陳旅翼，劉鵬，王靜，劉新橋，陸少娟，陳維武

(1 中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074；2 西藏奇正藏藥股份有限公司，林芝 860000)

2019新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染引起的急性肺炎簡稱“新冠肺炎”，該病毒經(jīng)飛沫、接觸等途徑傳播. 研究表明，3CL水解酶是SARS-CoV-2的一個關(guān)鍵蛋白質(zhì)，病毒需要利用它來復(fù)制RNA[1]；ACE2受體蛋白是SARS-CoV-2感染細(xì)胞必需蛋白[2].

《四部醫(yī)典》、《甘露寶瓶》等藏醫(yī)學(xué)經(jīng)典古籍對呼吸道傳染病或疫病的防治都有詳細(xì)闡述，其中《四部醫(yī)典》稱為“年仍奈”. 新冠肺炎屬藏醫(yī)“年仍奈”范疇，具有疫毒性質(zhì).進(jìn)行辨證論治，防治強(qiáng)調(diào)“熱癥催熟與祛邪”相結(jié)合. 本次疫情中，西藏自治區(qū)、青海省衛(wèi)生健康委員會依據(jù)《四部醫(yī)典》及其他古籍文獻(xiàn)中關(guān)于防治瘟疫的記載，提出了防治新冠肺炎的經(jīng)典驗(yàn)方，其中就包括催湯顆粒[3-5]. 催湯，藏語音譯，又譯為“赤湯”，是藏醫(yī)防治感冒、流感的傳統(tǒng)湯劑. 催湯顆粒是在已上市藥品催湯丸的基礎(chǔ)上改變劑型而得[6-8]. 2003年非典流行期間，催湯顆粒(丸)曾被推薦在西藏等地防治使用.催湯丸現(xiàn)被收錄于《中國藥典》2010年版一部.在防治新型冠狀病毒感染的肺炎疫情中，催湯顆粒被列入“甘肅方劑”，并通過應(yīng)急審批用于防疫一線[9-10].

催湯顆粒是在四味藏木香湯[藏木香、懸鉤子莖(去皮、心)、寬筋藤(去皮)、干姜]的基礎(chǔ)上加藏木香膏和三果湯[訶子肉、余甘子、毛訶子(去核)]、螃蟹甲組成. 方中藏木香和藏木香膏清熱涼血，調(diào)龍；干姜調(diào)氣、解郁止痛，除瘀血；寬筋藤清熱解毒，懸鉤子莖清熱涼血、解毒消腫；四藥共用可以將未成熟熱分離開來，促進(jìn)未成熟熱成熟，解表發(fā)汗或?qū)U(kuò)散的病邪收攏后排出體外；訶子調(diào)和人體功能，斂肺下氣、止咳，毛訶子清熱、斂黃水，余甘子清熱涼血，三藥并用調(diào)和三因，調(diào)和諸藥. 《四部醫(yī)典》記載三果(訶子、余甘子、毛訶子)“主治瘟疫、紊亂熱癥、促使熱癥成型”[11]. 螃蟹甲清熱祛風(fēng)，解表，潤喉. 全方具有清熱解表、發(fā)汗、鎮(zhèn)咳止痛、化痰等作用. 用于感冒初期，咳嗽頭痛，關(guān)節(jié)酸痛，預(yù)防流行感冒等[12]. 本研究在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的基礎(chǔ)上[13]獲得催湯顆粒的核心活性化合物，對SARS-CoV-2 3CL水解酶(3CLpro)和ACE2 進(jìn)行分子對接[14]，預(yù)測催湯顆?？剐鹿诓《咀饔?，從而為該方防治新冠肺炎的機(jī)制研究與臨床應(yīng)用提供參考.

1 材料

TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)；化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.htm)；Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www. swisstargetprediction.ch/)；STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)；Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/)；Enrichr數(shù)據(jù)庫(https://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/)；OmicShare平臺(http://www.omicshare.com/tools)；PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)；Cytoscape 3.7.2軟件；Venny 2.1.0在線軟件作圖工具平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)；Sybyl 1.0軟件(美國Tripos公司)；Discovery Studio 2017 R2 Client(DS，美國Accelrys公司開發(fā)，https://www.3dsbiovia.com/).

2 方法

2.1 獲取催湯顆粒的成分

以土木香、余甘子、寬筋藤、懸鉤子、干姜、訶子、毛訶子和螃蟹甲為關(guān)鍵詞，從TCMSP和化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫納入符合口服生物利用度(OB)≥30%及類藥性(DL)≥0.18 的化合物，構(gòu)建催湯顆?；瘜W(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫.

2.2 獲取和預(yù)測成分靶點(diǎn)

PubChem數(shù)據(jù)庫獲取化學(xué)成分的分子結(jié)構(gòu)，保存為sdf文件格式，導(dǎo)入Swiss Target Prediction，設(shè)置屬性為“homo sapiens”，得到化合物的作用靶點(diǎn)，整合、去重后得到靶點(diǎn).

2.3 獲取疾病靶點(diǎn)

以“coronavirus”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索.

2.4 繪制韋恩圖，獲取潛在作用靶點(diǎn)

在Venny2.1.0平臺上分別錄入催湯顆粒和冠狀病毒的靶點(diǎn)，得到兩者的交集，作為潛在作用靶點(diǎn).

2.5 網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建及分析

將藥物活性成分以及2.4項(xiàng)獲得的潛在作用靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，藥物、成分、靶點(diǎn)和疾病分別用不同的顏色表示. 使用Network不著Analyzer功能對藥物中的主要活性成分進(jìn)行分析，節(jié)點(diǎn)的大小代表度(degree)值的大小.

2.6 構(gòu)建蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)

將催湯顆粒治療冠狀病毒的潛在作用靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為0.4，獲取蛋白相互作用信息. 將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件，繪制PPI圖. 其中，節(jié)點(diǎn)的大小和顏色的深淺變化代表度值的大小，并根據(jù)節(jié)點(diǎn)的度值篩選出核心靶點(diǎn).

2.7 通路富集分析

選取活性成分的核心靶點(diǎn)，利用Enrichr 網(wǎng)絡(luò)平臺中GO(gene ontology)和KEGG 通路，以O(shè)micShare平臺構(gòu)建核心靶點(diǎn)的GO 生物過程、細(xì)胞分析、分子功能和KEGG 通路氣泡圖，分析催湯顆?？构跔畈《镜纳镞^程和信號通路.

2.8 活性成分與病毒及ACE2分子對接結(jié)果

從PubChem數(shù)據(jù)庫中下載相應(yīng)化合物結(jié)構(gòu)式(SDF格式)，Sybyl軟件對其進(jìn)行能量優(yōu)化，保存為mol2格式，作為小分子配體.從PDB數(shù)據(jù)庫下載SARS-CoV-2冠狀病毒3CL水解酶(PDB ID：6LU7)和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 II(ACE2，PDB ID：1R4L)的晶體結(jié)構(gòu)，運(yùn)用 Sybyl 軟件對靶蛋白進(jìn)行修飾、加氫及加電荷，將處理后的蛋白保存，作為受體. 利用sybyl1.0軟件Surflex-dock 模塊將小分子配體與受體進(jìn)行分子對接，對接的結(jié)果以打分函數(shù)Total Score 給出，以mol2格式保存. 采用Discovery Studio軟件中receptor-Ligand Interactions模塊對分子對接結(jié)果進(jìn)行分析.

3 結(jié)果

3.1 催湯顆粒的潛在活性成分

通過對催湯顆粒中每味藥材成分進(jìn)行OB和DL篩選，去重后，獲得化合物120個，具體數(shù)據(jù)見表1.

表1 藏藥-成分-靶點(diǎn)基本信息統(tǒng)計Tab.1 Basic information statistics of Tibetan medicine-component-target

3.2 潛在靶點(diǎn)預(yù)測

Swiss數(shù)據(jù)庫中得到的預(yù)測靶點(diǎn)去除重復(fù)后，得到藥物靶點(diǎn)479個(表1). 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫得到疾病靶點(diǎn)291個，兩者取交集后獲得共同靶點(diǎn)60個. 結(jié)果顯示，催湯顆粒可能通過多靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮抗冠狀病毒作用.

圖1 催湯顆粒與冠狀病毒靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venny diagram of Cuitang granules and coronavirus target

3.3 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

經(jīng)分析，60個交叉靶點(diǎn)與催湯顆粒中的75個化合物有關(guān)聯(lián)(表2). 圖2 度值表示預(yù)測出該成分與作用靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)個數(shù)，度值越大越說明該成分越重要. 對網(wǎng)絡(luò)圖通過Network Analyzer分析，結(jié)果顯示在75個與潛在靶點(diǎn)相互作用的活性成分中，6個成分均能與10以上的靶點(diǎn)相連.

表2 交叉靶點(diǎn)的藏藥-成分-靶點(diǎn)基本信息統(tǒng)計Tab.2 Cross-target Tibetan medicine-component-target basic information statistics

3.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

60個藥物-疾病共同靶點(diǎn)錄入STRING數(shù)據(jù)庫中，得到PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系數(shù)據(jù)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)節(jié)點(diǎn)度的中位數(shù)為15.5. 在60個核心靶點(diǎn)中，GAPDH、IL6、TNF、MAPK1、MAPK3、EGFR、MAPK8、CASP3、IL2、ICAM1、JAK1、STAT1、MAPK14、BCL2L1、FGF2、PTGS2、CASP8、LCK、NOS3、PPARG、HMOX1、MCL1、STAT6、PIK3CA、HPGDS、NOS2、PARP1、SERPINE1、HSPA5、PIK3R1這30個靶點(diǎn)的連接度均大于等于中位數(shù)15.5. PTGS2、EGFR、PARP1、TTR、PTGS1、PIK3R1、PPARG、NOS2、PIK3CG均可作用于10個以上的成分.

圖2 催湯顆粒的藏藥-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)Fig. 2 Tibetan medicine-component-target-disease network of Cuitang granules圖中綠色圓圈節(jié)點(diǎn)代表基因，紫色菱形節(jié)點(diǎn)代表化合物，藍(lán)色四方形節(jié)點(diǎn)代表藏藥

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建Fig.3 PPI network construction

3.5 靶點(diǎn)通路分析

將60個潛在靶點(diǎn)經(jīng)Enrichr 網(wǎng)絡(luò)平臺中GO富集分析，得到1390個生物學(xué)過程(P<0.05)、82個細(xì)胞組分、186個分子功能. 以P<0.01為閾值，以Count值排序，分別篩選前20條GO條目，繪制氣泡圖(圖4). 60個潛在靶點(diǎn)經(jīng)Enrichr 網(wǎng)絡(luò)平臺中KEGG分析(P<0.05)，共富集于209條信號通路(圖4(d))，主要涉及HIF-1信號通路、病毒感染通路、TNF信號通路、VEGF信號通路和凋亡相關(guān)通路等.

(a) GO生物過程 (b) GO細(xì)胞分析

3.6 催湯顆粒核心成分的分子對接驗(yàn)證

將3.3中篩選得到的75個化合物分別與 SARS-CoV-2 冠狀病毒3CL 水解酶和 ACE2 靶標(biāo)蛋白進(jìn)行分子對接，Total Score值>4.25說明化合物與靶點(diǎn)具有一定結(jié)合活性，篩選得到42個化合物，結(jié)果見表3和圖5. 催湯顆粒中有6個化合物與SARS-CoV-2 冠狀病毒3CL 水解酶的對接得分>5.0，有25個化合物與ACE2的對接得分>5.0，其中beta-谷甾醇、Phyllanthin、Acanthoside B、反油酸、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷等分別對3CL水解酶和 ACE2 具有很好的結(jié)合活性，總得分值超過12，說明催湯顆粒中的多個化合物能與 3CL 水解酶及ACE2 有較好的結(jié)合活性，顯示催湯顆?？剐鹿诓《镜臐撛谧饔眉捌涮攸c(diǎn).

表3 催湯顆粒核心成分的分子對接驗(yàn)證Tab.3 Molecular docking verification of the core components of Cuitang granules

Beta-谷甾醇-SARS-CoV-2 3CL 水解酶 Phyllanthin -ACE2 圖5 催湯顆粒核心化合物與 SARS-CoV-2 3CL 水解酶和 ACE2 的結(jié)合模式圖Fig.5 Diagram of the binding pattern of Cuitang granules′ core compounds to SARS-CoV-2 3CL hydrolase and ACE2

4 結(jié)語

本研究以“coronavirus”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，涉及479個核心靶點(diǎn)，與冠狀病毒疾病靶點(diǎn)(351個)交叉60個. 將60個潛在靶點(diǎn)做GO富集分析，得到1390個生物學(xué)過程、82個細(xì)胞組分、186個分子功能，共富集于209條信號通路. 生物過程主要涉及細(xì)胞因子介導(dǎo)、細(xì)胞因子調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子刺激和細(xì)胞凋亡等. 在細(xì)胞組分中，靶點(diǎn)主要涉及細(xì)胞器腔、線粒體和質(zhì)膜、溶酶體；在分子功能中，主要涉及各類激酶活性、G蛋白偶聯(lián)趨化因子受體活性、趨化因子結(jié)合和蛋白激酶結(jié)合；KEGG分析得到了與抗病毒相關(guān)的通路主要有HIF-1信號通路、病毒感染通路、TNF信號通路、VEGF信號通路等. 得到的60個關(guān)鍵靶點(diǎn)，大致分為炎癥因子、絲裂原活化蛋白激酶和其他這3類.縱觀催湯顆粒各化合物的作用、靶點(diǎn)的分類、富集的生物學(xué)過程和信號通路，較多地涉及病毒感染、炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)等方面.

COVID-19患者血清中IL-6等細(xì)胞因子的升高已經(jīng)被證實(shí)[15]，因此催湯顆?？赡軈⑴c了IL-6的早期調(diào)節(jié). 此外，催湯顆粒還能調(diào)節(jié)CASP3，NOS，TNF和ICAM1等炎癥相關(guān)因子，能綜合起到改善新冠肺炎的炎癥風(fēng)暴作用.

從KEGG分析結(jié)果可以看到，催湯顆?？共《镜耐緩綇V泛. 分子對接結(jié)果顯示，有6個化合物與SARS-CoV-2冠狀病毒3CL 水解酶有較好的結(jié)合活性，有25個化合物與ACE2有較好的結(jié)合活性，可以推測螃蟹甲、懸鉤子、土木香、余甘子可能在催湯顆粒發(fā)揮潛在抗新冠肺炎作用中具有較大的貢獻(xiàn).