李文建，王 澎，王觀龍，謝朝暉，朱 濤，王蓮哲

(河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南 平頂山 467036)

花青素(anthocyan)又稱花色素或花色苷，是一類水溶性的類黃酮類化合物。作為天然色素，其廣泛存在于植物營(yíng)養(yǎng)器官和繁殖器官中，使組織器官呈現(xiàn)出紅、藍(lán)、紫等顏色，同時(shí)也有利于提高植株繁殖后代和抵御不良環(huán)境等方面的能力[1]。植物類黃酮物質(zhì)合成途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵酶，即查爾酮合酶(chalcone synthase，CHS)，由催化香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A反應(yīng)而生成查爾酮[2]。近年來(lái)，酵母、昆蟲、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng)相繼發(fā)展和完善，然而應(yīng)用最多、最廣泛的仍是大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)[3]。原核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白具有周期短、產(chǎn)量高、可重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[4]。

1 材料與方法

本文將建蘭花色形成關(guān)鍵基因的編碼區(qū)片段定向克隆至pET28a質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物蛋白特征，并優(yōu)化該蛋白的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

建蘭花瓣材料均源于同一植株，以此保證所有花瓣組織基因組遺傳背景的一致性，從而減輕建蘭基因組序列源頭差異給關(guān)鍵基因克隆與表達(dá)研究帶來(lái)的誤差。

1.2 培養(yǎng)基

(1)LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母抽提物5 g/L，NaCl 5 g/L，NaOH溶液調(diào)pH值為7.0；

(2)LB固體培養(yǎng)基：在(1)基礎(chǔ)上加入15 g/L瓊脂粉。

1.3 引物

用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，分析pET28a載體多克隆位點(diǎn)區(qū)域，分別加入酶切位點(diǎn)。

CeCHS1-S：5′-CGGAATTC(EcoRI)ATGGCGCCGGCGTTGGAAGC-3′

CeCHS1-A：5′-CGCTCGAG(XhoI)TCACTCCGCATTAGCAATCG-3′

根據(jù)建蘭植株18S序列設(shè)計(jì)RT-PCR驗(yàn)證引物：

18s-113-s:5′-CAACCATAAACGATGCCGACC-3′

18s-113-a:3′-CCCTCATACCAGCGTTCCGAC-5′

1.4 建蘭花瓣總RNA提取

取建蘭同一植株完全開放花，無(wú)水乙醇擦拭潔凈花瓣，解剖刀裁取花瓣兩種顏色部位組織混合。TRNzol-A+總RNA提取試劑盒提取花瓣組織總RNA，步驟參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 cDNA制備

使用天根公司Quant cDNA第一鏈合成試劑盒對(duì)建蘭花瓣組織總RNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，步驟參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。并依據(jù)建蘭18S rRNA序列引物18s-113-s/18s-113-a驗(yàn)證RT-PCR效果。

1.6 CeCHS1基因擴(kuò)增

根據(jù)建蘭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)搜索“Chalcone synthase”，經(jīng)篩選比對(duì)分析，獲得建蘭花瓣CHS基因序列(完整開放閱讀框)，命名為CeCHS1。設(shè)計(jì)引物CeCHS1-S /CeCHS1-A，以花瓣cDNA為模板，PCR擴(kuò)增開放閱讀框(ORF)。

PCR體系：10×PCR Buffer(Mg2+Free)2.5 μL、dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)2.0 μL、MgCl2(25 mmol/L)2.0 μL、引物(1.0 mmol/L)1.0 μL、模板cDNA 1 μL、Taq酶(5 U/μL)0.3 μL、dd H2O 15.2 μL，共25 μL。

PCR條件：94 ℃ 4 min；35個(gè)循環(huán)(94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min)；72 ℃ 7 min。

1.7 原核表達(dá)載體制備

將E.coliBL21菌種(攜帶質(zhì)粒pET-28a)接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基中(含50 μg/mL Amp)，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜后，離心收集菌體。使用E.Z.N.A Gel extraction Kit試劑盒依照說(shuō)明書操作提取質(zhì)粒。

1.8 感受態(tài)細(xì)胞制備

將活化菌液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，冰浴10 min，8 000 r/min離心10 min，棄上清；用3 mL 0.1 mol/L CaCl2懸浮沉淀，8 000 r/min冷凍(4 ℃)離心10 min；再用10 mL 0.1 mol/L CaCl2懸浮沉淀，冰浴30 min，8 000 r/min離心10 min；回收大腸桿菌菌體，加200 μL冰冷0.1 mol/L CaCl2懸浮細(xì)胞，50～100 μL分裝，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 表達(dá)片段與載體的酶切、連接及轉(zhuǎn)化

用EcoRI和XhoI對(duì)表達(dá)片段和載體進(jìn)行雙酶切。通過(guò)1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果。再將基因片段與載體摩爾比51配制成8 μL混合液，加入1 μL T4 Ligation Buffer和1μL T4連接酶混勻，于16 ℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，用LB/Kan平板篩選轉(zhuǎn)化子。

1.10 轉(zhuǎn)化子鑒定

挑取單個(gè)陽(yáng)性克隆菌落接于LB液體培養(yǎng)基(50 μg/mL Kan)中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜?？赏ㄟ^(guò)菌落PCR和提取質(zhì)粒后的EcoRI和XhoI雙酶切共同鑒定轉(zhuǎn)化子。

1.11 CeCHS1誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

(1)總蛋白SDS-PAGE電泳

分別取1 mL同濃度菌體的菌液，室溫下8 000 r/min離心20 min，收集菌體。加入60 mL水和15 mL 5×SDS-PAGE電泳緩沖液，混勻，煮沸10 min，12 000 r/min離心10 min后進(jìn)行12 % SDS-PAGE蛋白電泳(15 %分離膠，5 %濃縮膠)。在室溫條件下，考馬斯亮藍(lán)R250染色，脫色液脫色直至蛋白條帶清晰。用BandScan5.0掃描蛋白膠后做CeCHS1蛋白分子量和表達(dá)量分析。

(2)IPTG濃度

加IPTG至活化后的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌液中，分別獲得終濃度0.1 mM、0.2 mM、0.5 mM、1.0 mM、1.5 mM、2.0 mM的菌液，于37 ℃ 200 r/min震蕩培養(yǎng)4 h，8 000 r/min離心10 min，收集菌體。

(3)誘導(dǎo)溫度

加IPTG至活化后的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌液中使其終濃度為1.0 mM，分別在18 ℃、23 ℃、28 ℃、32 ℃和37 ℃條件下200 r/min搖菌4 h，8 000 r/min離心10 min收集菌體。

(4)誘導(dǎo)時(shí)間

加IPTG至活化后的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌液中使其終濃度為1.0 mM，37 ℃條件下200 r/min分別搖菌1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h和12 h，8 000 r/min離心10 min收集菌體。

2 結(jié)果與分析

2.1 建蘭花瓣組織總RNA提取

經(jīng)建蘭花瓣總RNA提取，取少量進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，如圖1所示。由圖1可知：總RNA的28 S rRNA與18 S rRNA之間的亮度比約為21，無(wú)明顯拖尾，說(shuō)明RNA提取質(zhì)量較好，降解少，分子完整。

圖1 建蘭花瓣組織總RNA電泳

2.2 cDNA制備

對(duì)建蘭花瓣RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并依據(jù)建蘭18S rRNA序列引物驗(yàn)證RT-PCR效果，如圖2所示。由圖2可知：建蘭花瓣18S rRNA得到了較好的擴(kuò)增(113 bp)，說(shuō)明從建蘭花瓣總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA可用于下一步基因克隆研究。

圖2 建蘭花瓣RT-PCR cDNA適用性驗(yàn)證M:DL 2000 Marker;1～7:18S 條帶

2.3 CeCHS1基因片段ORF擴(kuò)增

用具有酶切位點(diǎn)(EcoRI 和XhoI)的引物CeCHS1-S/CeCHS1-A，以驗(yàn)證的cDNA為模板進(jìn)行CeCHS1開放閱讀框(ORF)的PCR擴(kuò)增。用1.1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，分子量約為1 200 bp(圖3)。

圖3 PCR擴(kuò)增CeCHS1產(chǎn)物凝膠電泳分析M:DL 2000 Marker;1～2:CeCHS1產(chǎn)物

2.4 轉(zhuǎn)化子鑒定

目的片段與載體經(jīng)酶切、連接及轉(zhuǎn)化后，能否獲得成功的重組子(pET28a-CeCHS1)、插入片段是否正確及其編碼片段大小等方面，可通過(guò)菌落PCR和質(zhì)粒提取的雙酶切來(lái)共同驗(yàn)證與鑒定(圖4)。圖4顯示，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，兩者均得到了約1 200 bp的清晰條帶，該片段大小與預(yù)期結(jié)果一致。

圖4 pET28a-CeCHS1陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌落PCR和質(zhì)粒EcoR I/Xho I雙酶切驗(yàn)證M:DL 2000 Marker；1：陽(yáng)性克隆質(zhì)粒；2：菌落PCR驗(yàn)證；3：質(zhì)粒酶切驗(yàn)證

2.5 CeCHS1誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

2.5.1 IPTG濃度

SDS-PAGE蛋白電泳圖譜(圖5)表明，從帶3～帶8均出現(xiàn)了特異蛋白條帶，約43 KDa，與預(yù)計(jì)大小相符。在0.1～2.0 mM IPTG濃度范圍內(nèi)，隨濃度增加，相應(yīng)CeCHS1蛋白表達(dá)量依次增加，誘導(dǎo)濃度達(dá)到1.0 mM IPTG時(shí)，蛋白表達(dá)已達(dá)最大量，可見1.0 mM IPTG為蛋白誘導(dǎo)表達(dá)中的最適濃度，本研究結(jié)果與青稞[3]CHS蛋白誘導(dǎo)表達(dá)(1.0 mM IPTG)結(jié)果一致，與香雪蘭[4]CHS蛋白誘導(dǎo)表達(dá)(0.4 mM IPTG)差別較大。

圖5 不同IPTG濃度誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的SDS-PAGE電泳帶1：低分子量蛋白Marker；帶2：未誘導(dǎo)對(duì)照；帶3～8：分別是IPTG濃度為0.1 mM、0.2 mM、0.5 mM、1.0 mM、1.5 mM和2.0 mM誘導(dǎo)結(jié)果；黑色箭頭所示為目的融合蛋白

2.5.2 誘導(dǎo)溫度

在IPTG濃度為1.0 mM，并在不同溫度條件(18～37 ℃)下培養(yǎng)重組菌誘導(dǎo)表達(dá)，見圖6。圖6顯示，設(shè)置溫度范圍內(nèi)隨誘導(dǎo)溫度的提高，誘導(dǎo)的菌體總蛋白表達(dá)量也在增加。與37 ℃相比，誘導(dǎo)溫度42 ℃時(shí)蛋白表達(dá)量不再增加，因此37 ℃可作為CeCHS1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)最適宜的誘導(dǎo)溫度，這也是大腸桿菌及其重組菌培養(yǎng)最適宜的生長(zhǎng)與生產(chǎn)溫度。

圖6 不同溫度誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的SDS-PAGE電泳帶1為低分子量蛋白Marker；帶2為重組菌未誘導(dǎo)對(duì)照；帶3～7依次為溫度18 ℃、23 ℃、28 ℃、32 ℃和37 ℃的誘導(dǎo)結(jié)果；黑色箭頭所示為目的融合蛋白

2.5.3 誘導(dǎo)時(shí)間

在誘導(dǎo)溫度37 ℃及誘導(dǎo)濃度1.0 mM IPTG條件下，研究不同誘導(dǎo)時(shí)間(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、12 h)對(duì)重組菌總蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)果見圖7。圖7顯示，隨時(shí)間延長(zhǎng)，菌體總蛋白表達(dá)量隨之增加，誘導(dǎo)6 h時(shí)蛋白表達(dá)量已達(dá)到最大量。故誘導(dǎo)時(shí)間6 h即是CeCHS1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最佳培養(yǎng)時(shí)間，與青稞[3]CHS蛋白誘導(dǎo)(3 h)、香雪蘭[4]CHS蛋白誘導(dǎo)(4.5 h)相比，其各自誘導(dǎo)時(shí)間稍長(zhǎng)。

圖7 不同時(shí)間誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的SDS-PAGE電泳帶1為低分子量蛋白Marker；帶2～8依次是誘導(dǎo)時(shí)間1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、12 h的誘導(dǎo)結(jié)果；黑色箭頭所示為目的蛋白

根據(jù)以上誘導(dǎo)條件優(yōu)化結(jié)果得出，在37 ℃條件下、IPTG誘導(dǎo)濃度為1 mM及誘導(dǎo)時(shí)間6 h是pET28-CeCHS1在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)的最佳條件。

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和基因工程的快速發(fā)展和應(yīng)用，觀賞植物育種學(xué)者較為關(guān)注的課題逐漸集中在利用基因工程改良和培育新花色等研究方面，花色改良已成為花卉基因工程育種研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)[5-8]。關(guān)于基因工程育種途徑進(jìn)行改良花色的研究報(bào)道日益增多，如矮牽牛[9-11]、苦蕎[6,12]、瓜葉菊[13]、石斛蘭[14]、卡特蘭[15]、鳶尾[16]等花卉植物花色形成關(guān)鍵基因克隆與表達(dá)分析等方面，均獲得了較好的結(jié)果和成效。

針對(duì)蘭科類花卉，其花色相關(guān)研究主要包括：花色素類組成分析、功能基因克隆和分析及轉(zhuǎn)基因技術(shù)改變花色等方面，開展蘭花尤其是獨(dú)具特色國(guó)蘭類的花色育種相關(guān)研究具有重要的實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景[5,14，15,17]。