閭 蓉，丁彥蕊

（1.江南大學 理學院，江蘇 無錫214122；2.江蘇省媒體設(shè)計與軟件技術(shù)重點實驗室，江蘇 無錫214122）

脂肪酶廣泛存在于動物、植物和微生物中，能催化水解、酯化、酯交換、醇解、酸解等反應(yīng)，并且能在有機溶劑、離子液體等非水相中催化反應(yīng)。脂肪酶在催化反應(yīng)中不需要輔酶，催化效率也較高，所需反應(yīng)條件溫和，有利于降低生產(chǎn)成本。因此，脂肪酶在洗滌劑、食品、造紙、油脂、化妝品、制藥等多個工業(yè)領(lǐng)域中有廣泛應(yīng)用[1-2]。高溫下保持酶的功能活性和結(jié)構(gòu)完整性是許多蛋白質(zhì)生物技術(shù)、食品加工和商業(yè)工業(yè)中應(yīng)用的理想標準，所以對脂肪酶耐熱性的研究是工業(yè)生產(chǎn)的迫切需求。

水作為生物分子的常見溶劑，在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能和生物活性方面發(fā)揮著重要作用[3-6]。蛋白質(zhì)和水之間的相互作用對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、動力學和功能至關(guān)重要[6-8]，也會影響蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性[9-11]。耐熱的蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)-水界面顯示出更豐富的微觀形態(tài)和更高的親水性[11-12]。目前已有一些實驗的方法及計算機模擬的方法可供研究蛋白質(zhì)和水之間的關(guān)系，有研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)會擾亂其水合殼中的水的動力學[7]，而水分子除了調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)動力學[13]，還與蛋白質(zhì)形成氫鍵網(wǎng)絡(luò)直接參與蛋白質(zhì)功能作用[14]，并會介導蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間相互作用[15-18]。然而，蛋白質(zhì)-水之間的耦合動力學并不完全清楚。因此，了解水在生物分子結(jié)構(gòu)和動力學以及從復雜網(wǎng)絡(luò)中最短路徑的角度研究蛋白質(zhì)和水之間的信號傳遞對于揭示其對蛋白質(zhì)功能的影響至關(guān)重要。

復雜網(wǎng)絡(luò)的研究和應(yīng)用目前已滲入到社會學、生物學以及計算機科學等領(lǐng)域，網(wǎng)絡(luò)的研究具有重要的理論和實際應(yīng)用的價值[19]。蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)可通過轉(zhuǎn)換成網(wǎng)絡(luò)來體現(xiàn)，并且蛋白質(zhì)中的殘基之間和殘基-水之間存在相互作用，因此可以殘基、水為節(jié)點，殘基之間及殘基-水的相互作用為邊構(gòu)成殘基-殘基和殘基-水網(wǎng)絡(luò)（簡稱殘基-水全網(wǎng)絡(luò)）。將復雜網(wǎng)絡(luò)中最短路徑的計算應(yīng)用在蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中具有重要的作用。Zhang等利用最短路徑找出與脈絡(luò)膜新生血管（CNV）相關(guān)的候選基因，為治療CNV提供了新的見解[20]。Papaleo等通過詳細分析酶中的最短路徑，從而可更清楚了解酶中殘基之間的通訊[21]。此外，通過計算蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中的最短路徑，可了解網(wǎng)絡(luò)的性質(zhì)并且識別關(guān)鍵殘基[22]。最短路徑選擇就是使用最優(yōu)化的理論方法，搜索兩個節(jié)點之間多條通路中的最短路徑。由于問題以及網(wǎng)絡(luò)的多樣性，求解最短路徑的算法也有很多。其中，經(jīng)典的最短路徑算法主要有Dijkstra算法[23]、Floyd-Warshall算法[24]、Bellman-Ford算法[25]。本研究使用Dijkstra算法來挖掘脂肪酶殘基-水全網(wǎng)絡(luò)中的最短路徑，以獲得脂肪酶中殘基和水之間信號傳遞的動態(tài)變化。

以野生型脂肪酶及其突變體6B在2個溫度（300 K和400 K）下通過300 ns的長時間分子動力學模擬為研究對象，首先以殘基和水為節(jié)點，殘基-殘基及殘基-水的相互作用為邊，構(gòu)建脂肪酶殘基-水全網(wǎng)絡(luò)。然后使用Dijkstra算法對脂肪酶殘基-水全網(wǎng)絡(luò)進行最短路徑識別，分析最短路徑與脂肪酶耐熱性的關(guān)系，從而進一步分析研究水在脂肪酶最短路徑中的作用以及殘基和水之間信號傳遞的動態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 脂肪酶的分子動力學模擬

本研究中的研究對象為野生型脂肪酶（WTL，PDB code：1I6W，Tm：56℃）[26]及其突變體6B（PDB code：3QMM，Tm：78.2℃）[27]。6B是印度研究組Rao等利用多輪體外進化獲得的野生型枯草芽孢桿菌脂肪酶突變體，共12個突變點（A15S、F17S、A20E、N89Y、G111D、L114P、A132D、M134E、M137P、I157M、S163P、N166Y）[27]。野生型WTL和突變體6B的三維結(jié)構(gòu)如圖1所示，其中紅色區(qū)域是α螺旋，黃色區(qū)域是β-折疊，綠色的區(qū)域是loop，藍色的區(qū)域是6B中的突變點。

通過Amber軟件包[28]在300 K和400 K下分別執(zhí)行了300 ns的長時間分子動力學模擬。WTL和6B在包含17 765和16 993個TIP3P水分子的周期性水盒子中溶解，蛋白質(zhì)表面與盒子邊緣的距離為2 nm。分別加入5個和1個氯離子中和系統(tǒng)，最后系統(tǒng)中分別有55 996個原子（WTL）和53 685個原子（6B）。

首先，對包含溶劑、氯離子和脂肪酶氫原子的系統(tǒng)進行10 000步最小化，再對整個系統(tǒng)進行10 000步最小化。在NVT系綜中將系統(tǒng)加熱至300 K，再使用NPT系綜進行多步平衡。用Amber ff99SBildn力場描述原子相互作用，截止距離設(shè)置為1.2 nm，用PME算法[29]描述靜電相互作用和范德華相互作用。通過SHAKE算法[30]來限制所有含氫鍵的伸縮，設(shè)置2 fs的時間步長，每5 000步保存一次軌跡。

圖1 WTL和6B的三維結(jié)構(gòu)Fig.1 The three-dimensional structure of WTL and 6B

1.2 脂肪酶動態(tài)殘基-水全網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

以分子動力學模擬得到的WTL和6B在300 K和400 K下300 ns的運動軌跡為基礎(chǔ)構(gòu)建脂肪酶殘基-水全網(wǎng)絡(luò)。首先用Ring 2.0[31]得到殘基-殘基相互作用的數(shù)據(jù)，設(shè)置不同相互作用的距離閾值分別為氫鍵0.35 nm，鹽橋0.35 nm，二硫鍵0.4 nm，π-π堆積0.7 nm，π-陽離子0.7 nm，范德華相互作用0.08 nm。然后用vmd軟件[32]得到殘基-水相互作用的數(shù)據(jù)，其中氫鍵定義為：如果供體和受體重原子之間的距離＜0.35 nm，角度偏差＜30°，那么它們之間就形成了氫鍵。接著以殘基和水為節(jié)點，殘基-殘基及殘基-水相互作用為邊，構(gòu)建脂肪酶殘基-水全網(wǎng)絡(luò)。每一幀的構(gòu)象編碼為一個脂肪酶殘基-水全網(wǎng)絡(luò)，則模擬時間內(nèi)的所有幀的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成時間軸上的動態(tài)脂肪酶殘基-水全網(wǎng)絡(luò)。

1.3 Dijkstra算法計算最短路徑

殘基和水之間的路徑都會隨著時間的變化而變化。Dijkstra算法[23]可以求得圖中一點到其它任一頂點的最短路徑。本文使用Dijkstra算法對脂肪酶殘基-水全網(wǎng)絡(luò)進行最短路徑挖掘，挖掘出殘基到水之間的路徑，從而進一步了解水對脂肪酶耐熱性的影響。殘基-水全網(wǎng)絡(luò)中的邊權(quán)重是殘基之間以及殘基-水之間的相互作用的數(shù)量，邊權(quán)重越大，就表明節(jié)點之間的連接越強，也就意味著節(jié)點之間的傳輸越快[33-34]。使用Dijkstra算法計算最短路徑時，節(jié)點之間的距離用邊緣權(quán)重的倒數(shù)來表示[35]。

Dijkstra算法的基本思想：假設(shè)脂肪酶殘基-水全網(wǎng)絡(luò)G=（V，E），V是所有節(jié)點的集合，E是網(wǎng)絡(luò)中所有邊的集合。將V分成兩個集合S和U，集合S中存儲的是已經(jīng)求出最短路徑的節(jié)點以及相應(yīng)的最短路徑的長度，集合U中存儲的是除去S中的節(jié)點后還沒有找到最短路徑的節(jié)點。最開始的時候S中只有一個節(jié)點，假設(shè)為起點s（殘基或者水分子），U中節(jié)點的路徑就是“起點s到該節(jié)點的路徑”。求出U中節(jié)點的最短路徑，找出路徑最短的節(jié)點，并將這個節(jié)點加入集合S中，更新U中節(jié)點和節(jié)點對應(yīng)的路徑。接著，再從U中找出路徑最短的節(jié)點，并且將這個節(jié)點加入S中，更新U中的節(jié)點和節(jié)點對應(yīng)的路徑。重復該操作，直到遍歷所有的節(jié)點。

Dijkstra算法求脂肪酶殘基-水全網(wǎng)絡(luò)中最短路徑的具體步驟為：

1）假設(shè)d[s，k]表示起點s到節(jié)點k的最短路徑，初始化時，集合S中只有一個起點s，那么可以記作S={s}，d[s，s]=0。集合U中包含除s之外的其他節(jié)點，假如集合U中的節(jié)點u與起點s鄰接，那么d[s，u]就是節(jié)點u和起點s兩點之間的權(quán)值，如果u和s不鄰接，那么它們之間的距離為無窮大。

2）在集合U中選出一個離起點s最近的節(jié)點u，把u放入到集合S中，此時d[s，u]就是起點s到達節(jié)點u的最短路徑值。同時，將節(jié)點u從集合U中移除。

3）更新集合U中各個節(jié)點到起點s的值，更新的規(guī)則為：將新選入集合S中的節(jié)點u作為所考慮的中心節(jié)點，如果從起點s到節(jié)點j的距離（該路徑經(jīng)過節(jié)點u）小于原來的距離（該路徑不經(jīng)過節(jié)點u），那么更新節(jié)點j的最短路徑值d[s，j]，更新之后的d[s，j]值為d[s，u]+d[u，j]。如果從起點s到節(jié)點j的距離（該路徑經(jīng)過節(jié)點u）大于原來的距離（該路徑不經(jīng)過節(jié)點u），那么就保持起點s到節(jié)點j的值d[s，j]不變。

4）重復步驟（2）和（3），直到把所有節(jié)點加入集合S中時，算法結(jié)束。

2 結(jié)果與討論

2.1 最短路徑的動態(tài)變化

使用Dijkstra算法計算出WTL和6B的殘基-水全網(wǎng)絡(luò)在不同溫度（300 K和400 K）下所有節(jié)點之間的最短路徑后，分別統(tǒng)計所有幀網(wǎng)絡(luò)中殘基到水分子之間的路徑，然后計算了每一條殘基到水分子之間的最短路徑在300幀里的出現(xiàn)次數(shù)，分析最短路徑的動態(tài)變化。兩個節(jié)點之間的最短路徑會隨著時間而變化，如果兩個節(jié)點之間的最短路徑在所有時間幀中的出現(xiàn)次數(shù)＞270（占比＞90%），認為這個路徑是穩(wěn)定的路徑，并且出現(xiàn)次數(shù)越高，就說明這個路徑越穩(wěn)定。

不同溫度下，WTL和6B中穩(wěn)定的最短路徑數(shù)如圖2所示。隨著溫度的升高，WTL和6B中兩個節(jié)點之間形成的穩(wěn)定的最短路徑數(shù)都減少了，說明在高溫下，殘基之間以及殘基-水之間的作用會不斷斷裂和形成，路徑難以保持穩(wěn)定，也就是節(jié)點之間的信號傳遞波動較大。在300 K下，WTL中的穩(wěn)定的最短路徑數(shù)為493，6B中的為542。當溫度升高到400 K時，WTL中穩(wěn)定的最短路徑數(shù)急劇下降成83，6B中的下降為147。顯然，不管是在300 K還是400 K溫度下，6B中的穩(wěn)定路徑數(shù)都大于WTL中的，這可以說明WTL中節(jié)點之間的路徑在高溫下波動較大，信號傳遞受高溫的影響大于6B，并且6B中殘基之間以及殘基-水之間的作用力比WTL穩(wěn)定，信號傳遞更頻繁，殘基之間以及殘基-水之間的作用力有利于脂肪酶的熱穩(wěn)定性[36]。

圖2 不同溫度下WTL和6B中穩(wěn)定的最短路徑數(shù)Fig.2 Number of shortest stable paths in WTL and 6B at different temperatures

2.2 最短路徑與脂肪酶耐熱性的關(guān)系

為了更清楚了解殘基和水之間的信號傳遞，獲得脂肪酶殘基-水全網(wǎng)絡(luò)中所有節(jié)點之間的最短路徑以及在所有時間幀的出現(xiàn)次數(shù)后，統(tǒng)計了WTL和6B在兩種溫度下（300 K和400 K）殘基到水分子之間穩(wěn)定的最短路徑的長度，結(jié)果如圖3所示。隨溫度升高，WTL和6B中殘基到水分子之間的最短路徑長度明顯減少，說明殘基之間以及殘基和水之間的作用力會隨著溫度升高越來越不穩(wěn)定，有的甚至會消失，殘基到水分子之間的信號傳遞強度在高溫下也會降低。由圖3（a）可以看出：在300 K時，WTL和6B中路徑長度最長的為8，即路徑中包含8個節(jié)點，并且6＜路徑的長度≤8的路徑數(shù)都在10個左右。所以接下來主要對300 K下路徑長度排名前10的路徑進行比較分析。在400 K時（圖3（b）），路徑長度最長的只有5，WTL中只有1條路徑長度為5，6B中有8條，明顯大于WTL，但為了比較分析，主要對400 K下路徑長度排名前5的路徑進行提取分析，具體的數(shù)據(jù)如表1、表2和表3所示。

圖3不同溫度下WTL和6B中不同長度路徑的穩(wěn)定的最短路徑數(shù)Fig.3 Number of shortest stable paths with different path length in WTL and 6B at different temperatures

表1 300 K溫度下WTL殘基到水分子之間路徑長度排名前10的穩(wěn)定路徑Table 1 Stable paths from residues in WTL to water molecules at 300 K in the top ten of path length

表2 300 K溫度下6B殘基到水分子之間路徑長度排名前10的穩(wěn)定路徑Table 2 Stable paths from residues in 6B to water molecule at 300 K in the top ten of path length

表3 400 K溫度下WTL和6B殘基到水分子之間路徑長度排名前5的穩(wěn)定路徑Table 3 Stable paths from residues in WTL and 6B to water molecules at 400 K in the top five of path length

從表1和表2可知：300 K時，WTL中的路徑長度最長為8，6B中最長的僅為7，將WTL中與6B中路徑長度一樣的路徑相比，WTL中的這些路徑在所有時間幀的出現(xiàn)次數(shù)普遍都大于6B中的路徑。說明WTL在300 K時殘基到水分子之間的信號傳遞強度稍微強一點。當溫度升高到400 K時（表3），WTL和6B中的路徑長度最長都為5，其中，WTL中路徑長度為5的路徑只有1條，而6B中的5條路徑的長度都為5，并且6B中的路徑長度為5的路徑在所有時間幀中的出現(xiàn)次數(shù)都是大于WTL中路徑長度為5的路徑。這說明：高溫下，與WTL相比，6B中殘基和水分子之間可以形成穩(wěn)定的路徑從而加強殘基和水分子之間的信號傳遞，也體現(xiàn)了6B中殘基與殘基以及殘基與水的作用力更緊密更穩(wěn)定，這維持了脂肪酶的耐熱性[10]。從表4可以看出：WTL和6B最短路徑中的殘基大部分都位于loop和αB。由表5可知：WTL最短路徑中的殘基大部分位于αB和αC，而6B最短路徑中的殘基大部分位于loop和αA。說明：loop和α螺旋中的殘基容易與殘基以及水分子形成穩(wěn)定的相互作用，形成穩(wěn)定的路徑從而加強脂肪酶的結(jié)構(gòu)。一般來說，脂肪酶的loop區(qū)域和turn區(qū)域非常靈活，其次是α螺旋。loop和α螺旋的殘基與殘基以及殘基與水之間的相互作用可以降低loop和α螺旋的靈活性，增強剛性，從而促進蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性[37]。

表4 300 K溫度下WTL和6B殘基到水分子之間穩(wěn)定的最短路徑中的殘基在脂肪酶二級結(jié)構(gòu)中的分布Table 4 Distribution of residues in the shortest stable path from residues in WTL and 6B to water molecules at 300 K in the secondary structure of lipase

表1中，SP1_WTL300和SP2_WTL300中除了起始節(jié)點不一樣，其他路徑中經(jīng)過的節(jié)點都是一樣的，可以認為是相似路徑，同一個酶中的相似路徑，就可以認為是主干路徑。表1中前6條路徑以及SP8_WTL300和SP9_WTL300中都頻繁經(jīng)過His156、His76和Val9，其中位于β5的His76可以分別與loop（β8與αF之間）的His156和β3上的Val9形成穩(wěn)定的氫鍵作用，從而可以加強柔性區(qū)域loop與β5、β3之間的聯(lián)系。從脂肪酶的二級結(jié)構(gòu)，可以看出另外兩條路徑SP7_WTL300和SP10_WTL300可以使得loop（αB與β4之間）與αB之間的關(guān)系更緊密。表2中，6B前3條路徑都為主干路徑，并且SP6_6B300和這3條路徑一樣，都頻繁 經(jīng) 過αB上 的Leu63、Val59、Leu55、Asn51和Lys69這5個節(jié)點，這5個節(jié)點之間都能夠形成穩(wěn)定的氫鍵作用，并且Asn51分別與loop（αB與β4之間）的Gly46和αB上的Tyr49形成范德華力，與Thr47形成氫鍵作用，從而加強了loop與αB之間的聯(lián)系。SP4_6B300、SP7_6B300和SP10_6B300雖然經(jīng)過的節(jié)點不太一樣，但也是加強了loop（αB與β4之間）與αB之間的聯(lián)系。另外，SP5_6B300是連接6B中l(wèi)oop（β6與β7之間）、αC與水分子的重要路徑，SP9_6B300則是加強了6B中的β6，β5，β3，αB以及310螺旋之間的聯(lián)系。以上可以表明300 K溫度下，WTL和6B中經(jīng)過的二級結(jié)構(gòu)差異不是很大，但是隨著溫度的升高，WTL和6B中差異更明顯。結(jié)合表3和表5，SP1_WTL400和SP4_WTL400僅僅是加強了αC內(nèi)部與水之間的信號傳遞，SP3_WTL400也只是使得αB內(nèi)部的結(jié)構(gòu)更緊密。WTL中另外兩條路徑 SP2_WTL400和SP5_WTL400分別加強了loop（αB與β5之間）和αB間的關(guān)系以及β7和β8間的聯(lián)系。SP1_6B400、SP2_6B400和SP3_6B400是主干路徑，它們共同經(jīng)過的節(jié)點為β3上的Met8，310螺旋上的Phe19以及αA的Glu20，這3條路徑的起始節(jié)點分別為位于loop（αB與β4之間）的Val39，β3上的Val7，β4上的Tyr37，所以這3條路徑使得這些區(qū)域連接更加緊密，也加強了這些區(qū)域與水之間的信號傳遞。另外兩條路徑中，SP4_6B400使得αA內(nèi)部的結(jié)構(gòu)更緊密，SP5_6B400則是連接loop和β7的重要路徑，其中Ala113位于脂肪酶最長的loop區(qū)域（β6與β7之間），它可以與另一條loop（β7與β8之間）上的Asp144形成穩(wěn)定的氫鍵作用，可以穩(wěn)定兩個loop區(qū)域，從而穩(wěn)定6B的二級結(jié)構(gòu)?？傊?，這些區(qū)域的最短路徑都可以降低柔性區(qū)域的柔性，從而可以抵抗高溫。

通常310螺旋是不穩(wěn)定的，而且有研究表明：310螺旋的劇烈運動會影響結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[27]。從表4可以看出WTL中的Val96和6B中的Phe19位于310螺旋。WTL中包含Val96的路徑只有SP9_WTL300，其中Val96和β5上的Ile73之間可以形成穩(wěn)定的范德華力。與WTL相比，6B在300 K溫度下包含Phe19的路徑有2條，400 K溫度下有3條，這幾條路徑中Phe19與Val9、Met8和Glu20之間都有形成強大的范德華力，從而穩(wěn)定310螺旋，穩(wěn)定脂肪酶結(jié)構(gòu)。這可以說明6B中通過的310螺旋的信號傳遞比WTL更強更穩(wěn)定。另外，值得注意的是：6B中與Phe19形成范德華力的Glu20位于αA的N端，由Ala20突變而成，可以表明：突變之后的Glu20更容易與水形成氫鍵作用，并且與水形成氫鍵的能力比較穩(wěn)定，A20E突變使脂肪酶熱穩(wěn)定性增強。綜上分析：與WTL相比，不管是300 K還是400 K，6B中的路徑經(jīng)過了更多的二級結(jié)構(gòu)，使得6B中的結(jié)構(gòu)更加緊密，加強了殘基與水分子之間的信號傳遞，穩(wěn)定了脂肪酶的二級結(jié)構(gòu)。

表5 400 K溫度下WTL和6B殘基到水分子之間穩(wěn)定的最短路徑中的殘基在脂肪酶二級結(jié)構(gòu)中的分布Table 5 Distribution of residues in the shortest stable path from residues in WTL and 6B to water molecule at 400 K in the secondary structure of lipase

3 結(jié)語

本研究結(jié)合分子動力學模擬得到WTL和6B的運動軌跡構(gòu)象，構(gòu)建脂肪酶動態(tài)殘基-殘基和殘基-水相互作用網(wǎng)絡(luò)（簡稱殘基-水全網(wǎng)絡(luò)），通過分析兩種脂肪酶在不同溫度下的最短路徑來探討脂肪酶突變與熱穩(wěn)定性之間的關(guān)系，進一步分析研究殘基和水之間的信號傳遞的動態(tài)變化。通過Dijkstra算法對WTL和6B動態(tài)殘基-水全網(wǎng)絡(luò)進行最短路徑計算，發(fā)現(xiàn)：6B在不同溫度下的穩(wěn)定路徑數(shù)都是大于WTL的，說明WTL中的節(jié)點之間的路徑在高溫下波動較大，信號傳遞受高溫的影響大于6B，并且6B中的殘基之間以及殘基-水之間的作用力比WTL穩(wěn)定，信號傳遞更頻繁。接著通過對穩(wěn)定路徑中殘基所在的二級結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)殘基到水分子之間的最短路徑可以減少脂肪酶的柔性區(qū)域loop和α螺旋的柔性，使得脂肪酶結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。與WTL相比，不管是300 K還是400 K，6B中的路徑經(jīng)過了更多的二級結(jié)構(gòu)，使得6B中的結(jié)構(gòu)更加緊密，加強了殘基與水分子之間的信號傳遞，從而可以穩(wěn)定脂肪酶的二級結(jié)構(gòu)。另外，分析結(jié)果還發(fā)現(xiàn)突變體中的突變點A20E在突變之后更容易與水形成穩(wěn)定的氫鍵作用，突變使脂肪酶熱穩(wěn)定性增強。