且安全可靠。蔡競(jìng)等[10]發(fā)現(xiàn)，康婦炎膠囊可通過(guò)下調(diào)PID兔前炎癥細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素(IL)8]和腹腔粘連相關(guān)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)的表達(dá)，并提高抗炎因子(IL-4、IL-10)的表達(dá)，調(diào)整致炎和抗炎的動(dòng)態(tài)平衡，促使PID性疾病的康復(fù)。何延浩等[11]建立了大鼠PID后遺癥模型，發(fā)現(xiàn)康婦炎膠囊能夠減輕PID模型大鼠的子宮炎癥，提高模型大鼠的臟器指數(shù)及腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，調(diào)整大鼠機(jī)體免疫能力，從而改善大鼠PID后遺癥。目前，關(guān)于康婦炎膠囊治療PID多集中于臨床及藥效學(xué)研究，其治療PID的分子機(jī)制尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)康婦炎膠囊治療PID的活性成分及其作用靶點(diǎn)，為進(jìn)一步的體內(nèi)試驗(yàn)和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 康婦炎膠囊化學(xué)成分來(lái)源

基于中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析工具(bio-informatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMAN-TCM)(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)和中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫(kù)，分別檢索蒲公英、敗醬草、薏苡仁、赤芍、蒼術(shù)、當(dāng)歸、川芎、香附、延胡索、澤瀉和白花蛇舌草等11味中藥的所有化學(xué)成分，建立康婦炎膠囊化學(xué)成分庫(kù)。

1.2 康婦炎膠囊靶標(biāo)預(yù)測(cè)和PID靶標(biāo)收集

基于BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)數(shù)據(jù)庫(kù)，收集11味中藥化學(xué)成分潛在的靶點(diǎn)，合并所有靶點(diǎn)并去重，建立康婦炎膠囊候選靶標(biāo)庫(kù)。在人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(online mendelian inheritance in man，OMIM)(http：//www.omim.org/)中，以“pelvic inflammatory disease”“pelvic infection”為關(guān)鍵詞，對(duì)PID疾病靶標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)收集的靶標(biāo)去重，采用DAVID 6.7數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，建立PID靶標(biāo)庫(kù)。

1.3 康婦炎膠囊藥物靶標(biāo)與PID靶標(biāo)核心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、核心靶標(biāo)功能及通路分析

基于String 10.5數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org)，提取康婦炎膠囊候選靶標(biāo)與PID相關(guān)靶標(biāo)相互作用信息，設(shè)置蛋白種類為“homo sapines”，最高置信度參數(shù)評(píng)分>0.4，其他參數(shù)不變。對(duì)參數(shù)“degree”“betweenness”和“neighborhood”進(jìn)行分析，取值方式為“degree”>中位數(shù)，進(jìn)一步計(jì)算“betweenness”和“neighborhood”，取滿足3個(gè)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征值均>中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)的靶標(biāo)與其相互作用關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 3.5.1軟件構(gòu)建康婦炎膠囊成分靶標(biāo)及PID靶標(biāo)核心網(wǎng)絡(luò)，并將這些核心靶標(biāo)導(dǎo)入DAVIA 6.7數(shù)據(jù)庫(kù)，采用基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析(http://www.genome.jp/kegg/)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析(http://www.geneontology.org http://www.genome.jp/kegg/)分別對(duì)核心網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 康婦炎膠囊化學(xué)成分及其靶標(biāo)預(yù)測(cè)

經(jīng)過(guò)BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選整理獲得康婦炎膠囊中11味中藥的化學(xué)成分共249個(gè)，預(yù)測(cè)靶標(biāo)1 594個(gè)，其中蒲公英化學(xué)成分4個(gè)，預(yù)測(cè)靶標(biāo)89個(gè)；敗醬草化學(xué)成分17個(gè)，預(yù)測(cè)靶標(biāo)265個(gè)；薏苡仁化學(xué)成分3個(gè)，預(yù)測(cè)靶標(biāo)48個(gè)；赤芍化學(xué)成分9個(gè)，預(yù)測(cè)靶標(biāo)50個(gè)；蒼術(shù)化學(xué)成分15個(gè)，預(yù)測(cè)靶標(biāo)314個(gè)；當(dāng)歸81個(gè)成分，預(yù)測(cè)靶標(biāo)1 185個(gè)；川芎84個(gè)，預(yù)測(cè)靶標(biāo)946個(gè)；香附12個(gè)，預(yù)測(cè)靶標(biāo)450個(gè)；延胡索35個(gè)，預(yù)測(cè)靶標(biāo)563個(gè)；澤瀉14個(gè)，預(yù)測(cè)靶標(biāo)168個(gè)；白花蛇舌草4個(gè)，預(yù)測(cè)靶標(biāo)165個(gè)。其中29個(gè)成分重復(fù)，這些藥物中的靶標(biāo)之間有所重合(見表1)。蔡少青等[12]認(rèn)為，中藥不同化學(xué)成分可通過(guò)相繼與靶標(biāo)分子結(jié)合，形成疊加效應(yīng)，共同發(fā)揮作用。對(duì)上述靶標(biāo)合并去重后，共獲得1 594個(gè)靶標(biāo)。

2.2 康婦炎膠囊治療PID核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)分析

通過(guò)OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)，收集PID相關(guān)靶標(biāo)，經(jīng)過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化，去重后共獲得94個(gè)靶標(biāo)。基于STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建康婦炎膠囊潛在靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)“degree”>中位數(shù)為節(jié)點(diǎn)，以此為標(biāo)準(zhǔn)，篩選“degree”“betweenness centrality”和“neighborhood centrality”3個(gè)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征值均>中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)為關(guān)鍵靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)以上條件篩選出關(guān)鍵靶標(biāo)460個(gè)，根據(jù)“degree”顯示前150個(gè)靶標(biāo)，見圖1。圖中，節(jié)點(diǎn)大小與“degree”呈正相關(guān)，其中康婦炎膠囊化學(xué)成分靶標(biāo)143個(gè)，PID疾病靶標(biāo)11個(gè)，藥物靶標(biāo)和疾病靶標(biāo)共4個(gè)。共有靶標(biāo)有神經(jīng)型一氧化氮合酶(NOS1)、CC趨化因子2(CCL2)、SRY相關(guān)高遷移率組蛋白9(Sox9)及前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶(PTGS2)。NOS1是一氧化氮合酶3種亞型之一，也是炎癥的重要介質(zhì)之一，研究結(jié)果表明，抑制NOS1可阻止AP1轉(zhuǎn)錄因子亞基的核異位，減弱炎癥基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)[13]。CCL2是趨化因子中CC家族重要成員，也稱為單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)，PID患者血漿中MCP-1表達(dá)顯著升高，血漿MCP-1濃度的評(píng)估可作為PID診斷的生物標(biāo)志物[14]。此外，慢性非細(xì)菌性前列腺炎(chronic pelvic pain syndrome，CPPS)相關(guān)臨床研究中發(fā)現(xiàn)，CPPS患者血漿中MCP-1水平明顯高于健康人，MCP-1可作為CPPS診斷的生物標(biāo)志物[15]。SOX9作為腫瘤壞死因子α(TNF-α)的下游靶標(biāo)，在牙髓炎和免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[16]。PTGS2也稱為環(huán)氧合酶2(COX2)，也是重要的炎癥介質(zhì)，而COX2衍生的前列腺素是慢性前列腺炎和CPPS的重要治病因素[17]。

圖1 康婦炎膠囊治療PID核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Network diagram of core targets of Kangfuyan capsules in the treatment of PID

2.3 康婦炎膠囊與PID核心靶標(biāo)功能及通路分析

基于DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中GO和KEGG對(duì)150個(gè)藥物和疾病靶標(biāo)進(jìn)行功能和通路分析，對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中富集的P值由小至大排序居前20位的生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行深入分析，以生物學(xué)過(guò)程為縱坐標(biāo)，以基因比率為橫坐標(biāo)構(gòu)建氣泡圖，結(jié)果見圖2(A)。這些核心靶標(biāo)主要富集于ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)的正向調(diào)控(positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、炎癥反應(yīng)(inflammatory response)、蛋白激酶B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(protein kinase B signaling)以及脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路(lipopolysaccharide-mediated signaling pathway)等生物學(xué)過(guò)程。

此外，同樣對(duì)KEGG通路中P值由小到大排序居前20位的通路進(jìn)行分析，以KEGG通路為縱坐標(biāo)，以基因比率為橫坐標(biāo)構(gòu)建氣泡圖，結(jié)果見圖2(B)?？梢姡?50個(gè)核心靶標(biāo)主要富集于查加斯病(美國(guó)錐蟲病)[Chagas disease (American trypanosomiasis)]、cAMP信號(hào)通路(cAMP signaling pathway)、TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、Rap1信號(hào)通路(Rap1 signaling pathway)、PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、趨化因子信號(hào)通路(Chemokine signaling pathway)以及T細(xì)胞受體信號(hào)通路(T cell receptor signaling pathway)。

2.4 康婦炎膠囊治療PID的多維網(wǎng)絡(luò)分析

以KEGG通路富集分子中P值由小至大排序居前20位的通路制作中藥-成分-靶標(biāo)-通路多維網(wǎng)絡(luò)分析，涉及11味藥物的164個(gè)成分以及107個(gè)靶標(biāo)，見圖3。蒲公英中主要含有蒲公英甾醇、酚類和多糖類成分等，上述成分具有抗炎和抗菌作用，如蒲公英甾醇和蒲公英皂苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的炎癥有顯著的抑制作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和核因子κB(NF-κB)通路發(fā)揮抗炎作用[18-20]。敗醬草中富含黃酮、甾體、皂苷和鞣質(zhì)等成分，其中白花敗醬醇具有較強(qiáng)的抗炎作用[21]。白芍中的芍藥苷可抑制炎癥因子TNF-α、Il-1β和iNOS的分泌，降低IκB磷酸化，通過(guò)抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位改善炎癥[22]。當(dāng)歸中的當(dāng)歸揮發(fā)油能夠改善LPS誘導(dǎo)炎癥模型[23]。川芎中的洋川芎內(nèi)酯、A,Z-藁本內(nèi)酯、新蛇床內(nèi)酯和Z-藁本內(nèi)酯可能通過(guò)COX-2、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶2(ERK2)、蛋白激酶C(PKC)、Janus激酶1(JAK1)、JAK2、JAK3及NF-кB抑制蛋白激酶β(IKKβ)、TNF-α，阻礙炎癥信號(hào)傳遞[24]。香附中的Alpha-Cyperone同樣能夠抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子COX-2和IL-6，其作用機(jī)制可能通過(guò)調(diào)控NF-κB有關(guān)[25]。延胡索中的黃連堿、小檗堿、巴馬汀、二氫血根堿和去氫紫堇堿可通過(guò)影響PI3K、JAK、PKC、ERK、IKKβ及TNF-α所在信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用[26]。澤瀉中的澤瀉總?cè)凭哂辛己玫目寡鬃饔肹27]。白花蛇舌草也是治療PID的佳品[28]?？祴D炎膠囊中11味藥材所含的成分可能通過(guò)影響TNF信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路和T細(xì)胞受體信號(hào)通路等通路中的靶標(biāo)IL-6、MAPK14、TNF、NF-κB1、PTGS2、CCL2及NOS3改善炎癥反應(yīng)。

A.GO功能富集分析；B.KEGG通路富集分析A.GO functional enrichment analysis;B.KEGG pathway enrichment analysis圖2 康婦炎膠囊治療PID關(guān)鍵靶標(biāo)基因功能分析Fig 2 Gene function analysis on key targets of Kangfuyan capsules in the treatment of PID

圖3 康婦炎膠囊“藥材-成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Network diagram of “herb-compounds-target-pathway”of Kangfuyan capsule

3 討論

PID多因產(chǎn)后、剖宮產(chǎn)后、流產(chǎn)后以及婦科手術(shù)后細(xì)菌進(jìn)入創(chuàng)面感染而致，近年來(lái)，多由下生殖道的性傳播疾病(sexually transmitted diseases，STD)上行感染至上生殖道而造成。PID多數(shù)以疼痛為主要表現(xiàn)。目前，單用抗菌藥物治療的用藥時(shí)間長(zhǎng)，日后容易遷延，而配合清熱解毒、理氣活血的中藥口服治療，可提高PID的治愈率。此外，PID后遺癥有組織破壞、粘連、增生及瘢痕。采用中醫(yī)活血化瘀的方法治療，有助于恢復(fù)破壞組織、松解粘連、緩解增生及瘢痕形成。中藥復(fù)方制劑康婦炎膠囊具有清熱解毒、化瘀行滯和除濕止帶的功效，能夠有效治療PID和緩解PID后遺癥。但其作用機(jī)制尚未闡明，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，結(jié)合國(guó)內(nèi)外專業(yè)數(shù)據(jù)平臺(tái)和分析軟件，分析了康婦炎膠囊治療PID的潛在靶標(biāo)，并對(duì)關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，構(gòu)建了康婦炎膠囊治療PID的多維網(wǎng)絡(luò)圖。

康婦炎膠囊是由蒲公英、敗醬草、薏苡仁及赤芍等11味中藥組成，通過(guò)相關(guān)數(shù)據(jù)獲得249種成分，上述成分潛在的靶標(biāo)有1 594個(gè)，其中一些成分可能是康婦炎膠囊中的質(zhì)量標(biāo)志物，通過(guò)與相應(yīng)靶標(biāo)相結(jié)合發(fā)揮抗炎作用，從而改善PID及其后遺癥[29]。PID疾病靶標(biāo)收集結(jié)果顯示，PID發(fā)病機(jī)制中94個(gè)靶標(biāo)可能通過(guò)直接或間接作用影響PID的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。中藥的化學(xué)實(shí)體與生命體分子網(wǎng)絡(luò)的交互作用是中藥治療疾病的重要方式[30]。在這些藥物靶標(biāo)和疾病靶標(biāo)中，NOS1、CCL2、Sox9和PTGS2靶標(biāo)是藥物和疾病共有靶標(biāo)，這4個(gè)靶標(biāo)均為炎癥的重要介質(zhì)，在PID或炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用，因此，其可能在康婦炎膠囊治療PID中發(fā)揮主導(dǎo)作用。進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，藥物和疾病組成的核心靶標(biāo)參與了炎癥反應(yīng)、LPS介導(dǎo)的信號(hào)通路、ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)的正向調(diào)控、PI3K信號(hào)的正向調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程，其中LPS通過(guò)識(shí)別細(xì)胞膜上的TLR4受體誘發(fā)炎癥反應(yīng)過(guò)程[31]。此外，這些核心靶標(biāo)參與TNF信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路及T細(xì)胞受體信號(hào)通路等炎癥信號(hào)通路，表明康婦炎膠囊可能通過(guò)干預(yù)上述通路中的核心靶標(biāo)參與了PID及其后遺癥的治療。中藥-成分-靶標(biāo)-通路分析結(jié)果顯示，康婦炎膠囊中的成分不僅可以通過(guò)影響NOS1、CCL2、Sox9和PTGS2靶標(biāo)發(fā)揮藥效，還可以通過(guò)干預(yù)TNF信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路及T細(xì)胞受體信號(hào)通路等通路中的IL-6、MAPK14、TNF、NF-κB1及NOS3等靶標(biāo)參與PID的治療過(guò)程。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，建立了康婦炎膠囊中11味中藥的中藥-成分-靶標(biāo)(藥物和疾病)-通路網(wǎng)絡(luò)，顯示了中藥多成分與靶標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)，并且明確了康婦炎膠囊藥效物質(zhì)及其發(fā)揮治療PID的分子機(jī)制，為康婦炎膠囊治療PID及其后遺癥提供了臨床依據(jù)，也為進(jìn)一步的體內(nèi)外試驗(yàn)提供了重要參考。