外源酶在茶葉深加工中的應(yīng)用進(jìn)展

薄佳慧，張楊玲，宮連瑾，杜哲儒，楊玉珠，宋加艷，何加興，蔣平利，繆有成，肖力爭,

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，湖南長沙 410128；2.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙 410128；3.茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410128)

外源酶最早于茶葉中的應(yīng)用主要集中在茶葉深加工領(lǐng)域[1]，外源酶通常定義為源于食品加工原料及研究對象以外的酶類[2]，例如從茶鮮葉、幼果及其他植物或其愈傷組織中提取得到，或從所培養(yǎng)微生物中獲得的酶類[3-4]。生物體產(chǎn)生的大量酶可作為天然催化劑[5]，能作用于多種物質(zhì)成分的合成、轉(zhuǎn)化及降解反應(yīng)。目前，外源酶的應(yīng)用已然成為茶葉深加工領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，茶葉內(nèi)有效組分與功能成分的分離純化是茶葉天然成分高效利用的基礎(chǔ)，然而這些產(chǎn)物中的活性成分通常含量較低且成分復(fù)雜，利用外源酶有助于高效、高純度地將這些天然物質(zhì)分離、提純、合成，同時在茶飲料的保香、增香、澄清等方面也發(fā)揮著重要作用[6-7]。

綠茶、白茶和紅茶等在制藥和食品工業(yè)中被認(rèn)為是富含抗氧化劑、酪氨酸酶抑制劑和細(xì)胞毒活性的重要茶類[8]，含豐富的兒茶素類、茶黃素類(TFs)、黃酮類物質(zhì)等，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域擁有巨大的應(yīng)用潛力。隨著酶技術(shù)應(yīng)用的不斷創(chuàng)新與快速發(fā)展[9]，天然成分提取的新需求得到逐步滿足，茶資源利用率穩(wěn)步提升。但是，從其它植物或微生物中提取分離而得到外源酶的技術(shù)成本較高，活力難以保持穩(wěn)定，因而茶葉深加工與固化外源酶技術(shù)相結(jié)合的應(yīng)用將是今后的研究重點(diǎn)之一。本文綜述了近幾年來外源酶在茶葉深加工領(lǐng)域中的研究及其應(yīng)用，以期為茶葉天然成分的酶法應(yīng)用提供一定的借鑒，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)高效快速、節(jié)能環(huán)保地利用天然成分及提升茶飲料品質(zhì)的目的。

1 應(yīng)用于茶葉深加工中的外源酶

外源酶在茶葉深加工領(lǐng)域的應(yīng)用主要著重于提高茶葉天然成分提取的有效得率、純化率，降低成本及綠色環(huán)保等方面。外源酶技術(shù)的核心是酶的應(yīng)用，酶是一種生物大分子蛋白，其生物活性、特異性和選擇性使其在生物催化和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[10]。茶葉中大部分天然化學(xué)成分都包含于細(xì)胞壁內(nèi)，細(xì)胞壁的存在是阻礙茶葉天然成分高得率的主要因素之一，利用酶技術(shù)來破壞茶葉細(xì)胞壁將有助于提升茶葉天然成分的利用率。常見的細(xì)胞壁消化酶主要包括纖維素酶、果膠酶和葡聚糖酶等酶類，此外，單寧酶、蛋白酶及多酚氧化酶也是茶葉深加工中使用最廣泛的外源酶類。

1.1 主要外源酶的作用及原理

1.1.1 單寧酶 單寧酶(單寧?；饷?，主要來源于黑曲霉，是一種重要的水解酶，可催化水解單寧或沒食子酸酯中的酯鍵，釋放葡萄糖、表兒茶素(EC)和沒食子酸(GA)，其中，GA作為抗凋亡劑，有助于保護(hù)人類細(xì)胞免受氧化損傷，通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單寧酶本身不具有明顯的副作用和細(xì)胞毒性[11-16]，因此，單寧酶廣泛應(yīng)用于食品、飲料、飼料、制藥和化學(xué)等工業(yè)加工中[13]。單寧酶在茶葉加工領(lǐng)域多應(yīng)用于速溶茶的制備，是解決茶湯“冷后渾”現(xiàn)象的轉(zhuǎn)溶專用酶，對深加工茶產(chǎn)品中有效成分的增加起到積極地促進(jìn)作用[17]。

1.1.2 纖維素酶 纖維素酶是能夠降解纖維素生成葡萄糖的一類復(fù)合酶，主要由內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶組成[18]。纖維素酶可促進(jìn)植物細(xì)胞壁的溶解，使植物細(xì)胞內(nèi)溶物溶解度顯著增加，其廣泛使用于食品行業(yè)，如果汁[19]、釀酒[20]、制茶[21]等，茶葉細(xì)胞壁經(jīng)纖維素酶破壞后，茶葉內(nèi)有效組分的得率和揮發(fā)性物質(zhì)的釋放量顯著提高。纖維素酶通常比普通酶在相對較高的溫度下更穩(wěn)定，但由于生產(chǎn)成本較高及生物活性較低的原因，纖維素酶的應(yīng)用推廣受到一定局限[22]。

1.1.3 果膠酶 果膠酶是一類能夠降解果膠分子的酶的總稱，是以游離態(tài)存在的水解酶，包括聚半乳糖醛酸酶、果膠酯酶和果膠酸裂解酶[23-24]。果膠酶可將不溶性原果膠降解為聚合的可溶性果膠；或通過多鏈機(jī)制水解底物中的特定基團(tuán)；或通過酯交換反應(yīng)進(jìn)行果膠酸鹽或果膠酸鹽的非水解去除[25]。在果汁飲料的生產(chǎn)過程中，果膠酶對其澄清度和穩(wěn)定性發(fā)揮著重要作用[23]。在茶葉深加工中，果膠酶可大幅提高速溶茶的制率并減少其泡沫的產(chǎn)生[26]。

1.1.4 蛋白酶 蛋白酶是最重要的一種工業(yè)酶制劑，是能催化蛋白質(zhì)和多肽水解的一類酶的總稱。其可將大分子量的多肽鏈從中間切斷，生成肽鍵長度較短的肽分子或游離氨基酸[27]。蛋白酶常與其他外源酶類組合成復(fù)合酶應(yīng)用于液態(tài)茶飲料的生產(chǎn)，能在保留茶葉原有有效成分的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提高茶飲料滋味的鮮爽感，并減少沉淀的產(chǎn)生[28]。

1.1.5 多酚氧化酶 多酚氧化酶(PPO)是一種含銅的氧化還原酶，根據(jù)底物的特異性和結(jié)構(gòu)分為酪氨酸酶、兒茶酚氧化酶、兒茶酚酶、鄰二酚氧化酶、單酚氧化酶和漆酶等[29]。PPO的作用機(jī)理可以總結(jié)為兩個反應(yīng)，即在氧分子存在時，PPO催化一元酚羥基化，生成二酚，然后進(jìn)行氧化反應(yīng)，從二酚中除去氫分子，生成奎寧；在催化反應(yīng)過程中，酶的活性位點(diǎn)在met-、oxy-和deoxy-之間以循環(huán)方式進(jìn)行催化[29]。PPO廣泛應(yīng)用在茶葉深加工的各個層面，對兒茶素、茶黃素、茶氨酸的制備以及速溶茶粉的生產(chǎn)均具有積極意義。表1為主要應(yīng)用于茶葉深加工中的外源酶種類。

表1 主要應(yīng)用于茶葉深加工中的外源酶種類Table 1 Types of exogenous enzymes used in tea deep processing

1.2 其他外源酶的作用及原理

過氧化氫酶(CAT)是催化過氧化氫(H2O2)分解成氧和水的酶，其作用機(jī)理實(shí)質(zhì)上是H2O2的歧化，采用CAT與PPO進(jìn)行雙酶協(xié)同液態(tài)發(fā)酵，將綠茶茶湯浸提液轉(zhuǎn)化成紅茶茶湯，可有效增加紅茶茶湯中茶紅素和茶黃素的含量，改善茶湯品質(zhì)[36]。

糖苷酶即糖苷水解酶，是能裂解兩個糖分子之間的糖苷鍵的酶，其主要作用于高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[37]。α-L-鼠李糖苷酶與β-葡萄糖苷酶雙酶結(jié)合可對速溶茶香氣起到協(xié)同增效的作用[38]，其中β-葡萄糖苷酶為單體蛋白，能夠水解β-D-糖苷鍵，釋放非還原性β-D-葡萄糖殘基和末端苷元，促使茶葉醇香香氣的形成[39]。

淀粉酶是能將淀粉和糖原水解的酶的總稱[40]，其具有良好的活性、底物專一性、熱穩(wěn)定性、較寬的pH譜以及對變性劑和重金屬的良好抵抗力等特性[41]，α-淀粉酶的內(nèi)切酶能隨機(jī)水解淀粉中由α-(1→4)糖苷鍵生成的低聚糖混合物[42]。研究表明，α-淀粉酶能有效提取茶渣中的粗膳食纖維[43]，通過與糖化酶復(fù)合作用于茶籽粕提取茶皂素，茶皂素得率可高達(dá)9.83%，明顯高于傳統(tǒng)水提取法[44]。

2 外源酶在茶葉功能成分提取及合成方面的應(yīng)用

茶葉所含的功能性成分以及其生物利用度可能在降低人類多種疾病的風(fēng)險方面發(fā)揮重要作用[9]。利用外源酶或酶制劑有針對性地改善茶葉中特定成分的組成及含量，有助于實(shí)現(xiàn)茶葉中有效組分與不溶性成分的提取利用，為茶葉功能成分的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展奠定了良好的基礎(chǔ)。目前，相較于其他功能成分，外源酶在兒茶素類及茶黃素類物質(zhì)的應(yīng)用研究最為深入。

2.1 外源酶在兒茶素類物質(zhì)合成中的應(yīng)用

兒茶素是主要的茶葉多酚類物質(zhì)，其分子和氫鍵數(shù)值很大，兒茶素的生物利用度還較低[45]，催化合成技術(shù)有待進(jìn)一步發(fā)展。兒茶素的酶法應(yīng)用主要是通過外源酶對兒茶素分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，促進(jìn)EGCG和表兒茶素沒食子酸酯(ECG)向表沒食子兒茶素(EGC)和EC的轉(zhuǎn)化，F(xiàn)ang等[46]從普洱茶中分離出的黑曲霉RAF106，能夠在只含有兒茶素的綠茶水溶液中將酯型兒茶素有效降解為生物利用度較高的非酯型兒茶素和GA，并且通過該實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)，添加不同的氮源、乳糖以刺激菌絲生長和單寧酶活性可以顯著加速其生物轉(zhuǎn)化(氮源是微生物生長和產(chǎn)酶的重要組成部分)。據(jù)報道，采用固態(tài)發(fā)酵法，從以茶副產(chǎn)物為原料獲得的黑曲霉中提取單寧酶處理茶湯，發(fā)生了以EGCG水解為主導(dǎo)反應(yīng)的兒茶素轉(zhuǎn)化過程，茶湯的透明度、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)和DPPH抑制活性以及清除羥自由基的能力顯著提高[47-49]，此法具有兒茶素工業(yè)化提取的潛力。此外，單寧酶處理后的綠茶提取物與黃酮醇聯(lián)用可提高表兒茶素(EC)的生物利用度和生物活性[50]。

兒茶素的酶法應(yīng)用為兒茶素的工業(yè)產(chǎn)業(yè)化制備提供了極大的便捷與技術(shù)支持，研究表明，在七種不同的外源酶中來自于曲霉菌的戊聚糖復(fù)合酶是提取兒茶素最有效的外源酶[51]。Itoh等[52]利用漆酶處理有GA存在的綠茶提取物，發(fā)現(xiàn)其與非漆酶處理的綠茶提取物中兒茶素的組成有很大差異，表現(xiàn)為漆酶處理下的綠茶提取物中EGC和EGCG以較低的濃度存在。植物酶具有多功能活性及特異性，能有效裂解多種糖苷鍵，如3-O-葡萄糖苷、3-O-半乳糖苷和3-O-葡萄糖基蕓香苷等，其對于沒食子兒茶素(GC)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的活性，會導(dǎo)致GA和去沒食子兒茶素的產(chǎn)生[53]。

2.2 外源酶在茶黃素合成中的應(yīng)用

茶黃素(TFs)的主要成分包括茶黃素(Theaflavin，TF)、茶黃素-3-沒食子酸酯(Theaflavin-3-gallate，TF-3-G)、茶黃素-3′-沒食子酸酯(Theaflavin-3′-gallate，TF-3′-G)和茶黃素-3,3′雙沒食子酸酯(Theaflavin-3，3′-digallate，TFDG)，其理化性質(zhì)表現(xiàn)為活潑、易氧化、穩(wěn)定性差等[54]，具有降血壓、保護(hù)骨骼健康、抵抗糖尿病等功效[55-57]。茶黃素混合物中的兒茶素、咖啡堿和未知污染物增加了有效分離和純化茶黃素及其單體的難度和成本[58]，因此，關(guān)于茶黃素單體的分離純化及合成仍是當(dāng)前茶黃素的制備瓶頸。多酚氧化酶在茶黃素的分離純化及合成中起關(guān)鍵作用，酚類化合物的氧化機(jī)制可能涉及對酚類物質(zhì)底物現(xiàn)有羥基附近的鄰位進(jìn)行羥基化(單酚氧化酶活性)，并將鄰位的二羥基苯氧化為苯醌[59]。

2.2.1 外源多酚氧化酶的應(yīng)用 薛金金等[60]在對催化兒茶素氧化形成TFs的最佳酶源進(jìn)行篩選時，發(fā)現(xiàn)豐水梨PPO在茶黃素合成總量及單體TF-3′-G和TFDG合成量上明顯優(yōu)于其它外源酶。將梨PPO固定化處理，TFDG的合成率高達(dá)42.23%，且該酶在連續(xù)使用8個周期后，仍保持其初始能力的85%，儲存期可達(dá)30 d[61]。PPO轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)乙酸乙酯分餾后，可制得純度為62.5%的茶黃素[62]。Zeng等[63]首次通過PPO重組技術(shù)酶促產(chǎn)生茶黃素，成功從9個物種中克隆了PPO基因并進(jìn)行了表達(dá)，其中以茶多酚為底物的8個重組PPO具有較強(qiáng)的茶黃素生產(chǎn)活性及較低的生產(chǎn)成本，為茶黃素產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)一步發(fā)展提供了新思路。

2.2.2 外源酪氨酸酶的應(yīng)用 酪氨酸酶是一種含銅加氧酶[64]，其本身不能氧化茶黃素，主要用于茶黃素衍生物的合成[65]。Chattopadhyay團(tuán)隊(duì)[66-67]利用土豆和香蕉提取出酪氨酸酶并將其應(yīng)用在電化學(xué)阻抗譜上，成功建立了一個阻抗成本低、易攜帶的測試茶多酚含量的示范模型。酶促茶黃素合成率的差異是由EGC和EGCG的氧化程度決定的，利用酪氨酸酶催化TFs的合成反應(yīng)在1-辛醇/緩沖雙相體系緩沖液中進(jìn)行時，自二聚作用在辛醇相被抑制，允許氧化的EGCG參與了同EC醌的結(jié)合，從而導(dǎo)致茶黃素單體TF-3-G的有效生產(chǎn)[68]。蘑菇源酪氨酸酶能更有效地制備質(zhì)量高且穩(wěn)定的茶黃素單體，其在40 ℃條件下孵育30 min后TFDG最高產(chǎn)率為86.7%，當(dāng)EC及EGC與酪氨酸酶共同孵育時，TF能夠在1 h內(nèi)保持穩(wěn)定[65,69]。利用酪氨酸酶聯(lián)合過氧化氫酶由兒茶素合成茶黃素是一種新方法，H2O2會誘導(dǎo)酪氨酸酶失活，因此可將CAT加入到酪氨酸酶催化ECG和EGC合成茶黃素的反應(yīng)中以消除H2O2，最終得到的TF-3′-G，與沒有CAT的反應(yīng)相比，其產(chǎn)物增加了3.1倍，四種茶黃素的生成速率和得率均大幅提升[70-71]。

2.2.3 外源漆酶的應(yīng)用 據(jù)報道，利用普洱茶固態(tài)發(fā)酵法分離得到的杜賓曲霉粗酶原液含有過氧化物酶、兒茶酚氧化酶和漆酶活性[72]，漆酶主要可形成不溶性絡(luò)合物，以EGCG為原料，GA經(jīng)漆酶氧化可合成沒食子酸酯[73]。真菌漆酶可將EGCG氧化成游離兒茶素、酯類兒茶素、GA和茶色素，該研究為漆酶氧化EGCG的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，為茶色素的高產(chǎn)利用提供了新的技術(shù)支持[74]。

2.2.4 其他酶法應(yīng)用 研究表明，將單寧酶介導(dǎo)的生物轉(zhuǎn)化與高速逆流色譜儀相結(jié)合，是一種新型高效分離茶黃素的方法[58]，但這一方法存在僅將茶黃素和EGC分離的局限性。為了實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)茶黃素，研究人員開發(fā)了一種新型、簡單、廉價的制備方法，通過控制茶鮮葉中的PPO和POD活性實(shí)現(xiàn)可選擇性、高效地獲得茶黃素——一鍋多米諾型酶的選擇性生物轉(zhuǎn)化法合成茶黃素(冷凍保存的每480 g綠茶產(chǎn)生1.7 g茶黃素)[75]。

2.3 外源酶在茶氨酸提取中的應(yīng)用

茶氨酸是茶樹特有的化合物之一，具有鮮味和甜味[76]，無論在食品還是醫(yī)藥領(lǐng)域均具有較大的應(yīng)用潛力，但如何高效地從茶葉中提取茶氨酸這一問題還有待研究人員進(jìn)一步探索。目前茶氨酸的外源酶法制備主要集中于不同來源的谷氨酰供體和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的研究[4]，研究人員分別選用甘油、無機(jī)鹽作為培養(yǎng)基和0.1%w/v乳糖作為誘導(dǎo)劑，開發(fā)了一種利用重組大腸桿菌源c-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶合成茶氨酸的酶法輔助提取方法[77]。為連續(xù)合成茶氨酸，研發(fā)了一種由谷氨酰胺酶和孔徑為23.6 nm的介孔二氧化硅組成的流動型微反應(yīng)器[78]。

不同的復(fù)合酶配比對茶氨酸的提取率有著較大的影響，岳鹍等[79]采用纖維素酶、果膠酶和漆酶組成的復(fù)合酶提取綠茶中的茶氨酸，通過最優(yōu)工藝設(shè)計實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)茶湯濃度為100 g/L，三者的酶添加量分別為0.657%、0.543%、0.600%時，茶氨酸的提取率可達(dá)到極大值0.421%，但總體看來得率依舊較低。Sakhaei[80]首次利用真菌康寧木霉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺酶，以L-谷氨酰胺和乙胺為底物提取酶液生產(chǎn)茶氨酸，所得茶氨酸濃度最高可達(dá)43 mmol/L。最新研究發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶和纖維素酶組成復(fù)合酶作用于武夷巖茶下腳料水提液，游離氨基酸溶出率可高達(dá)26.97%[81]。近年來，雖然酶法合成茶氨酸的研究逐漸深入，但仍未能找到適合產(chǎn)業(yè)化制備的最佳酶條件與制備工藝。

2.4 外源酶在茶多糖提取中的應(yīng)用

茶多糖(TPS)是一類與蛋白質(zhì)結(jié)合的雜多糖，可從茶樹的葉、花及種籽中提取而得，其被公認(rèn)為是一種安全無毒的食品添加劑[82]，有研究證明，TPS具有多種生物活性，如抗氧化、抗腫瘤、抗癌、抗高血糖和抗炎功效[83-84]。傳統(tǒng)提取方法即熱水提取茶多糖的產(chǎn)量相對較低，且生物利用度成效不顯著[32]。

酶處理會誘導(dǎo)生物活性成分發(fā)生生物轉(zhuǎn)化，用單寧酶和果膠酶同時處理可有效制備具有較高生物活性的TPS，改善TPS得率(5.39%)，增強(qiáng)綠茶提取物清除羥自由基活性的能力[32,85]。同樣，有研究單獨(dú)利用果膠酶，并采用超聲波輔助酶法連續(xù)提取茶葉中的茶多糖，茶多糖的得率高達(dá)20.12%[2]，酶法提取成效極顯著。何曉梅等[86]以皖西粗老低檔綠茶為原料，研究得出木瓜蛋白酶輔助浸提茶多糖的條件較為溫和，適合茶多糖脫蛋白，其得率可達(dá)到5.414%。目前，針對烏龍茶提取茶多糖的研究較多，用外源蝸牛酶輔助提取白芽奇蘭茶中的茶多糖，總提取率較之前提高了77.74%[87]。外源果膠酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶組成的復(fù)合酶提取漳平水仙餅茶多糖，外源酶影響力按強(qiáng)弱排序依次為：木瓜蛋白>果膠酶>纖維素酶，最佳工藝參數(shù)下得率為4.26%[88]。此外，應(yīng)用外源纖維素酶可從茶花[89]及茶葉廢料[90]中有效提取TPS，得率分別為15.28%與11.85%。

2.5 外源酶在茶皂素提取中的應(yīng)用

茶皂素又名茶皂甙，是提取自茶樹種子中的一類糖苷化合物，酶解法提純茶皂甙，是指與茶皂素相互作用的多糖分子和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，經(jīng)專一的酶水解成單糖小分子后去除，最終得到單一、高純度茶皂素的方法[91]。不同復(fù)合酶水解提純茶皂素的工藝參數(shù)不同，利用α-淀粉酶和糖化酶復(fù)合提取茶籽粕中茶皂素比傳統(tǒng)水提取法要高，其得率為9.83%[44]，通過結(jié)合纖維素酶和蛋白酶對茶皂素進(jìn)行水解純化，可使茶皂素的純度顯著提升，由原先的67.5%提高至98.3%[92]；在有脂肪酶的參與下，茶皂素的較優(yōu)提取工藝條件為溫度50 ℃，時間1 h，添加外源脂肪酶量、纖維素酶量、蛋白酶量(胰蛋白酶和木瓜蛋白酶為1∶1)分別為0.31%、0.32%和0.36%時，茶皂素得率高達(dá)86.86%±0.92%，純度87.04%[93]。茶皂素作為天然表面活性劑性能極佳，現(xiàn)階段對于水解酶法制備茶皂素的研究還知之甚淺，隨著對茶皂素性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性的深入了解，未來仍有很大的空間對其進(jìn)行研究。

3 外源酶在茶飲料加工方面的應(yīng)用

3.1 外源酶在速溶茶中的應(yīng)用

由于速溶茶加工過程的復(fù)雜性，常出現(xiàn)速溶茶產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)遠(yuǎn)不如原葉茶的情況，外源酶是速溶茶生產(chǎn)過程中最主要的外源添加物，能明顯改善速溶茶的感官品質(zhì)，且利用酶法粉碎方法可以克服冷凍粉碎及化學(xué)溶解常規(guī)粉碎等方法的一些缺點(diǎn)，如沉淀產(chǎn)生。

研究表明，β-葡萄糖苷酶可顯著改變速溶綠茶、速溶烏龍茶水溶液的香氣，并與α-L-鼠李糖苷酶具有協(xié)同增效作用[38]。Zhu等[94]以茶梗和馬鈴薯為原料，經(jīng)發(fā)酵制得茶梗粗酶后處理速溶綠茶，增加了茶粉中的2-乙基呋喃、2-甲基丁酸乙酯和癸醛的含量，降低了反式檸檬烯氧化物、2-庚酮辛醛、水楊酸甲酯的含量，從而導(dǎo)使得感官審評時花香顯著增加，青草氣、木質(zhì)和甜味明顯減少。利用在茶葉廢料、麥麩和桔皮培養(yǎng)基上發(fā)酵制備所得酶提取物制備速溶烏龍茶，茶中2-戊基呋喃和3-順-己烯-1-醇顯著增加，這一方法已被證明是改善原味速溶烏龍茶香氣特征的有效手段[95]。

茶葉液態(tài)發(fā)酵理論與技術(shù)研究有著廣闊的前景，多酚氧化酶體外氧化綠茶提取液生產(chǎn)速溶紅茶的加工技術(shù)，能夠有效提高速溶紅茶中茶黃素的含量，并更好地改善其感官品質(zhì)[96]?，F(xiàn)階段，一種通過深層發(fā)酵生產(chǎn)高茶褐素速溶茶產(chǎn)品的新型方法受到研究人員的關(guān)注，與傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵法相比，該方法的生產(chǎn)過程具有可控性、可重復(fù)性以及高效性且在速溶茶中僅會有較少的微生物代謝物，據(jù)報道，以塔賓曲霉和黑曲霉深層發(fā)酵，能夠生產(chǎn)出高茶褐素的速溶普洱茶和速溶黑茶產(chǎn)品[97-98]。較國外而言，中國速溶茶粉生產(chǎn)技術(shù)還比較落后，制率相對較低，隨著生物技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，利用外源酶技術(shù)改良速溶茶滋味淡薄、香氣低沉等缺點(diǎn)，改善產(chǎn)品風(fēng)味與整體接受度將成為速溶茶粉生產(chǎn)加工的研究方向。

3.2 外源酶在液態(tài)茶飲料中的應(yīng)用

由于茶葉天然產(chǎn)物在制成茶飲料后有香氣不持久、易產(chǎn)生沉淀等弊端，市場不乏有偽茶飲料出現(xiàn)[99]，為了改善茶飲料的生產(chǎn)及保質(zhì)工藝，研究表明外源酶不僅是速溶茶的外源優(yōu)良添加物，同樣也是液態(tài)茶飲料生產(chǎn)過程中最主要的外源添加物之一。用復(fù)合酶(水解酶、酯酶、蛋白酶)制備綠茶濃縮液，茶葉有效利用率由30%增至46%，提高幅度達(dá)53.33%，不良風(fēng)味物質(zhì)茶多酚及咖啡堿比例下降，而兒茶素的組成、酚氨比更趨合理，使得其整體風(fēng)味品質(zhì)更加醇和、滋味更加協(xié)調(diào)[100]。綠茶濃縮液在果膠酶和纖維素酶組成的復(fù)合破壁酶以及由鮮味蛋白酶和茶提取蛋白酶組成的復(fù)合外源蛋白酶處理的基礎(chǔ)上，浸提時輔以谷氨酰胺酶、果膠酶和纖維素酶分解蛋白質(zhì)，或利用單寧酶水解酯型兒茶素，能成功地提高茶湯中的氨基酸含量并加速茶葉細(xì)胞的破壞崩解，有效減少綠茶濃縮液沉淀的產(chǎn)生，從而進(jìn)一步提高綠茶濃縮液的穩(wěn)定性，改善濃縮液的風(fēng)味品質(zhì)[101-102]。單獨(dú)使用果膠酶或纖維素酶進(jìn)行破壁處理，均能提高茶汁中茶多酚提取率。此外，單寧酶可高效水解烏龍茶湯浸提物中酯型兒茶素[103]，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)綠茶及紅茶的茶湯經(jīng)過單寧酶作用后，渾濁度明顯降低，總抗氧化能力和明亮度均顯著提高[104]。

β-葡萄糖苷酶和α-葡萄糖苷酶在茶飲料的制備中具有潛在的應(yīng)用前景[105]，廖凱[106]采用單寧酶、β-葡萄糖苷酶酶解紅茶飲料，所獲得的紅茶飲料湯色紅亮，香氣純正，風(fēng)味適中，穩(wěn)定性較好。研究發(fā)現(xiàn)，氨基官能化Fe3O4-CS納米顆粒是單寧酶固定化的有效載體，與來自黑曲霉的單寧酶共同作用可有效提高茶浸提液的透明度和色澤[107]，這也是第一份關(guān)于磁性納米粒子固定化單寧酶應(yīng)用于澄清茶葉浸提液的報告。

4 結(jié)論與展望

在茶葉深加工方面，外源酶的應(yīng)用主要包括外源酶類的選擇、分離制備、發(fā)酵系統(tǒng)的成熟穩(wěn)定、反應(yīng)器及載體的選擇等方面，同時，與固定化技術(shù)相結(jié)合在食品加工領(lǐng)域已經(jīng)成為一個必然趨勢。目前，研究人員已經(jīng)從茶鮮葉、幼果及其他植物或其愈傷組織中培養(yǎng)得到多種性質(zhì)、功能不同的外源酶，用于茶葉功能成分的合成、提取及分離。外源酶在茶葉深加工產(chǎn)品的制率和得率方面起著重要作用，其中，針對兒茶素及茶黃素方面的酶法應(yīng)用研究最為深入，同時也是當(dāng)前茶葉功能成分利用的研究熱點(diǎn)之一，對兒茶素類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化合成及茶黃素單體的分離合成起到極為顯著的推動作用，既提升了合成效率，又節(jié)約了生產(chǎn)成本。茶氨酸、茶多糖及茶皂素的酶法提取及純化技術(shù)在未來還有很大的探索空間，設(shè)計合適的反應(yīng)器及載體并與固定化技術(shù)相結(jié)合，有利于提高外源酶的活力和穩(wěn)定性，同時顯著增強(qiáng)對環(huán)境的耐受能力，從而提高茶氨酸、茶多糖及茶皂素等物質(zhì)的提純效果?，F(xiàn)階段，茶飲料生產(chǎn)過程中芳香物質(zhì)逸散、后渾濁等問題已得到初步解決，但在解決酶制劑的性價比以及得到期望定向修飾產(chǎn)物等問題方面依舊是該領(lǐng)域的一個研究空白。未來在外源酶的利用方面還應(yīng)注意規(guī)避性質(zhì)不穩(wěn)定、重復(fù)利用度差、難以儲藏等風(fēng)險，結(jié)合多種技術(shù)及研究方法以實(shí)現(xiàn)外源酶技術(shù)在茶葉天然成分方面的連續(xù)化及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。