王紅瑩，李春燕，宋發(fā)軍，林愛(ài)華，孟艷艷

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院&生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430074)

白及(Bletillastriata)是蘭科白及屬多年生草本植物，又名連及草、地螺絲等，具有抗菌、消炎、抗衰老、抗過(guò)敏和止癢等多種藥理作用[1-2]具有較高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3].

植物內(nèi)生菌是具有高度多樣性的微生物資源，寄生在健康植物的各組織、器官內(nèi)以及各細(xì)胞和細(xì)胞間隙之間而不引起植物病變，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，由于基因交流，使其能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性成分[4-5]. 在特定的生理環(huán)境下，植物內(nèi)生菌可促進(jìn)自身和宿主植物分泌活性物質(zhì)提高宿主的抗病性、抗逆性，提升生態(tài)適應(yīng)性. 據(jù)報(bào)道，目前從植物內(nèi)生菌中分離得到的具有拮抗活性的代謝產(chǎn)物包括聚酮類、多肽類、有機(jī)酸類、生物堿、醌類、萜類、黃酮類、內(nèi)酯類及香豆素類等[6]. 從藥用植物中分離得到的內(nèi)生菌可以產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，有些內(nèi)生菌可產(chǎn)生獨(dú)特新穎的次級(jí)代謝產(chǎn)物；有些可產(chǎn)生與宿主具有相似藥理效應(yīng)的活性物質(zhì)[7]. 因此，藥用植物內(nèi)生菌的開(kāi)發(fā)利用具有潛在的理論與實(shí)用價(jià)值. 然而，目前僅有少量白及內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道[8]. 本研究從云南麗江地區(qū)種植的白及塊莖中分離鑒定內(nèi)生細(xì)菌，研究其抑菌活性，以期篩選出具有抑菌活性的優(yōu)良菌株，進(jìn)而研究其代謝產(chǎn)物中的抑菌成分，為后續(xù)深入開(kāi)發(fā)白及內(nèi)生菌資源奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

本研究所用的白及采自云南麗江種植地區(qū)，樣品采集后-80 ℃保存?zhèn)溆?

2×Taq PCR MasterMix、細(xì)菌基因組試劑盒、乙酸乙酯、石油醚、正丁醇、甲醇均購(gòu)自武漢辰田生物.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離及純化

白及內(nèi)生菌的分離及純化參照蘇子敬[2]和本實(shí)驗(yàn)室前期報(bào)道[9]的方法并加改進(jìn). 新鮮的白及塊莖自來(lái)水清洗后取約0.1 g用無(wú)菌水沖洗3次，依次用75%的乙醇、5%次氯酸鈉、75%的乙醇消毒，無(wú)菌水依次清洗. 將最后一步消毒后無(wú)菌水溶液涂布在培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)基上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，說(shuō)明白及塊莖消毒徹底.

白及塊莖組織加適量的生理鹽水輕研磨成懸浮液，適當(dāng)稀釋后涂布培養(yǎng)基，28 ℃ 恒溫培養(yǎng) 3～5 d.待平板上長(zhǎng)出菌落后，用接種環(huán)挑取菌體轉(zhuǎn)接至新的培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，獲得各個(gè)內(nèi)生細(xì)菌的單克隆.

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌菌液抑菌活性測(cè)試

在 LA 培養(yǎng)基中按 1/1000 比例加入受試菌菌液倒平板冷卻備用，將純化后的內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)備用，取20 μL菌液滴在濾紙上，然后將濾紙貼于加有受試菌的培養(yǎng)基上，受試菌分別為金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.au)、大腸桿菌 (Escherichiacoli，E.coli)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus,M.Luteus)、胡蘿卜果膠桿菌(Pectobacteriumcarolovorum,P.Ca). 恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h后觀察抑菌圈的大小. 最后篩選得到一株具有抑菌活性的拮抗菌，編號(hào)為 BSR2010，后續(xù)實(shí)驗(yàn)圍繞該菌株展開(kāi).

1.2.3 菌株BSR2010發(fā)酵產(chǎn)物的提取

將保存在甘油里的BSR2010活化，單菌落轉(zhuǎn)接至LA液體培養(yǎng)基上，28 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h得種子液. 取 100 μL種子液至1000 mL的LA液體培養(yǎng)基放大培養(yǎng)培養(yǎng)3～5 d. 發(fā)酵液渾濁后，按照發(fā)酵液∶有機(jī)溶劑(乙酸乙酯、石油醚、正丁醇)為1∶1的比例萃取，濃縮得后得到發(fā)酵產(chǎn)物粗浸膏. 用甲醇溶解后經(jīng)0.22 μm濾器過(guò)濾后于4 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.4 菌株BSR2010發(fā)酵產(chǎn)物的活性測(cè)定

在LA培養(yǎng)基中加入1/1000的金黃色葡萄球菌備用，將無(wú)菌濾紙貼于培養(yǎng)基上. 分別移取約 20 μL 乙酸乙酯、石油醚、正丁醇萃取物滴加在無(wú)菌濾紙上. 28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h后，觀察抑菌圈的大小.

1.2.5 菌株BSR2010發(fā)酵產(chǎn)物的薄層色譜檢識(shí)

將有機(jī)溶劑萃取的菌株發(fā)酵產(chǎn)物2 μL點(diǎn)在硅膠板上，以乙酸乙酯∶石油醚(9∶1)為展開(kāi)劑，10%的硫酸乙醇溶液顯色.

1.2.6 菌株BSR2010的鑒定

按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書提取菌株 BSR2010 基因組DNA 作為模板，采用引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-TACGG

CTACCTTGTTACGACTT-3′ 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增16S rDNA 基因片段. PCR 反應(yīng)體系條件如下：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min，共 30 個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min；4 ℃保溫. 然后 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳加以鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物由擎科生物測(cè)序．將測(cè)得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，并用軟件MEGA 6.06進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以自展法 (bootstrap)循環(huán)1000次進(jìn)行檢測(cè)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù).

1.2.7 菌株BSR2010抗生性次級(jí)代謝物相關(guān)功能基因的檢測(cè)

以菌株 BSR2010 基因組為模板，擴(kuò)增 2,4-二乙?；冱S酚(2,4-diacetyl phloroglucinol, DAPG)、吩嗅-1-竣酸(phenazine-1-carboxylacid, PCA)、藤黃綠膿菌素(pyoluteorin, PLT)、硝吡咯菌素(pyrrolnitrin, PRN)等 4 種抗生性次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因的保守片段，基因引物如表1所示.

表1 抗生素基因擴(kuò)增引物Tab.1 Primers for antibiotic gene amplification

2 結(jié)果與分析

2.1 白及內(nèi)生菌分離、純化及抑菌活性測(cè)試

利用組織研磨法得到的組織懸浮液涂布于LA培養(yǎng)基上進(jìn)行白及塊莖內(nèi)生細(xì)菌的分離純化，最終分離得到白及內(nèi)生細(xì)菌204株.

分離純化后的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)4種受試菌的抑菌活性進(jìn)行篩選并得到一株具有抑菌活性的拮抗菌，編號(hào)為 BSR2010. 該菌種能夠不同程度地抑制金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、大腸桿菌、胡蘿卜果膠桿菌(圖1,圖2). 其中對(duì)藤黃微球菌的抑制效果最強(qiáng)，抑菌圈直徑為 34 mm，其次為金黃色葡萄球菌，抑菌圈直徑為 22 mm，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑大小為 11 mm，對(duì)胡蘿卜果膠桿菌的抑菌圈直徑大小為 10 mm. 參考《中國(guó)藥理學(xué)》的抗菌活性判斷標(biāo)準(zhǔn)[10]， BSR2010 抗藤黃微球菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)為極敏，抗大腸桿菌和胡蘿卜果膠桿菌表現(xiàn)為中敏. 藤黃微球菌和金黃色葡萄球菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，大腸桿菌和胡蘿卜果膠桿菌屬于革蘭氏陰性菌. 可見(jiàn)，BSR2010 對(duì)革蘭氏陽(yáng)性致病菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，對(duì)于革蘭氏陰性菌的抑制活性相對(duì)較弱.

(a)對(duì)大腸桿菌 (b)對(duì)金黃色葡萄球菌 (c)對(duì)藤黃微球菌 (d)對(duì)胡蘿卜果膠桿菌 圖1 BSR2010菌株對(duì)四種受試菌的抑制活性檢測(cè)Fig.1 Diameter circle images of inhibitory activity of BSR2010 against four tested bacteria

圖2 白及內(nèi)生菌BSR2010抑制4種受試菌生長(zhǎng)的抑菌圈直徑Fig.2 Antibacterial circle diameter of BSR2010 inhibiting the growth of four tested bacteria strains注：a、b和c代表不同致病菌對(duì)菌株BSR2010的抑菌活性的方差分析(P<0.05)的Dun-cans′新復(fù)極差檢驗(yàn)結(jié)果

2.2 菌株BSR2010發(fā)酵產(chǎn)物的提取

從發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量分析可以看出，用于萃取的有機(jī)溶液的種類對(duì)內(nèi)生菌BSR2010發(fā)酵產(chǎn)物的提取有較大的影響(表2). 用乙酸乙酯萃取的發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量最高，為0.2524 g，石油醚和正丁醇萃取的發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量次之，分別為0.1530 g和0.1120 g.

表2 白及內(nèi)生菌BSR2010發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量Tab.2 Quality and antibacterial circle diameter of the fermented metabolites of bacterial strain BSR2010 from Bletilla Striata

2.3 菌株BSR2010發(fā)酵產(chǎn)物檢測(cè)

菌株BSR2010發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制活性結(jié)果如圖3，乙酸乙酯提取物的抑菌活性明顯大于石油醚和正丁醇的提取物，抑菌圈直徑為35 mm，抑菌活性表現(xiàn)為極敏，薄層色譜結(jié)果如圖4所示，用乙酸乙酯萃取的發(fā)酵產(chǎn)物顯示有5條顯色條帶且分離程度良好，同樣顯示出BSR2010的乙酸乙酯部位可能存在多種有效抗菌物質(zhì).

圖3 BSR2010的有機(jī)萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig.3 Antibacterial activity of BSR2010 organic solventon on S.au

(A)乙酸乙酯；(B)石油醚；(C)正丁醇.圖4 BSR2010的有機(jī)萃取物的TLC結(jié)果Fig.4 TLC results of organic solvent extracts of BSR2010

2.4 內(nèi)生菌的分類及鑒定

擴(kuò)增內(nèi)生細(xì)菌BSR2010的16S rDNA序列并測(cè)序，根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，片段大小在 1500 bp左右，結(jié)果如圖5所示. 16S rDNA測(cè)序獲得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上做BLAST序列比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株BSR2010與菌株P(guān)seudmonasfluorescensstrain HN1205(HQ610446.1)序列的相似度高達(dá)99.93%.系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析顯示菌株 BSR2010 與Pseudmonasfluorescensstrain HN1205(熒光假單胞菌)處于同一分支，親緣關(guān)系較近，故將菌株 BSR2010 初步鑒定為假單胞桿菌屬(Pseudomonassp.)(圖5).

圖5 基于16S rDNA 基因序列構(gòu)建的菌株BSR2010與假單胞桿菌屬相關(guān)菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of BSR2010 strain related to Pseudomonas sp. based on 16S rDNA gene sequence

2.5 菌株BSR2010抗生性次級(jí)代謝物相關(guān)功能基因的檢測(cè)

BSR2010 菌株基因組中可檢測(cè)到與 DAPG 合成基因保守區(qū)域phl大小一致的片段(圖6)，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescensstrain ALEB 7B)全基因組中的phlD序列相似度為 100%. 初步推測(cè)菌株BSR2010可通過(guò)產(chǎn)生2,4-二乙?；冱S酚抑制4種供試菌的生長(zhǎng).

M：DL2000 DNA Marker.圖6 phl基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 PCR result of phl gene

3 討論

大部分植物內(nèi)生細(xì)菌是通過(guò)產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物來(lái)抑制病原菌的生長(zhǎng)[11]. 本研究篩選得到的白及內(nèi)生細(xì)菌BSR2010對(duì)供試菌藤黃微球菌(G+)、金黃色葡萄球菌(G+)、大腸桿菌(G-)、胡蘿卜果膠桿菌(G-)均具有抑制效果，但對(duì)于不同的致病菌抑制活性存在差異，可能是因?yàn)榇x產(chǎn)物中的成分對(duì)不同的病原菌敏感度不同[12].

研究結(jié)果表明BSR2010屬于假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，而假單胞菌是土壤和其他環(huán)境中常見(jiàn)的微生物群體，能夠產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物以適應(yīng)環(huán)境的變化，不同環(huán)境中的假單胞菌可以合成不同結(jié)構(gòu)的抗生素如2，4-二乙?；冱S酚(DPAG)、硝吡咯菌素等[13-14]. 本研究篩選到產(chǎn)生的抑菌成分DAPG的關(guān)鍵合成基因phlD. DAPG是一種廣譜抗生素. 產(chǎn)生DAPG菌對(duì)金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌等革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用[15]. 其生物合成基因簇為phlABCDEF. DAPG的前體物質(zhì)藤黃酚由phlD(編碼Ⅲ型PKS的查耳酮合酶)介導(dǎo)合成. 隨后藤黃酚經(jīng)phlABC編碼的各類酶催化形成最終的DAPG. 因此，推斷菌株 BSR2010 可能通過(guò)產(chǎn)生DAPG來(lái)抑制病原菌的生長(zhǎng).

BSR2010菌株的乙酸乙酯部位具有良好的抑菌能力，而石油醚和正丁醇部位的抑菌能力相對(duì)較弱. 據(jù)報(bào)道，中藥白及的乙酸乙酯部位的抑菌活性最強(qiáng)，其中對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的抑制效果明顯[16]. 推斷白及內(nèi)生細(xì)菌BSR2010可能產(chǎn)生與宿主植物白及相似的抑菌活性物質(zhì). 經(jīng)乙酸乙酯萃取物的薄層層析發(fā)現(xiàn)BSR2010的發(fā)酵產(chǎn)物中可能存在不同組分的代謝產(chǎn)物. 本研究后期將進(jìn)一步分離純化得到次生代謝產(chǎn)物的單體化合物并分析其抑菌活性，為開(kāi)發(fā)利用白及內(nèi)生菌資源和篩選活性化合物提供種質(zhì)資源.