翁曉夢，李 玲，德小明，李麗萍，宋貝貝，黃金瑞，郭曉英，馬慧穎

（寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院職業(yè)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，寧夏環(huán)境因素與慢性病控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004）

鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)（phthalic acid esters，PAEs）是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，其中鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP）作為廣泛使用的增塑劑，常用做聚氯乙烯（PVC）制品、塑料袋、工業(yè)涂料、化妝品、食品包裝、輸血袋等的原料，是迄今為止我國產(chǎn)耗量最大、應(yīng)用最為廣泛的增塑劑類型[1]，被列為人類可能致癌物（IARC分類為Group2B[2]。DEHP進(jìn)入體內(nèi)后通過哺乳動(dòng)物腸道水解酶的作用代謝為鄰苯二甲酸單乙基己基酯（MEHP），研究表明MEHP毒性高于DEHP，在PAEs致生殖發(fā)育毒性中發(fā)揮主要作用[3]。體內(nèi)外研究結(jié)果證實(shí)[4]，在胚胎期暴露環(huán)境內(nèi)分泌干擾物引起的表觀遺傳修飾，可以誘導(dǎo)基因表達(dá)的改變，并且這種改變可能在整個(gè)生命周期中持續(xù)存在，表觀遺傳學(xué)最主要的表達(dá)方式之一是DNA甲基化，在MEHP致睪丸間質(zhì)細(xì)胞（TM-3）雄性生殖毒性的研究中，對DNA甲基化水平的研究尚不夠深入，因此本研究擬從表觀遺傳學(xué)的角度來深入探討MEHP的雄性生殖毒性機(jī)制，進(jìn)而為后續(xù)的靶向研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株來源、主要儀器和試劑

睪丸間質(zhì)細(xì)胞株（TM-3細(xì)胞，美國ATCC細(xì)胞研究中心）。HF90 CO2培養(yǎng)箱（中國上海力申科學(xué)儀器有限公司），SW-CJ-1CU超凈工作臺（中國蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），CKX41倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），Neofuge15R高速冷凍離心機(jī)（中國上海力申科學(xué)儀器有限公司），I510全波長酶標(biāo)儀（芬蘭賽默飛世爾公司），LDZM-40KCS-II立式壓力蒸汽滅菌器（中國上海申安醫(yī)療器械廠），BioRad熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀（上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）。

MEHP標(biāo)準(zhǔn)品（純度為97%，美國Sigma公司），DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液、胰酶、胎牛血清、DMSO等（美國Gibco公司），CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒，Hoechst熒光染色試劑盒（中國江蘇凱基生物有限公司），5-甲基胞嘧啶（5-mc）免疫熒光抗體（美國CST公司），熒光二抗（中國北京中杉金橋），柱形核酸純化產(chǎn)品、Prime-ScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green Premix Ex TaqTMⅡ?qū)崟r(shí)熒光定量試劑盒（大連寶生物工程有限公司）、目的基因及內(nèi)參基因引物（中國上海生工生物公司），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

MEHP染毒液配制：用適量的無菌DMSO標(biāo)準(zhǔn)品稀釋質(zhì)量為0.5 g MEHP標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為1.80 mol·L-1母液，然后用無菌培養(yǎng)基梯度稀釋成0（對照組）、50、100、200、400、800μmol·L-1的染毒液備用。

1.2 TM-3細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇TM-3細(xì)胞，離心棄掉凍存液，加入新配制濃度為10%的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后換液；待細(xì)胞增殖至對數(shù)生長期，吸棄舊培養(yǎng)基，加入2 mL PBS清洗，清洗結(jié)束后加入1 mL胰酶消化30 s，然后加入4 mL完全培養(yǎng)基終止消化，制成單細(xì)胞混懸液，平均分置兩個(gè)新培養(yǎng)瓶；新培養(yǎng)瓶中加入完全培養(yǎng)液定容至4 mL，混勻，于37℃、5%CO2、100%相對濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

取處于對數(shù)生長期的TM-3細(xì)胞，胰酶消化后加入完全培養(yǎng)基配成細(xì)胞混懸液，然后吸取100μL加入96孔板（約7000個(gè)細(xì)胞/孔），置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)小時(shí)。待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)基并加入濃度為0、50、100、200、400、800μmol·L-15個(gè)梯度的MEHP染毒液，再將96孔板放置于37℃、5%CO2、100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。向各孔中加入10μL的CCK-8檢測液，37℃孵育1～2 h后，在酶標(biāo)儀450 nm波長下檢測各孔光密度（OD）值并計(jì)算細(xì)胞活力（%）=［（染毒組OD-空白組OD）/（對照組OD-空白組OD）］×100%。

1.4 光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

取處于對數(shù)生長期的TM-3細(xì)胞，胰酶消化后加入完全培養(yǎng)基配成細(xì)胞混懸液，吸取1 mL細(xì)胞混懸液并加入9 mL完全培養(yǎng)基至15 mL的離心管中，分別吸取1 mL細(xì)胞懸液加入4個(gè)培養(yǎng)瓶中，并定容至4 mL，待細(xì)胞鋪滿瓶底60%～70%，加入上述5個(gè)梯度的MEHP染毒液，24 h后于光學(xué)顯微鏡下（×400）進(jìn)行觀察。

1.5 5-mc免疫熒光法檢測細(xì)胞總甲基化水平

實(shí)驗(yàn)原理：通過檢測5-mc的含量來推斷細(xì)胞整體甲基化水平，熒光信號強(qiáng)度可以直接反映細(xì)胞總甲基化水平的高低。

方法：用清潔蓋玻片（14 mm×14 mm）放入24孔板細(xì)胞培養(yǎng)孔中，然后接種少量細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞爬片后（6～8 h），對細(xì)胞進(jìn)行染毒并培養(yǎng)24 h，染毒結(jié)束后用PBS輕柔漂洗3次，每次5 min吸凈PBS后加入1 mL 4%多聚甲醛于室溫固定（20 min），然后去掉多余甲醛再用PBS輕柔漂洗3次；繼續(xù)加入0.3%Triton-100 1 mL，進(jìn)行透化處理（40 min），清洗同上，繼續(xù)加入5%BSA溶液，室溫封閉1 h，吸盡BSA溶液，在每個(gè)爬片加入100μL一抗，4℃過夜，清洗同上；第2天，每個(gè)爬片加入100μL二抗，于室溫避光孵育1 h，清洗同上，最后在載玻片上加一滴抗淬滅劑，用鑷子取出爬片輕輕倒扣在載玻片上，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。在相同熒光顯微鏡觀察條件下隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照，并用Image J軟件計(jì)算平均單個(gè)視野下的熒光強(qiáng)度。

1.6 RT-PCR檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）mRNA表達(dá)水平

用柱形核酸純化試劑盒提取TM-3細(xì)胞總RNA，然后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA合成，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（引物序列見表1），擴(kuò)增條件：95℃30 s，95℃5 s，55℃30 s，40個(gè)循環(huán)。并以95℃10 s，65℃5 s，95℃5 s，測定熔解曲線，以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）作為內(nèi)參基因，DNMTs（包括DNMT1、DNMT3A、DNMT3B）相關(guān)基因mRNA相對含量用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算。

表1 DNMTs相關(guān)基因引物序列

1.7 Hoechst33258熒光染色觀察細(xì)胞凋亡變化

TM-3細(xì)胞爬片同免疫熒光的操作過程，染毒結(jié)束后，用預(yù)冷的Buffer A洗滌細(xì)胞2次，加入1 mL的4%多聚甲醛溶液，固定細(xì)胞10 min，繼續(xù)用Buffer A洗2遍，最后滴加50～100μL Hoechst33258工作液，室溫染色10 min，水沖凈晾干，在相同熒光顯微鏡觀察條件下隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照，并用Image J軟件計(jì)算平均單個(gè)視野下的熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)弱可間接反映MEHP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡變化的程度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MEHP對TM-3細(xì)胞活力的影響

預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置毒物濃度梯度為0、50、100、200、400、800μmol·L-1，染毒24 h后測定OD值；與對照組相比，細(xì)胞活力下降（P均＜0.01），見表2。運(yùn)用Graphpad prism 6.0計(jì)算MEHP的IC50為354.4μmol·L-1，因此選取MEHP終濃度200、400、800μmol·L-1作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的染毒濃度。

表2 不同濃度MEHP作用24 h對TM-3細(xì)胞活力的影響（n=3，±s）

表2 不同濃度MEHP作用24 h對TM-3細(xì)胞活力的影響（n=3，±s）

與對照組相比**P＜0.01。

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2.2 不同濃度MEHP作用24 h后TM-3細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

正常細(xì)胞呈梭形、多邊形等不規(guī)則形狀生長，隨著染毒劑量的增加，貼壁細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞核呈現(xiàn)空泡化，條索狀細(xì)胞增多，且漂浮的死亡細(xì)胞數(shù)逐漸增加，見圖1。

圖1 不同濃度MEHP作用24 h后TM-3細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化（×100）

2.3 MEHP對TM-3細(xì)胞總甲基化水平的影響

與對照組比較，200μmol·L-1組熒光信號最強(qiáng)，400μmol·L-1組次之，800μmol·L-1組最弱，不同濃度MEHP暴露均可引起TM-3細(xì)胞總甲基化水平降低（P均＜0.01），見圖2、表3。

圖2不同濃度MEHP作用24 h對TM-3細(xì)胞5-mc表達(dá)水平的影響（×200）

表3 不同濃度MEHP作用24 h后TM-3細(xì)胞總甲基化水平的變化（n=3，±s）

表3 不同濃度MEHP作用24 h后TM-3細(xì)胞總甲基化水平的變化（n=3，±s）

與對照組相比**P＜0.01。

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2.4 MEHP對TM-3細(xì)胞DNMTs mRNA表達(dá)水平的影響

RT-PCR結(jié)果顯示：與對照組相比，200μmol·L-1組DNMT1mRNA（1.15±0.08）、DNMT3BmRNA（2.28±0.15）相對表達(dá)水平均高于對照組（P＜0.05或＜0.01）；DNMT3AmRNA（1.03±0.12）表達(dá)水平兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；400μmol·L-1組DNMT1mRNA（0.83±0.05）低于對照組（P＜0.01），DNMT3AmRNA（1.91±0.44）和DNMT3BmRNA（2.50±0.09）表達(dá)水平高于對照組（P＜0.05或＜0.01）；800μmol·L-1組DNMT1mRNA（0.50±0.08）低于對照組，DNMT3AmRNA（2.40±0.51）高于對照組（P＜0.01），DNMT3BmRNA（1.02±0.01）表達(dá)水平和對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

圖3不同濃度MEHP對TM-3細(xì)胞DNMTs mRNA相對表達(dá)水平的影響（n=3，±s）

2.5 MEHP對TM-3細(xì)胞凋亡水平的影響

Hoechst33258熒光染色顯示，不同濃度MEHP暴露，均可誘導(dǎo)TM-3細(xì)胞凋亡（P均＜0.01），400、800μmol·L-1兩組可以觀察到明顯的染色質(zhì)固縮，核濃染現(xiàn)象，凋亡細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，見圖4、表4。

圖4 不同濃度MEHP作用24 h誘導(dǎo)TM-3細(xì)胞凋亡形態(tài)變化（×400）

表4 不同濃度MEHP作用24 h誘導(dǎo)TM-3細(xì)胞凋亡情況（n=3，±s）

表4 不同濃度MEHP作用24 h誘導(dǎo)TM-3細(xì)胞凋亡情況（n=3，±s）

與對照組相比*P＜0.05，**P＜0.01。

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3 討論

關(guān)于PAEs類物質(zhì)毒作用機(jī)制的研究進(jìn)展，主要有三個(gè)方向：一是改變下丘腦-垂體-性腺軸的表達(dá)；二是誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷途徑；三是從表觀遺傳學(xué)的角度[5]。在環(huán)境污染物對人類健康造成影響的過程中，表觀遺傳學(xué)發(fā)揮著重要的作用，其中DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)最主要的表達(dá)方式。DNA甲基化是指在DNMTs的催化作用下，將S-腺苷甲硫氨酸（SAM）中的甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸的第5位碳原子上，形成5-mc化學(xué)修飾的過程[6]。在DNMTs中，DNMT1作為哺乳動(dòng)物最主要的維持甲基化酶，表達(dá)于復(fù)制狀態(tài)的增殖細(xì)胞，能夠優(yōu)先催化復(fù)制后半甲基化的DNA雙鏈，使低甲基化的子鏈完全甲基化。DNMT3A和DNMT3B是重新甲基化酶，作用于未甲基化的DNA雙鏈。有研究報(bào)道[7]，在人體尿液中檢測到DNA甲基化和羥甲基化過程的產(chǎn)物：5-甲基-2'-脫氧胞苷（5 mdC）和5-羥甲基-2'-脫氧胞苷（5 hmdC），且尿液中5 mdC和5 hmdC的濃度與接觸PAEs類物質(zhì)的水平呈正相關(guān)關(guān)系。另一項(xiàng)研究表明：由DNA甲基化介導(dǎo)的精子活力，與低水平環(huán)境鄰苯二甲酸酯暴露呈正相關(guān)關(guān)系[8]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著MEHP染毒劑量的增加，細(xì)胞活力逐漸下降；光學(xué)顯微鏡觀察顯示，正常TM-3細(xì)胞呈梭形、多邊形等不規(guī)則形狀生長，隨著染毒劑量的增加，貼壁細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞核呈現(xiàn)空泡化，條索狀細(xì)胞增多，且漂浮的死亡細(xì)胞數(shù)逐漸增加；Hoechst33258熒光染色結(jié)果顯示：隨著染毒劑量增加，MEHP對DNA損傷程度加深，高劑量組的熒光信號最強(qiáng)，且能觀察到明顯的染色質(zhì)濃染、核固縮，增加了細(xì)胞的凋亡水平。本課題組前期研究[9]結(jié)果顯示：MEHP染毒24 h后，細(xì)胞存活率呈現(xiàn)下降趨勢，MEHP染毒能夠誘導(dǎo)GRP78-ATF4-CHOP凋亡通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，能夠與本研究結(jié)果相互驗(yàn)證[10]。5-mc免疫熒光結(jié)果顯示，MEHP導(dǎo)致TM-3細(xì)胞DNA甲基化整體水平降低，與對照組相比，200μmol·L-1染毒組熒光信號最強(qiáng)，400μmol·L-1染毒組次之，800μmol·L-1染毒組綠色熒光信號最弱；陳姣等[11]研究發(fā)現(xiàn)，MEHP可通過降低全基因組5-mc含量，從而促進(jìn)前列腺癌的惡化、轉(zhuǎn)移。有研究報(bào)道[12]，全基因組DNA的低甲基化可引起遺傳的不穩(wěn)定性，誘發(fā)并促進(jìn)腫瘤的惡化，是參與腫瘤進(jìn)展的重要因素。另有研究表明，全基因組DNA低甲基化是細(xì)胞惡化的基本特征之一[13]，與本研究與上述結(jié)果相近。與對照組相比，各組DNMT1和DNMT3BmRNA相對表達(dá)水平呈先升高后降低的趨勢，在200μmol·L-1組可能存在低劑量刺激作用，導(dǎo)致細(xì)胞整體甲基化水平升高，隨著染毒劑量增加，細(xì)胞整體甲基化水平逐漸降低，總體來說MEHP染毒導(dǎo)致TM-3細(xì)胞整體甲基化水平的降低；Li等[14]研究發(fā)現(xiàn)，鄰苯二甲酸二正丁酯（DBP）能夠通過降低DNMT3B的表達(dá)水平誘導(dǎo)異常的PTEN去甲基化，進(jìn)而導(dǎo)致生殖毒性；鄭立娟等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，非甾體類激素己烯雌酚能夠?qū)е滦∈缶讣?xì)胞整體甲基化水平的降低，DNMTs蛋白和mRAN的相對表達(dá)水平也發(fā)生異常改變。上述發(fā)現(xiàn)與本研究結(jié)果相類似。

本次實(shí)驗(yàn)研究的不足之處：首先在檢測細(xì)胞整體甲基化水平方面，僅選取了5-mc免疫熒光技術(shù)進(jìn)行定性檢測，并未進(jìn)行一些定量研究；其次在DNMTs表達(dá)水平方面，并未對其蛋白翻譯水平進(jìn)行檢測，也未加入相關(guān)的甲基化抑制劑進(jìn)行驗(yàn)證。因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，將會更加完善MEHP對DNA甲基化水平影響的實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)一步深入探討表觀遺傳學(xué)在MEHP致雄性生殖毒性中的作用。