劉守柱，張蕾蕾，胥佳睿，姜曉嬌，鄭 暖，于迎鑫

(聊城大學 農學院，山東 聊城 252059)

萊氏綠僵菌(Metarhiziumrileyi)舊稱萊氏野村菌(Nomuraearileyi)[1]，是一種在自然界廣泛存在的昆蟲病原菌，可寄生多種鱗翅目害蟲，尤其是對夜蛾科害蟲具有明顯的致病效果，其寄主種類多達60種以上，可以作為生防制劑進行使用[2-3]。利用昆蟲病原微生物進行害蟲防治具有對環(huán)境友好、對天敵安全、對人畜無害等諸多優(yōu)點，但由于病原菌從侵染到發(fā)病需要較長的時間，導致生物防治見效慢，因而未能得到大面積應用[4]。如108個/mL萊氏綠僵菌處理3齡斜紋夜蛾幼蟲后，致死中時(LT50)為5.5～6.6 d[5]，對4齡、5齡幼蟲的LT50則延長至9.8～11 d[6]，致死速度慢是制約M.rileyi應用最主要的瓶頸。

眾所周知，昆蟲病原真菌的侵染過程首先是以孢子附著到昆蟲體壁，然后萌發(fā)形成芽管或附著孢[7]，繼而分泌蛋白酶、幾丁質酶等對昆蟲體壁進行降解[8-12]，芽管穿透體壁進入昆蟲血腔后，在寄主體內以蟲菌體(Hyphal body)的形式進行增殖，蟲菌體形成菌絲后再殺死寄主[13-14]。在此過程中，成功突破昆蟲體壁并進入昆蟲血腔的孢子數量越多，致死速度越快，表皮(Cuticle)是昆蟲抵抗真菌侵染的主要屏障[15]。但是，由于孢子萌發(fā)易受到溫度、濕度、紫外線照射等環(huán)境因素的影響，因而表皮穿透效率較難提高。

相對于提高孢子的體壁穿透效率，化學農藥與微生物農藥混合使用時能更快地提高病原菌的致死速度，如低劑量聯(lián)苯菊酯對金龜子綠僵菌(M.anisopliae)具有協(xié)同增效作用[16]，可以明顯縮短M.anisopliae對亞洲小車蝗的致死時間。鑒于此，測定了亞致死劑量高效氯氰菊酯與M.rileyi聯(lián)合使用對斜紋夜蛾(Spodopteralitura)的致死作用，旨在為提高M.rileyi對害蟲的致死速度提供有效的技術支持。

1 材料和方法

1.1 供試藥劑及菌株

95%高效氯氰菊酯原藥、萊氏綠僵菌(M.rileyi)Nr5772均由聊城大學農學院昆蟲研究室提供。高效氯氰菊酯用丙酮溶解后，用0.1%吐溫-80水稀釋成100 mg/L母液備用。M.rileyi接種在薩氏麥芽糖酵母瓊脂(SMAY)培養(yǎng)基上，在光照培養(yǎng)箱中25 ℃恒溫培養(yǎng)7～8 d，培養(yǎng)皿長滿孢子后備用。

1.2 供試昆蟲及飼養(yǎng)

斜紋夜蛾第1代采購于河南科云生物公司，在人工氣候室內(25 ℃，光暗比=16∶8)用人工飼料進行飼養(yǎng)，飼料的配制參考文獻[17]的方法。斜紋夜蛾1—3齡幼蟲放在200 mL養(yǎng)蟲盒內集中飼養(yǎng)，4齡后轉到30 mL小盒內單獨飼養(yǎng)。

1.3 高效氯氰菊酯對斜紋夜蛾的毒力測定

將高效氯氰菊酯配制成0.625～10 mg/L梯度溶液，采用浸漬法測定其對3、4、5齡斜紋夜蛾幼蟲的致死中濃度(LC50)及10%致死濃度(LC10)，以LC10劑量作為亞致死劑量。試驗時，挑選生長基本一致的各齡期幼蟲，在不同濃度藥液中浸漬10 s，然后放在吸水紙上吸干多余藥液，2 h后檢查供試幼蟲死亡數量。每濃度處理試蟲20頭，重復3次，以0.1%吐溫-80水處理作為對照。

1.4 M.rileyi對斜紋夜蛾的毒力測定

把培養(yǎng)好的M.rileyi孢子從平板上刮到50 mL離心管中，加入適量0.1%吐溫-80水，在漩渦混合儀上充分振蕩混勻，調整濃度為1×109個/mL，10倍梯度稀釋成1×108、1×107、1×106、1×105個/mL孢子懸浮液。挑選蛻皮1 d左右的5齡幼蟲，分別在上述懸浮液中浸漬10 s，然后放在培養(yǎng)皿中自然晾干。每個濃度孢子懸浮液處理20頭試蟲，以0.1%吐溫-80水處理作為對照，重復3次，按1.2的方法進行飼養(yǎng)，每隔12 h檢查死亡蟲數，直至全部死亡或化蛹。

1.5 高效氯氰菊酯與M.rileyi的聯(lián)合毒力測定

為了保證試驗的一致性，選擇5齡幼蟲進行毒力測定。以高效氯氰菊酯對5齡幼蟲的LC10作為亞致死劑量，配制藥液，然后，用此藥液按1.4的方法配制1×105～1×109個/mLM.rileyi孢子懸浮液，并進行聯(lián)合毒力測定，以亞致死劑量的高效氯氰菊酯藥液作為對照，對試驗最終死亡率進行校正。為保證死亡的試蟲均是由于M.rileyi寄生所致，各處理48 h內死亡蟲數不予統(tǒng)計，并從試蟲總數中剔除，以消除高效氯氰菊酯對斜紋夜蛾的急性毒性。

1.6 亞致死劑量高效氯氰菊酯對M.rileyi孢子萌發(fā)及菌絲生長的影響

根據1.3中測定結果，配制亞致死劑量的高效氯氰菊酯溶液，接種適量M.rileyi孢子粉，渦旋振蕩混勻，25 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)96 h，每隔24 h用血球計數板觀察孢子的萌發(fā)情況并計數，計算孢子萌發(fā)率。同時，以不含藥劑的0.1%吐溫-80水作為對照。

制作高效氯氰菊酯含量為亞致死劑量的帶藥SMAY平板，每皿接種3滴(5 μL)孢子懸液，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，觀察測量菌落直徑。以不含藥劑的SMAY平板作為對照。

1.7 數據統(tǒng)計及分析

LC50及LT50采用DPS 7.05軟件的生物測定功能進行計算，致死效果先進行反正弦平方根轉換，然后采用t檢驗進行差異顯著性測定。

2 結果及分析

2.1 高效氯氰菊酯對斜紋夜蛾的毒力

由表1可見，高效氯氰菊酯對3、4、5齡的斜紋夜蛾幼蟲毒力較強，其LC50分別為0.882 8、1.500 2、3.015 4 mg/L，LC10分別為0.171 5、0.184 5、0.537 8 mg/L。低齡幼蟲對高效氯氰菊酯的抵抗力較弱，容易死亡，為了便于試驗操作，選擇較大的5齡幼蟲進行聯(lián)合毒力測定，其亞致死劑量定為0.5 mg/L。

表1 高效氯氰菊酯對斜紋夜蛾的毒力測定結果

2.2 單獨使用M.rileyi對斜紋夜蛾的致死效果

由表2可見，M.rileyi孢子對斜紋夜蛾5齡幼蟲有明顯的致死效果，隨著孢子濃度增大，LT50明顯縮短，但孢子濃度較低時，對斜紋夜蛾的累計致死率不是很高，1×105個/mL處理最終死亡率僅有26.67%，大部分個體均能成功化蛹；濃度超過1×108個/mL時，累計致死率接近或達到100%，說明高劑量處理效果好。M.rileyi單獨使用對斜紋夜蛾5齡幼蟲的LC50為8.22×105個/mL。

表2 萊氏綠僵菌對斜紋夜蛾5齡幼蟲的致死效果

2.3 亞致死劑量高效氯氰菊酯對M.rileyi的增效作用

0.5 mg/L高效氯氰菊酯與M.rileyi聯(lián)合使用有效縮短了M.rileyi對斜紋夜蛾的LT50，降低LC50(表3)，說明高效氯氰菊酯在LC10劑量下對M.rileyi有一定的增效作用。從表2、表3可以看出，雖然M.rileyi各劑量處理LT50沒有大幅縮短，但低劑量1×105個/mL與1×106個/mL處理首次觀察到試蟲死亡的時間較未添加高效氯氰菊酯的處理均提前12 h，高劑量1×108個/mL處理試蟲由95.00%死亡率提高到100.00%，1×109個/mL處理組全部死亡時間則由144 h提前至132 h。

表3 萊氏綠僵菌與亞致死劑量高效氯氰菊酯聯(lián)合使用對斜紋夜蛾5齡幼蟲的致死效果 Tab.3 Lethal effect of M.rileyi combined with sublethal dose of beta-cypermethrin against 5th instar larvae of S.litura

雖然從累計致死率及LT50絕對值分析，添加高效氯氰菊酯后，M.rileyi各劑量處理均獲得一定的增效，但從數據統(tǒng)計分析的結果來看，并不是所有的增幅都有差異顯著性(圖1)。低劑量處理增效作用最明顯，隨著孢子濃度增加，增效作用逐漸降低，高劑量處理則沒有增效作用。

2.4 亞致死劑量高效氯氰菊酯對M.rileyi孢子萌發(fā)和菌絲生長的影響

M.rileyi孢子接種到亞致死劑量的高效氯氰菊酯溶液中后，24 h內未見萌發(fā)，48 h后萌發(fā)率達到0.17%，72 h后萌發(fā)率為2.00%，96 h萌發(fā)率為5.83%。M.rileyi孢子在0.1%的吐溫-80溶液中(對照)的萌發(fā)率與在高效氯氰菊酯溶液的萌發(fā)率沒有顯著差異(圖2A)，說明亞致死劑量高效氯氰菊酯不會抑制M.rileyi孢子萌發(fā)。

將M.rileyi孢子接種到含高效氯氰菊酯帶藥平板后，2～3 d即可形成明顯的菌落，7 d后已經大量產孢，藥劑處理和對照處理的平均菌落直徑分別為1.15 cm 和1.24 cm，經方差分析差異不顯著，說明高效氯氰菊酯0.5 mg/L處理不會影響M.rileyi菌絲生長和產孢(圖2B)。

3 結論與討論

從試驗結果可以看出，高效氯氰菊酯亞致死劑量(0.5 mg/L)對M.rileyi有一定的增效作用，尤其是在孢子濃度較低時增效作用最明顯，但對高濃度孢子的增效作用甚微。分析原因認為，低濃度下，單位時間內孢子萌發(fā)并穿透昆蟲體壁的總體數量較低，但在高效氯氰菊酯的作用下，昆蟲處于輕度中毒狀態(tài)，其表皮在藥劑的作用下可能會發(fā)生一定的結構改變，有利于病菌的體壁穿透，因而成功入侵的孢子數量上升，提高了致死效果。受條件限制，本研究未觀察亞致死劑量的高效氯氰菊對昆蟲體壁的破壞作用，但胡安嶺等[18]報道，甲氧蟲酰肼及氟鈴脲可以改變甜菜夜蛾的體壁結構，從而提高球孢白僵菌的殺蟲效果，兩者或許有類似之處。此外，亞致死劑量的藥劑在一定程度上可以抑制昆蟲的生長發(fā)育，使得蛻皮時間延長，進而延長了孢子的侵染過程，最終導致病原菌致死效果提高。如亞致死劑量的高效氯氰菊酯抑制棉鈴蟲的生長發(fā)育，延長幼蟲的發(fā)育歷期[19]。殺蟲劑的這種亞致死效應普遍存在于各種昆蟲中[20]。

多年以來，殺蟲速度慢、效果不穩(wěn)定一直是制約生物農藥尤其是微生物農藥應用的主要因素。研究M.rileyi在昆蟲體內的發(fā)育過程可以發(fā)現，一旦病原菌成功入侵到昆蟲體內，即可逃避寄主的免疫防御，在寄主血腔中穩(wěn)定、自由地繁殖，直至殺死寄主[13]。顯然，增加病原菌孢子對寄主的表皮穿透效率可以縮短病程，提高致死速度。研究表明，在孢子懸浮液中添加外源營養(yǎng)成分，如甘露糖和維生素C，可以提高孢子萌發(fā)率[21]，該措施可能會提高病原菌的穿透率，但尚缺乏進一步的試驗驗證。

本研究中，雖然高效氯氰菊酯對M.rileyi有增效作用，但在亞致死劑量下既不提高孢子萌發(fā)率，也不會抑制孢子萌發(fā)和菌絲生長，顯示該藥的增效作用不是直接作用于M.rileyi的生長過程，而是來源于藥劑對昆蟲體壁的破壞，或打亂寄主正常的發(fā)育過程從而提高侵染效率，即藥劑的亞致死效應是提高生防菌效果最重要的因素。與本研究結果類似，聯(lián)苯菊酯對金龜子綠僵菌[16]、氟鈴脲對白僵菌[18]、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽和氯蟲苯甲酰胺對白僵菌[22]、咪鮮胺對枯草芽孢桿菌[23]都有增效作用，說明化學農藥與生物農藥混用是解決昆蟲病原菌致死速度慢的有效途徑。

不僅如此，昆蟲病原菌與化學農藥，尤其是低劑量農藥混用，除了提高病原菌的殺蟲效果以外，也可以降低或消除由于農藥亞致死效應所導致的害蟲產卵能力提高、抗藥性提高等不利因素[20,24]，對農藥的生態(tài)毒理研究具有積極的意義。