基于高通量測(cè)序技術(shù)分析預(yù)包裝豆干生產(chǎn)過程中的真菌污染風(fēng)險(xiǎn)

趙麗君，田 雪，鐘 威，賈利蓉, ，段飛霞,

(1.四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院食品工程系, 四川成都 610065；2.四川徽記食品股份有限公司, 四川成都 610083)

大豆在我國(guó)有五千多年的栽種歷史，我國(guó)也是大豆加工制品的發(fā)源地。豆干作為我國(guó)典型的傳統(tǒng)豆制品，營(yíng)養(yǎng)豐富，在我國(guó)餐桌和休閑食品市場(chǎng)占有重要份額[1]，并持續(xù)增長(zhǎng)。2019年休閑豆干制品市場(chǎng)份額已達(dá)190億元以上，整個(gè)豆制品行業(yè)2019年銷售額和效益普遍增長(zhǎng)，增幅高達(dá)15%[2]。隨著市場(chǎng)需求增加，生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大，豆干生產(chǎn)從最初的作坊式加工逐步轉(zhuǎn)向工業(yè)化、自動(dòng)化(或半自動(dòng)化)生產(chǎn)，為產(chǎn)品質(zhì)量控制和食品安全保障提供了生產(chǎn)條件支撐[3]。

豆干制品加工工序復(fù)雜，從原料到成品需要經(jīng)過浸泡、研磨、凝固、鹵制、烘烤、包裝等數(shù)十道工藝，給加工過程帶來了極大的微生物污染風(fēng)險(xiǎn)[4-7]。豆干產(chǎn)品中致腐菌包括細(xì)菌和真菌(酵母菌和霉菌)[8]，現(xiàn)有研究主要針對(duì)豆制品產(chǎn)品中的腐敗細(xì)菌[9]，對(duì)產(chǎn)品及加工過程中真菌污染風(fēng)險(xiǎn)研究較少。此外，大豆及其制品是真菌繁殖的優(yōu)良培養(yǎng)基，為真菌增殖提供了有利條件[10]。豆制品原料、食品接觸的設(shè)備表面及加工人員等均可能成為引入真菌污染的源頭[11]。真菌污染不僅導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗，生產(chǎn)過程中真菌毒素的產(chǎn)生和殘留也為豆制品的食品安全埋下隱患[12]。因此，明確豆干加工過程中的主要污染真菌，并與豆干終端滅菌工藝、產(chǎn)品貨架期建立聯(lián)系，對(duì)豆干制品食品安全保障及品質(zhì)控制具有重要價(jià)值。

二代高通量測(cè)序技術(shù)采用邊合成邊測(cè)序的方法，能同時(shí)測(cè)定上百萬條DNA分子序列，精度高達(dá)99.99%，彌補(bǔ)了一代測(cè)序技術(shù)成本高，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)，也彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)鑒定手段的通量小、信息少、操作復(fù)雜的缺點(diǎn)，具有高準(zhǔn)確性、高通量、高靈敏度和低運(yùn)行成本等突出優(yōu)勢(shì)[13-14]，為全面、快速、準(zhǔn)確的了解豆干生產(chǎn)工藝中的過程真菌污染組成情況及多樣性奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

本研究結(jié)合傳統(tǒng)微生物學(xué)方法和二代高通量測(cè)序技術(shù)，以工業(yè)化豆干的生產(chǎn)流程為采樣順序，研究生產(chǎn)過程中的真菌污染情況，擬明確加工過程中的真菌高風(fēng)險(xiǎn)環(huán)節(jié)，揭示主要污染真菌群落組成及其在加工過程中的多樣性變化，找出關(guān)鍵真菌污染點(diǎn)，為企業(yè)降低真菌污染風(fēng)險(xiǎn)，保證產(chǎn)品安全及品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

半成品：豆?jié){、鹵制前豆干、烘烤后豆干、預(yù)包裝豆干，成品：殺菌后豆干，食品接觸表面樣本：包布，在豆?jié){輸送管壁、豆?jié){桶內(nèi)壁、堿處理缸壁、烘烤內(nèi)壁、烘烤輸送帶、預(yù)包裝內(nèi)壁上取樣的棉簽 四川徽記食品股份有限公司的豆干生產(chǎn)線上；平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；E.Z.N.A.?Soil DNA Kitomega試劑盒 美國(guó)Omega公司；瓊脂糖 西班牙biowest公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 美國(guó)Axygen公司；建庫(kù)試劑盒NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit 美國(guó)Bioo Scientific公司；測(cè)序試劑盒MiSeq Reagent Kit 美國(guó)Illumina公司。

ABI GeneAmp?9700型PCR儀 美國(guó)ABI公司；電泳儀DYY-6C 中國(guó)北京市六一儀器廠；微型熒光計(jì)Quantus? 美國(guó)Promega公司；高通量測(cè)序儀 Illumina(Miseq) 美國(guó)Illumina公司；超凈工作臺(tái)SW-CJ-1D 成都宜恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；電子天平 青島明博環(huán)?？萍加邢薰?；恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

1.2 豆干的生產(chǎn)工藝

1.2.1 豆干的生產(chǎn)工藝 豆干的生產(chǎn)工藝流程圖見圖1。

圖1 豆干生產(chǎn)工藝流程圖Fig.1 Main manufacturing process of dried soybean curd

1.2.2 工藝要點(diǎn) 大豆浸泡6～12 h后，磨漿過濾，得到豆?jié){；豆?jié){煮沸、凝固、脫水、成型、切塊，形成鹵制前豆干；鹵制前豆干穿堿鹵制(pH=10)、烘烤(65～75 ℃)，得到烘烤后豆干；烘烤后豆干包裝形成預(yù)包裝豆干，再殺菌(121 ℃，15 min)，得成品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的采集 豆干生產(chǎn)廠房按照GMP和HACCP標(biāo)準(zhǔn)建造。企業(yè)車間衛(wèi)生管理按照GB 14881-2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品生產(chǎn)通用衛(wèi)生規(guī)范》實(shí)施，車間溫度控制在10 ℃以下。采樣時(shí)間：每班生產(chǎn)開始前(每班生產(chǎn)結(jié)束后全車間均經(jīng)過消毒清洗，食品接觸輔助用具采用食用小蘇打溶液巴式殺菌)。包布(商業(yè)滅菌后剪刀剪為10 cm2小塊)、鹵制前豆干、烘烤后豆干、預(yù)包裝豆干和滅菌前豆干：用無菌鑷子夾取，并立即放入50 mL無菌離心管，于-20 ℃?zhèn)溆?，均用于平板?jì)數(shù)，其中包布、鹵制前豆干、烘烤后豆干、預(yù)包裝豆干同時(shí)用于高通量測(cè)序；其余食品接觸面樣品：用沾有無菌生理鹽水的棉簽反復(fù)摩擦豆?jié){輸送管壁、豆?jié){桶內(nèi)壁、堿處理缸壁、烘烤內(nèi)壁、烘烤輸送帶、預(yù)包裝內(nèi)壁的表面，涂布每個(gè)樣品表面，涂布區(qū)域約100 cm2，涂布2～3次，備用于高通量測(cè)序。豆?jié){：用無菌移液器吸取豆?jié){，注入50 mL無菌離心管中，于-20 ℃?zhèn)溆茫糜谄桨逵?jì)數(shù)。

1.3.2 菌落總數(shù)、霉菌和酵母計(jì)數(shù) 按照GB 4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》和GB 4789.15-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》測(cè)定菌落總數(shù)、霉菌和酵母數(shù)。無菌操作稱取10 g樣品，切成碎片，放入無菌均質(zhì)器中，加入90 mL無菌生理鹽水，均質(zhì)，制成1∶10稀釋液。同樣操作制成10-3～10-6的系列稀釋液。吸取1 mL 10-3～10-6的樣品稀釋液于無菌培養(yǎng)皿中，每皿加入15～20 mL的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，混合均勻。待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，于37 ℃培養(yǎng)2 d，檢測(cè)菌落總數(shù)。同樣，吸取1 mL 10-3～10-6的樣品稀釋液于無菌培養(yǎng)皿中，每皿加入20～25 mL的孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基，混合均勻。待瓊脂凝固后，正置平板，于28 ℃培養(yǎng)5 d，檢測(cè)霉菌和酵母數(shù)量。

1.3.3 16S rDNA二代高通量測(cè)序法

1.3.3.1 測(cè)序樣品 根據(jù)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行選擇，分別選擇了半成品、成品和部分食品接觸面。半成品：鹵制前豆干、烘烤后豆干、預(yù)包裝豆干；成品：殺菌后豆干；食品接觸面：豆?jié){輸送管壁、豆?jié){桶內(nèi)壁、包布、堿處理缸壁、烘烤內(nèi)壁、烘烤輸送帶、預(yù)包裝內(nèi)壁。

1.3.3.2 DNA抽提和PCR擴(kuò)增 用E.Z.N.A.? soil DNA kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA)說明書進(jìn)行微生物群落總DNA抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量，使用NanoDrop 2000測(cè)定DNA濃度、純度；用5’端分別連接樣本特異性8堿基barcode的引物對(duì)ITS1F (5’-CTTGGT CATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS2R (5’-GCTGCG TTCTTCATCGATGC -3’)，對(duì)16S rDNA基因ITS1-ITS2可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s)，然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后4 ℃保存。

1.3.3.3 Illumina Miseq測(cè)序 使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，根據(jù)AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 說明書純化回收產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用QuantiFluor?-ST (Promega,USA)對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量，建庫(kù)并于Illumina MiSeq平臺(tái)(Illumina, San Diego, USA)上機(jī)測(cè)序。

1.3.3.4 數(shù)據(jù)處理 使用Trimmomatic軟件原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接，overlap需大于10 bp。使用UPARSE軟件，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類[15]；使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)(SSU128)，設(shè)置比對(duì)閾值為70%。

1.4 數(shù)據(jù)分析

在真菌高通量測(cè)序過程中，對(duì)10個(gè)樣本按最小樣本序列數(shù)進(jìn)行抽平，排除序列數(shù)對(duì)分析結(jié)果的影響。所有試驗(yàn)至少進(jìn)行三次。細(xì)菌群落組成圖和熱圖用R語(yǔ)言處理；數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0軟件處理；用SPSS進(jìn)行方差分析(ANOVA)；當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 確定真菌污染高風(fēng)險(xiǎn)環(huán)節(jié)

根據(jù)豆干加工工藝流程，選取了主要食品接觸表面、半成品(煮沸豆?jié){、鹵制前豆干、烘烤后豆干、預(yù)包裝豆干)、成品(殺菌后豆干)進(jìn)行菌落總數(shù)、霉菌和酵母計(jì)數(shù)。從圖2可知，除煮沸后豆?jié){和殺菌后豆干外，豆干在整個(gè)生產(chǎn)過程中，霉菌和酵母含量均處于較高水平(2×104～2×105CFU/g)，菌落總數(shù)也處于較高的水平(2×103～2×106CFU/g)。上述結(jié)果表明煮沸工藝和終端高壓殺菌工藝能顯著降低豆?jié){中微生物含量；豆干生產(chǎn)中的主要食品接觸面(包布)、加工半成品中存在明顯的真菌性污染；半成品的微生物污染主要來自于煮沸豆?jié){到預(yù)包裝豆干的加工單元。

圖2 豆干加工過程樣品菌落總數(shù)、霉菌及酵母計(jì)數(shù)Fig.2 Total number of colony, count of mold and yeast in dried bean curd

2.2 真菌Alpha多樣性指數(shù)分析

為明確豆干加工半成品中的主要真菌污染情況，對(duì)豆?jié){到預(yù)包裝豆干的各加工單元食品接觸面樣本及半成品進(jìn)行真菌多樣性分析，包括：鹵制前加工單元(豆?jié){輸送管壁—豆?jié){桶內(nèi)壁—包布—鹵制前豆干)、鹵制烘烤加工單元(堿處理缸壁—烘烤內(nèi)壁—烘烤輸送帶—烘烤后豆干)和預(yù)包裝加工單元(預(yù)包裝內(nèi)壁—預(yù)包裝豆干)。由圖3各樣本稀釋性曲線可知，在真菌高通量測(cè)序過程中，每個(gè)樣本序列數(shù)達(dá)52407，測(cè)序數(shù)目充足。Shannon、Simpson指數(shù)表示樣品的菌群多樣性，Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，菌群多樣性越高。Ace、chao1指數(shù)表示物種的豐富度，其值越高，表示菌群豐度越高。

圖3 16S rDNA高通量測(cè)序樣本的稀釋曲線Fig.3 Dilution curves of the samples in 16S rDNA highthroughput gene sequencing

由表1知，在鹵制前加工單元，豆?jié){輸送管壁具有最高的Shannon值和最低的Simpson值，分別為2.37和0.17，顯示最高的菌群多樣性；豆?jié){桶內(nèi)壁的Ace值和Chao1值最高，達(dá)78.85和78.00，顯示最高的菌群豐富度。在鹵制烘烤加工單元，烘烤內(nèi)壁具有最高的Shannon值和較低的Simpson值，分別為2.31和0.28，顯示較高的菌群多樣性；堿處理缸壁的Ace值和Chao1值最高，為87.59和87.44，顯示最高的菌群豐富度。在預(yù)包裝加工單元，預(yù)包裝內(nèi)壁的Shannon值，Ace值和Chao1值最高，分別為1.69，164.17和164.92，顯示最高的菌群豐富度和菌群多樣性。上述結(jié)果表明，預(yù)包裝豆制品在生產(chǎn)過程中存在真菌污染風(fēng)險(xiǎn)；其中，半成品接觸表面的菌群豐富度和菌群多樣性均高于半成品，提示半成品的真菌污染可能來源于其接觸表面。

表1 Alpha多樣性指數(shù)表Table 1 Alpha diversity index table

2.3 豆干半成品的真菌群落組成分析

豆干加工半成品的真菌群落組成如圖4所示?？逻_(dá)酵母屬(Kodamaea)是鹵制前豆干的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌種，占比99.48%?？逻_(dá)酵母屬(Kodamaea)、念珠菌屬(Candida)和毛孢子菌屬(Trichosporon)是烘烤后豆干的主要優(yōu)勢(shì)真菌，分別為52.64%、26.56%和7.18%?？逻_(dá)酵母屬(Kodamaea)、鏈格孢屬(Alternaria)和曲霉屬(Aspergillus)是預(yù)包裝豆干的主要優(yōu)勢(shì)真菌，占比71.45%、15.18%和3.21%。上述結(jié)果顯示，柯達(dá)酵母屬(Kodamaea)、念珠菌屬(Candida)、毛孢子菌屬(Trichosporon)、鏈格孢屬(Alternaria)和曲霉屬(Aspergillus)為加工半成品中的主要污染真菌。Ezeokoli等[16]在發(fā)酵大豆產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)了柯達(dá)酵母屬(Kodamaea)、Alternaria、曲霉屬(Aspergillus)、念珠菌屬(Candida)等真菌，與本文一致。Xu等[17]報(bào)道曲霉屬(Aspergillus)也存在于腐乳發(fā)酵過程。其中，曲霉廣泛存在于食品中，如發(fā)酵食品、米面干制品等[18-19]。鏈格孢菌主要存在于水果、烘焙食品等[20-21]。

2.4 豆干加工中食品接觸表面的真菌群落組成分析

2.4.1 鹵制前加工單元 鹵制前加工單元環(huán)境真菌群落組成如圖5所示。豆?jié){輸送管壁是豆?jié){的首個(gè)接觸表面，優(yōu)勢(shì)菌是地霉屬(Geotrichum)、毛孢子菌屬(Trichosporon)和棒孢酵母屬(Clavispora)，占比14.6%、9.28%、7.99%。豆?jié){桶內(nèi)壁的優(yōu)勢(shì)菌是毛孢子菌屬(Trichosporon)、念珠菌屬(Candida)和隱球 菌 屬(Cutaneotrichosporon)，占 比42.01%、12.26%和8.88%。包布的優(yōu)勢(shì)菌是毛孢子菌屬(Trichosporon)、曲霉屬(Aspergillus)和念珠菌屬(Candida)，占比52.83%、22.66%和7.1%。經(jīng)熱堿水清洗后的包布和與煮沸豆?jié){直接接觸的環(huán)境表面樣本中檢出毛孢子菌屬(Trichosporon)、曲霉屬(Aspergillus)和念珠菌屬(Candida)等真菌，說明其在85 ℃和弱堿水處理下仍能存活，需要采取更嚴(yán)格的清洗消毒策略，以保證輔助用具和食品接觸表面衛(wèi)生，減少對(duì)產(chǎn)品的污染。

2.4.2 鹵制烘烤加工單元 鹵制烘烤加工單元環(huán)境真菌群落組成如圖5所示。堿處理缸壁的優(yōu)勢(shì)菌是毛孢子菌屬(Trichosporon)、Apiotrichum和Cutaneotrichosporon，占比28.22%、23.15%、18.13%。烘烤內(nèi)壁的優(yōu)勢(shì)菌是念珠菌屬(Candida)、毛孢子菌屬(Trichosporon)和枝孢屬(Cladosporium)，占比31.71%、16.0%和10.56%。烘烤輸送帶的優(yōu)勢(shì)菌是囊擔(dān)菌屬(Cystobasidiales)和鐮刀霉屬(Fusarium)，占比29.56%、25.59%。鹵制烘烤加工單元為較高溫度高鹽高堿加工單元，具有不利于微生物生長(zhǎng)的環(huán)境特征[22]，豆干先后通過pH為10的堿處理缸壁和高于70 ℃的烘烤內(nèi)壁，但依然有部分真菌存活。

2.4.3 預(yù)包裝加工單元 預(yù)包裝單元加工環(huán)境真菌群落組成如圖5所示。念珠菌屬(Candida)、柯達(dá)酵母屬(Kodamaea)和毛孢子菌屬(Trichosporon)是預(yù)包裝內(nèi)壁的主要優(yōu)勢(shì)真菌，占比39.27%、31.44%和17.4%。

圖4 半成品真菌群落組成圖Fig.4 Fungi composition in genus level of semi-finished product

圖5 豆干加工過程食品接觸表面樣本和半成品群落組成圖Fig.5 Fungi composition in genus level of the food contact surface samples and semi-finished product

2.5 豆干加工過程中真菌污染溯源分析

真菌群落熱圖和各樣本的優(yōu)勢(shì)屬含量如圖6和表2，基于此，對(duì)半成品中的主要污染真菌進(jìn)行溯源分析。柯達(dá)酵母屬(Kodamaea)、念珠菌屬(Candida)、毛孢子菌屬(Trichosporon)、鏈格孢屬(Alternaria)和曲霉屬(Aspergillus)為半成品的主要污染真菌(圖4)。各真菌污染溯源分析如下：

柯達(dá)酵母屬(Kodamaea)在三個(gè)半成品中均大量存在。由表2可知，柯達(dá)酵母屬(Kodamaea)主要在豆?jié){桶內(nèi)壁(0.46%)、包布(1.00%)、烘烤內(nèi)壁(2.46%)和預(yù)包裝內(nèi)壁(31.44%)中檢出，其常見于海水、土壤中，推測(cè)其主要污染點(diǎn)為點(diǎn)鹵前和預(yù)包裝過程。

念珠菌屬(Candida)是鹵制烘烤加工單元新增加的優(yōu)勢(shì)污染菌，主要在烘烤內(nèi)壁(31.71%)和預(yù)包裝內(nèi)壁(39.27%)等食品接觸表面檢出，主要污染點(diǎn)為鹵制烘烤環(huán)節(jié)和預(yù)包裝環(huán)節(jié)。

毛孢子菌屬(Trichosporon)主要存在于烘烤后豆干，此前的主要食品接觸表面是豆?jié){桶內(nèi)壁(42.01%)、包布(52.83%)、堿處理缸壁(28.22%)和烘烤內(nèi)壁(16.00%)，可能由鹵制前車間和鹵制烘烤車間的環(huán)境介質(zhì)和加工人員引入。

鏈格孢屬(Alternaria)廣泛分布于自然界，是食品、工業(yè)材料上常見的腐生菌，其在烘烤后豆干中含量較低，主要存在于預(yù)包裝豆干，主要食品接觸表面是預(yù)包裝內(nèi)壁(0.49%)，主要由預(yù)包裝內(nèi)壁引入。

曲霉屬(Aspergillus)在烘烤后豆干中含量極低(0.02%)，為預(yù)包裝加工單元新增加的優(yōu)勢(shì)污染菌，主要在預(yù)包裝內(nèi)壁(0.29%)檢出。曲霉屬?gòu)V泛分布于谷物、空氣中。可能是通過預(yù)包裝車間的環(huán)境介質(zhì)引入，附著于預(yù)包裝內(nèi)壁，進(jìn)一步污染預(yù)包裝豆干。

上述結(jié)果顯示，半成品中的真菌污染主要由各加工單元環(huán)境介質(zhì)通過食品接觸表面引入：鹵制前加工單元引入柯達(dá)酵母屬(Kodamaea)和毛孢子菌屬(Trichosporon)，其高風(fēng)險(xiǎn)接觸表面為豆?jié){桶內(nèi)壁和包布。鹵制烘烤加工單元引入念珠菌屬(Candida)和毛孢子菌屬(Trichosporon)，其高風(fēng)險(xiǎn)接觸表面為堿處理缸壁和烘烤內(nèi)壁。預(yù)包裝加工單元引入了鏈格孢屬(Alternaria)和曲霉屬(Aspergillus)，其高風(fēng)險(xiǎn)接觸表面為預(yù)包裝內(nèi)壁。鹵制前加工單元高風(fēng)險(xiǎn)接觸面位于凝固段，該工序與鹵制烘烤段均處于高溫環(huán)境，作業(yè)溫度在70 ℃以上，沸點(diǎn)以下，堿處理缸壁還間歇性浸泡在pH10的堿性環(huán)境中，在上述食品接觸表面檢出真菌，提示食品組成成分可能對(duì)真菌的環(huán)境耐受力存在影響，尚待進(jìn)一步研究。

圖6 豆干加工半成品及其接觸表面樣本真菌熱圖Fig.6 Fungi heatmap in genus level of the semi-finished product and the food contact surface samples

表2 高通量測(cè)序分析檢測(cè)到每個(gè)樣本的優(yōu)勢(shì)屬Table 2 The dominant genera in each sample detected by High-throughput sequencing analysis

2.6 真菌污染對(duì)豆干產(chǎn)品安全性及貨架期影響分析

高壓滅菌后的豆干經(jīng)過37 ℃培養(yǎng)14 d后，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)和真菌多樣性檢測(cè)。結(jié)果顯示，菌落總數(shù)、霉菌和酵母計(jì)數(shù)低于10 CFU/g，樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(引物ITS1F-ITS2R)的條帶亮度極弱，說明真菌核酸提取初始濃度極低。在暫儲(chǔ)和車間控溫條件下(10 ℃)，殺菌前產(chǎn)品霉菌和酵母總數(shù)可控制在105CFU/g以下(圖2)，在該初始菌落數(shù)條件下，高溫高壓滅菌可殺滅絕大多數(shù)真菌，消除真菌污染可能導(dǎo)致的產(chǎn)品腐敗風(fēng)險(xiǎn)，表明在本文所述加工及殺菌條件下，真菌性污染不是導(dǎo)致豆干貨架期腐敗的主要原因。

柯達(dá)酵母屬(Kodamaea)、念珠菌屬(Candida)、毛孢子菌屬(Trichosporon)、鏈格孢屬(Alternaria)和曲霉屬(Aspergillus)是加工過程中主要優(yōu)勢(shì)菌屬，其部分菌種可分產(chǎn)生真菌毒素。念珠菌屬中的白念珠菌可分泌細(xì)胞外酸性蛋白酶、磷脂酶等，增強(qiáng)粘附，從而造成皮膚病變和系統(tǒng)性感染[23]；鏈格孢屬會(huì)產(chǎn)生騰毒素、鏈格孢菌酚、交鏈孢酚單甲醚等毒素，具有遺傳毒性和致突變性[24]；曲霉屬中的黃曲霉、赭曲霉、雜色曲霉、部分黑曲霉等在可產(chǎn)生黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、雜色曲霉素等真菌毒素[25]。真菌毒素的產(chǎn)生與環(huán)境條件密切相關(guān)，成品中真菌毒素殘留風(fēng)險(xiǎn)仍待進(jìn)一步研究。通常在25～33 ℃、相對(duì)濕度85%～95%時(shí)，真菌生長(zhǎng)繁殖較快且易形成真菌毒素；豆干加工過程中，蒸煮單元顯著提高車間溫濕度，在非控溫條件下，可能存在更大的真菌污染風(fēng)險(xiǎn)和毒素積累風(fēng)險(xiǎn)。因此，改善管路、加工輔助材料的清洗消毒程序，并控制加工過程溫濕度，有利于降低豆干加工過程的真菌毒素污染風(fēng)險(xiǎn)。

3 結(jié)論

結(jié)合傳統(tǒng)微生物學(xué)方法和二代高通量測(cè)序技術(shù)，研究了工業(yè)化預(yù)包裝豆干生產(chǎn)過程及半成品的真菌性污染風(fēng)險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，按照GB 14881-2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品生產(chǎn)通用衛(wèi)生規(guī)范》嚴(yán)格執(zhí)行車間衛(wèi)生管理，且實(shí)行車間控溫條件下，豆干生產(chǎn)線仍存在真菌污染風(fēng)險(xiǎn)。豆?jié){桶內(nèi)壁、包布、堿處理缸壁、烘烤內(nèi)壁和預(yù)包裝內(nèi)壁為高風(fēng)險(xiǎn)接觸表面；柯達(dá)酵母屬(Kodamaea)、念珠菌屬(Candida)、毛孢子菌屬(Trichosporon)、鏈格孢屬(Alternaria)和曲霉屬(Aspergillus)為主要污染真菌。盡管真菌污染不是導(dǎo)致高壓滅菌后成品豆干貨架期腐敗的主要原因，仍應(yīng)控制加工過程溫濕度，并在保證無毒、低殘留的基礎(chǔ)上，采取更嚴(yán)格的管路、加工輔助材料清洗消毒程序，以便降低豆干工業(yè)化生產(chǎn)過程中的真菌及真菌毒素污染風(fēng)險(xiǎn)，提高食品安全。