蘇瑩瑩, 金朝霞, 崔宇興

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，大連 116034)

番茄在種植生產(chǎn)中常受多種病蟲害影響，由灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)引起的灰霉病易造成番茄生長緩慢，果實(shí)減產(chǎn)[1]。目前，針對(duì)灰霉病的防治主要為化學(xué)防治，但化學(xué)農(nóng)藥長期施用易污染環(huán)境,造成農(nóng)作物累積毒素，危害人體健康。生物防治通過來源于植物根際的促生菌、拮抗菌及其相關(guān)菌制劑對(duì)防治番茄灰霉病起到良好的拮抗及防治效果[2-3]。在植物與病原菌互作過程中，生物及化學(xué)因子可作為誘抗劑激發(fā)植物天然的防御機(jī)制，引發(fā)植物的誘導(dǎo)抗病性[4]。β-氨基丁酸(BABA)是一種非蛋白氨基酸，可從番茄根系物中分離得到，研究表明BABA在番茄[5]、煙草[6]以及馬鈴薯[7]等作物中可通過激發(fā)植物系統(tǒng)抗性來抵抗病害，是一種具有潛能的高效植物誘抗劑。假單胞菌屬是根際益生菌的重要組成部分，作為重要的生防菌，利用競爭作用、產(chǎn)生抗生素等抑菌物質(zhì)以及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性等機(jī)制發(fā)揮抗病效果[8-9]。

根際微生物組成也是反映作物健康情況的重要指標(biāo)，與作物病蟲害的發(fā)生關(guān)系密切。通過改善土壤營養(yǎng)組成、與有機(jī)體互作調(diào)控植物生長、響應(yīng)生物及非生物脅迫等方式參與植物根際微生態(tài)調(diào)節(jié)[10-11]。但在防治番茄灰霉病的機(jī)制研究中，不同誘導(dǎo)因子的防病機(jī)制與番茄根際細(xì)菌群落的關(guān)系尚不明確。研究選取課題組保存的具有廣譜抗性的綠針假單胞菌(Pseudomonascholoeaphtis)PA6以及具有誘抗效果的β-氨基丁酸(BABA)，通過盆栽試驗(yàn)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究不同誘導(dǎo)下的番茄灰霉病發(fā)生及抗性基因的表達(dá)情況，并用高通量測序研究根際細(xì)菌的群落響應(yīng)特征，從植物系統(tǒng)抗性及根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化角度完善番茄抗灰霉病的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

供試番茄品種為“中蔬四號(hào)”，購于青縣王鎮(zhèn)店種子繁育站，生防菌綠針假單胞菌(Pseudomonascholoeaphtis)PA6以及病原菌灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)均由本課題組保藏?；瘜W(xué)試劑β-氨基丁酸(BABA)購自北京索萊寶科技有限公司；育苗土壤按營養(yǎng)土∶蛭石∶椰糠(3∶1∶1)經(jīng)高溫滅菌后混合而成，其中營養(yǎng)土由江蘇淮安蘇淮提供，蛭石及椰糠由淮安淮農(nóng)農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 番茄培養(yǎng)條件

番茄種子經(jīng)過75%乙醇、NaClO消毒，經(jīng)過2 d浸種暗處理催芽，待種子在無菌平皿中長至兩葉一心時(shí)，移至裝有通過高溫滅菌土壤的56 孔育苗盤中。繼續(xù)培養(yǎng)番茄植株至四葉一心期，用于后續(xù)誘導(dǎo)試驗(yàn)。

1.2.2 番茄植株誘導(dǎo)預(yù)處理

配制綠針假單胞菌PA6菌懸液調(diào)整濃度為(1×108mL-1)，并配制0.5 mmol/L的BABA溶液備用。設(shè)3組處理，CK：無菌蒸餾水處理；PA：綠針假單胞菌菌懸液處理；BABA：0.5 mmol/L的BABA溶液處理。利用灌根法，每組60 mL處理液分3次進(jìn)行灌根處理，沿番茄幼苗根部緩慢灌入根際土壤中，每組處理15株，共計(jì)45株。上述處理后的番茄植株繼續(xù)培養(yǎng)2 d后待接種。

1.2.3 灰葡萄孢菌接種及病情調(diào)查

配制灰葡萄孢菌孢子懸液(1×106mL-1)采用葉片噴施法接種病原菌，侵染后植株經(jīng)16 h/8 h光暗交替培養(yǎng)3 d，5 d后觀察發(fā)病情況計(jì)算發(fā)病率，病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照閆艷華等[12]方法計(jì)算病情指數(shù)，并于第5天收集根際土壤及番茄葉片進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 番茄NPR1和PR1基因表達(dá)分析

利用TRIzol法提取番茄葉片總RNA并反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，參照表1相應(yīng)基因引物，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LightCycle?480II)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按照20 μL體系，每個(gè)反應(yīng)包括10 μL的SYBR GREEN I，上下游引物各0.2 μL，cDNA 2 μL并補(bǔ)加7.6 μL ddH2O，引物如表1所示，設(shè)定PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min;95 ℃ 變性15 s,50 ℃ 退火45 s,40個(gè)循環(huán);72 ℃ 延伸10 min。得到抗性基因NPR1、PR1以及番茄內(nèi)參基因actin的Ct值并利用2-ΔΔCT方法進(jìn)行計(jì)算分析基因表達(dá)量的變化。

表1 試驗(yàn)所用引物序列

1.2.5 根際土壤收集

采用抖根法從土壤里取出不同處理組的番茄后，劇烈抖動(dòng)植株根系至僅有1 mm厚度的土壤保留在根系表面，將這部分土壤收集并經(jīng)液氮冷凍后裝入無菌袋中，置于-80 ℃冰箱備用。

1.2.6 土壤微生物DNA提取及16S rDNA高通量測序

采用CTAB方法對(duì)各組根際土壤DNA進(jìn)行提取，并測定DNA純度及濃度，由北京諾禾致源生物信息科技有限公司(天津)對(duì)細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)域利用帶Barcode的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將目標(biāo)條帶進(jìn)行膠回收并純化后進(jìn)行文庫構(gòu)建，使用Thermofisher的Ion S5TMXL進(jìn)行上機(jī)測序。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析及處理

高通量測定試驗(yàn)分析利用Cutadapt V1.9.1軟件對(duì)序列數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，再通過Mothur方法校正去除嵌合體序列獲得有效數(shù)據(jù)，最后采用Uparse v7.0.1001軟件對(duì)所有樣品序列進(jìn)行OTU(Operational taxonomic units)聚類分析，用Mothur方法與SILVA132(http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析，獲得不同分類水平的分類信息，統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成并利用Mothur 1.30.1 軟件繪制作圖。其他試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel處理并用SPSS 23.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠針假單胞菌及BABA誘導(dǎo)處理對(duì)番茄植株灰霉病的影響

由于不同的農(nóng)藝措施會(huì)影響相關(guān)抑菌劑的抗病效果[13]。為排除綠針假單胞菌對(duì)葉片接種病原菌拮抗作用的影響，兩種誘導(dǎo)因子均采用灌根的施用方式，通過對(duì)比番茄植株葉片發(fā)病率及病情指數(shù)可知，誘導(dǎo)處理組的番茄發(fā)病率下降，相比空白對(duì)照組，接種病原菌3 d后綠針假單胞菌處理組病情指數(shù)降低了60.4%，BABA處理組降低了36.6%，第5天不同處理組的發(fā)病率及病情指數(shù)相比第3天均有所上升，但誘導(dǎo)處理組的發(fā)病速率減緩(圖1)?？梢妰煞N誘導(dǎo)因子均能有效改善番茄發(fā)病情況。

(a)發(fā)病率;(b)病情指數(shù)。CK：蒸餾水+灰葡萄孢菌;PA：綠針假單孢菌+灰葡萄孢菌;BABA：BABA+灰葡萄孢菌。不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 抗性基因NPR1及PR1的表達(dá)分析

由植物系統(tǒng)抗病性引發(fā)的防御反應(yīng)被多個(gè)基因調(diào)控，受誘導(dǎo)因子影響會(huì)激發(fā)不同的信號(hào)通路，促進(jìn)抗性基因的表達(dá)。NPR1作為植物誘導(dǎo)抗病性中多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)，位于SA信號(hào)通路下游，PR基因上游[14-15]。在植物被誘導(dǎo)產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性(SAR)時(shí)，SA信號(hào)通路被激活，PRs等病程蛋白基因會(huì)做出響應(yīng)，其中編碼PR-1a蛋白的PR1基因是植物抗病性變化的重要標(biāo)志[16]。如圖2所示，經(jīng)綠針假單胞菌以及BABA誘導(dǎo)后，NPR1基因上調(diào)表達(dá)，分別為對(duì)照組的3.3倍和2.4倍。兩組誘導(dǎo)處理中PR1基因的表達(dá)量約為對(duì)照組的2.9倍?？梢娤鄬?duì)未經(jīng)誘導(dǎo)預(yù)處理的對(duì)照組，兩個(gè)誘導(dǎo)處理組的番茄葉片中NPR1及PR1基因均顯著上調(diào)。喬俊卿等[17]發(fā)現(xiàn)經(jīng)枯草芽孢桿菌PTS-394預(yù)處理的番茄，防御基因NPR1，PR-1a基因短期高表達(dá)，有效減輕了植株灰霉病情況。研究利用不同誘導(dǎo)處理得到類似結(jié)果，表明兩種誘導(dǎo)處理均可誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，激發(fā)SA信號(hào)通路，進(jìn)而提高番茄抵抗病原菌的能力。

CK：蒸餾水+灰葡萄孢菌;PA：綠針假單孢菌+灰葡萄孢菌;BABA：BABA+灰葡萄孢菌。**表示相關(guān)性達(dá)到顯著水平(P<0.01)

2.3 16S rDNA測序鑒定分析根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

2.3.1 樣品組間主坐標(biāo)分析

基于加權(quán)的主坐標(biāo)分析結(jié)果如圖3所示，前兩個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為42.61%，分別以24.78%、17.83%的貢獻(xiàn)率成為解釋CK、PA及BABA等3組樣品差異的最大特征。BABA及CK處理在PC2軸上相距較遠(yuǎn)，PA及CK處理在PC1軸上相距較遠(yuǎn)，說明BABA及PA處理都使根際細(xì)菌群落組成發(fā)生改變。PA及BABA處理在PC1及PC2軸上都相距了一定距離，表明PA及BABA誘導(dǎo)處理下的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯。3種處理的組間距離較遠(yuǎn)、組內(nèi)間距較近，說明組內(nèi)群落結(jié)構(gòu)相似，組間群落結(jié)構(gòu)差異顯著。

CK：蒸餾水+灰葡萄孢菌;PA：綠針假單孢菌+灰葡萄孢菌;BABA：BABA+灰葡萄孢菌

2.3.2 根際細(xì)菌OTU特異性分析

綠針假單胞菌及BABA誘導(dǎo)處理樣品間共有、特有的OTU情況(圖4)顯示，誘導(dǎo)處理組及對(duì)照組的番茄根際土壤中的細(xì)菌OTU數(shù)目存在差異。其中，CK、PA以及BABA 等3組的OTU數(shù)目分別為1 592、1 473和1 671，三者OTU數(shù)量表現(xiàn)為BABA處理組>CK組>PA處理組，說明BABA處理中的細(xì)菌種類最豐富。3組共有的OTU數(shù)目為852，且為各組細(xì)菌OTU數(shù)目的50%以上，說明各處理組優(yōu)勢菌基本組成相似。PA及BABA組共有的細(xì)菌OTU數(shù)量為1 221，其中PA組中特有252個(gè)細(xì)菌OTU，而BABA組中特有細(xì)菌OTU數(shù)量為450，說明不同誘導(dǎo)處理中，BABA預(yù)處理根際土壤具有特異性細(xì)菌的菌群更多。

CK：蒸餾水+灰葡萄孢菌;PA：綠針假單孢菌+灰葡萄孢菌;BABA：BABA+灰葡萄孢菌

2.3.3 門水平根際細(xì)菌優(yōu)勢菌比較

由圖5可知，在門水平上，CK、PA以及BABA等3組樣品的優(yōu)勢菌門大致相同，各樣品中比例最高的為變形菌門(Proteobacteria)，其他高豐度優(yōu)勢菌門主要為擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)以及厚壁菌門(Firmicutes)。由圖6可知，變形菌門(Proteobacteria)在各組所占比例分別為CK 33.61%、PA 41.39%、BABA 41.81%，經(jīng)誘導(dǎo)預(yù)處理后，高豐度菌群中變形菌門(Proteobacteria)豐度在PA及BABA組中均顯著上升，低豐度菌群中浮霉菌門(Planctomycetes)及酸桿菌門(Acidobacteria)豐度下降。門水平上優(yōu)勢菌組成不受誘導(dǎo)處理的影響，但菌群豐度存在差異，這與賴寶春等[18]關(guān)于辣椒不同感病情況根際細(xì)菌的門水平分析相似。

CK：蒸餾水+灰葡萄孢菌;PA：綠針假單孢菌+灰葡萄孢菌;BABA：BABA+灰葡萄孢菌

CK：蒸餾水+灰葡萄孢菌;PA：綠針假單孢菌+灰葡萄孢菌;BABA：BABA+灰葡萄孢菌

2.3.4 屬水平根際細(xì)菌優(yōu)勢菌比較

從8個(gè)主要細(xì)菌門中篩選出豐度排在前35的菌屬。由圖7可知，CK組主要富集芽孢桿菌屬(Bacillus)、lamia菌屬、擬桿菌(Bacteroides)、類卡諾氏菌屬(Nocardioides)、微桿菌屬(Microbacterium)，一些不明細(xì)菌菌屬也有較高豐度，但這些菌屬在PA組及BABA組中的豐度均有所下降。與CK相比，兩個(gè)誘導(dǎo)處理組都明顯富集短波單胞菌屬(Brevundimonas)、成對(duì)桿菌屬(Dyadobacter)以及鞘脂菌屬(Sphingobium)。彭方仁等[19]從油茶根際分離得到一株具有潛在固氮作用的鞘脂菌屬，可改善土壤磷成分；孫卓等[20]分離自人參根際土壤得到的土壤短波單胞菌對(duì)人參銹腐病具有防治作用；呂娜娜等[21]發(fā)現(xiàn)成對(duì)桿菌屬是抑病型蕉園根際土壤的特有菌屬。本研究中番茄經(jīng)綠針假單胞菌PA6以及β-氨基丁酸的誘導(dǎo)處理后，灰霉病病情減輕，番茄根際中短波單胞菌屬、成對(duì)桿菌屬以及鞘脂菌屬豐度均有所上升，猜測上述3種菌屬和番茄根際的豐富度與調(diào)節(jié)植物生長、增強(qiáng)植物抗病性有關(guān)，是潛在的根際生防菌。

CK：蒸餾水+灰葡萄孢菌;PA：綠針假單孢菌+灰葡萄孢菌;BABA：BABA+灰葡萄孢菌

PA組中豐度較高的還有乳桿菌屬(Lactobacillus)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、動(dòng)性球菌屬(Planococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)以及新根瘤菌屬(Neorhizobium)。有研究表明：乳桿菌屬(Lactobacillus)通過產(chǎn)生苯乳酸起到果蔬真菌病害的防治作用[22]；不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)可通過提高土壤脫氫酶活性改善土壤活力[23]；動(dòng)性球菌屬(Planococcus)可作為根際優(yōu)勢菌提高黑果枸杞等鹽生植物適應(yīng)力[24]；假單胞菌屬(Pseudomonas)的部分菌屬常作為主要的植物根際促生菌[8]。BABA組豐度較高的還有Pontibacter菌屬、Salinimicrobium菌屬、溶桿菌屬(Lysobacter)、副球菌屬(Paracoccus)以及Chryseomicrobium菌屬。其中溶桿菌屬可通過改善根系環(huán)境促進(jìn)大蒜苗期生長[25]；Salinimicrobium在鹽生植物黑果枸杞的根際高豐度富集可改善植物抗逆性[24]。

3 結(jié)論

研究表明綠針假單胞菌PA6及BABA兩種誘導(dǎo)因子可降低番茄接種病原菌后的發(fā)病率及病情指數(shù)，增強(qiáng)抗性基因NPR1、PR1表達(dá)量，激發(fā)SA信號(hào)通路使番茄產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，根際菌群分析中門水平的優(yōu)勢菌組成不受誘導(dǎo)處理影響，但門水平及屬水平上的優(yōu)勢菌豐度差別顯著，根際益生菌群豐度顯著上升。郝劍霞等[26]采用2種外源物質(zhì)(菌種S.fredii及促生劑DSC)研究對(duì)大豆農(nóng)藝特征及根際菌群的影響，發(fā)現(xiàn)根際土壤存在功能菌群作為植物營養(yǎng)及相關(guān)生化反應(yīng)來源，外源物質(zhì)優(yōu)化了菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)而改善植物生長。與此類似，研究中不同誘導(dǎo)處理引起菌群種類及豐度的明顯變化。BABA主要通過激活植物的活性氧保護(hù)機(jī)制，引起植株抗性成分變化提高植株抗逆性及抗病性[27]，假單胞菌屬可以激發(fā)植物誘導(dǎo)抗性，其本身也可通過根際定植及合成次生抗性代謝物參與根際菌群結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)植物微生態(tài)，間接改善植物生長[9,28]。相比BABA處理，PA處理的防治效果更佳，推測綠針假單胞菌可能直接調(diào)整根際功能菌群，其功能菌群與植物抗病性關(guān)系更密切，通過植物-微生物互作強(qiáng)化誘導(dǎo)抗病的效果以防治番茄灰霉病。后續(xù)將重點(diǎn)分析對(duì)應(yīng)功能菌屬引發(fā)的番茄根際效應(yīng)及誘導(dǎo)抗性機(jī)制，為番茄灰霉病的生防機(jī)制提供理論依據(jù)。