◆作者：辛國(guó)芹

◆單位：山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東省動(dòng)物微生態(tài)制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

乳酸菌在人類生活中扮演著重要角色，是各類產(chǎn)品不可缺少的重要一環(huán)（Predigon C等,1991；趙紅霞等2003），其在工業(yè)、農(nóng)牧業(yè)、食品和醫(yī)藥等與人類生活密切相關(guān)的重要領(lǐng)域應(yīng)用價(jià)值極高（Hansen E等，2002）。乳酸菌在抑制病原菌生長(zhǎng)繁殖、維護(hù)腸道菌群平衡、改善動(dòng)物腸道健康，提高養(yǎng)殖動(dòng)物生產(chǎn)性能等方面效果突出（吳逸飛等，2015；辛國(guó)芹等，2012）。本公司生產(chǎn)的乳酸菌菌粉質(zhì)量效果優(yōu)異，在市場(chǎng)中廣受好評(píng)，但是長(zhǎng)期儲(chǔ)存存活率下降的問題一直困擾著公司及廣大用戶。

提高乳酸菌抗逆性在凍干和長(zhǎng)期儲(chǔ)藏過程中的存活率在科技和經(jīng)濟(jì)上都是十分重要的，微生物細(xì)胞的存活率受很多因素影響，影響乳酸菌活性的因素有很多，如溫度、pH、鹽濃度等（錢森和等，2018）。周華偉等（2005）研究表明乳酸菌接觸一定亞致死處理因子使得細(xì)胞增加對(duì)不良環(huán)境的抵抗力，來適應(yīng)環(huán)境變化的脅迫，許多研究事實(shí)表明微生物能通過誘導(dǎo)合成蛋白質(zhì)和其他產(chǎn)品來適應(yīng)環(huán)境的變化。方鳴玉（2012）對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌SQS7-31與SQS4-64進(jìn)行酸亞致死處理獲得具有遺傳穩(wěn)定性優(yōu)良耐酸菌株。Cristina Barrera等（2019）研究報(bào)道亞致死處理（25～150 MPa）可提高唾液乳桿菌的抗氧化及生物活性。本研究旨在通過對(duì)乳酸菌發(fā)酵過程中處以溫度、pH等最佳亞致死條件處理，提高乳酸菌發(fā)酵液細(xì)胞活菌數(shù)，以期提高乳酸菌類產(chǎn)品保藏期。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

BLCC2-0015，植物乳桿菌，山東寶來利來生物工程股份有限公司菌種保藏中心保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基，改良MRS（張剛，2007）：葡萄糖2.0%、檸檬酸三銨0.2%、乙酸鈉0.5%、酵母膏0.5%、磷酸氫二鉀0.5%、硫酸錳0.02%、硫酸鎂0.05%、蛋白胨1.0%、牛肉膏1.0%、吐溫80%～0.1%，pH6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基（同種子培養(yǎng)基）

計(jì)數(shù)培養(yǎng)基LBS（青島海博生物）：酵母浸粉5.0g、胰酪蛋白胨10.0 g、磷酸二氫鉀6.0 g、硫酸亞鐵0.034 g、硫酸鎂0.575 g、葡萄糖20.0 g、乙酸鈉25.0 g、檸檬酸銨2.0 g、硫酸錳0.12 g、瓊脂粉15.0 g。

制法：將上述成分加入1000mL蒸餾水中，再吸取吐溫801mL和冰乙酸1.3mL，加熱攪拌溶解，調(diào)pH至5.8～6.2，當(dāng)日使用，無需高壓滅菌。次日使用，需118℃高壓滅菌15min。

1.1.3 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2F型超凈工作臺(tái)：江蘇通凈凈化設(shè)備有限公司；HPX-9082 MBE型數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DHZ-CA型大容量振蕩器：太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；FA-1004型電子分析天平：上海太平儀器廠；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生長(zhǎng)曲線的確定

圖1 菌株BLCC2-0015生長(zhǎng)曲線

表1 不同溫度處理對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)影響

菌種BLCC2-0015以2%接種量接種到于MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)，于0h、2h、4h、8h、10h、12h、14h、16h～32h取樣測(cè)定pH值以及活菌數(shù)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的活菌數(shù)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線，找出最適培養(yǎng)時(shí)間。從而確定菌株生長(zhǎng)的各個(gè)階段。并取處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期的液體菌種作為種子液，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 不同溫度亞致死處理對(duì)菌體影響

1.2.2 不同溫度處理對(duì)乳酸菌發(fā)酵液活菌數(shù)影響

種子液以2%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃發(fā)酵4h而后進(jìn)行不同溫度（20℃、25℃、30℃、37℃、42℃、50℃）處理1h，培養(yǎng)24h發(fā)酵結(jié)束，取樣測(cè)定發(fā)酵液活菌數(shù)及pH。

1.2.3 不同pH處理乳酸菌發(fā)酵液活菌數(shù)影響

種子液以2%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃發(fā)酵4h，不同pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.5、9.0）條件下處理1h，然后37℃培養(yǎng)至不同時(shí)間(24、26、30h)取樣計(jì)數(shù)測(cè)定pH。

1.2.4 不同金屬離子（NaCl、MgCl2、CaCl2）處理對(duì)乳酸菌發(fā)酵液活菌數(shù)影響

種子液以2%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃發(fā)酵4h，施以2%（W/V）不同金屬離子處理，37℃繼續(xù)發(fā)酵不同時(shí)間取樣計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株BLCC2-0015生長(zhǎng)曲線的確定

表2 不同pH處理對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)影響

如圖表所示，植物乳桿菌BLCC2-0015在2～8h內(nèi)菌體生長(zhǎng)迅速，在4h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)期，隨后進(jìn)入穩(wěn)定期。在22～24h發(fā)酵液活菌數(shù)最高達(dá)到3.2×109cfu/mL，爾此時(shí)pH值降至最低3.6左右，而后趨于穩(wěn)定，而活菌數(shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)開始下降，至培養(yǎng)32h時(shí)活菌數(shù)下降一個(gè)數(shù)量級(jí)，Van de Guchte等（2002）認(rèn)為處于生長(zhǎng)后期的菌體因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的匱乏，使菌體產(chǎn)生饑餓適應(yīng)性反應(yīng)，有利于菌體抵御滲透脅迫和環(huán)境脅迫等，故選用22～24h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)酵終點(diǎn)。

2.2 不同溫度處理對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)影響

37℃發(fā)酵4h不同溫度（20℃、25℃、30℃、37℃、42℃、50℃）處理1h，培養(yǎng)24h發(fā)酵結(jié)束，結(jié)果如下：

如上可看出，不同溫度（20、25、30、37、42）處理，發(fā)酵液在對(duì)數(shù)前期50℃處理1h活菌數(shù)最低下降約1.5個(gè)數(shù)量，以20℃處理組活菌數(shù)最高，為3.7×109cfu/mL，比對(duì)照組（37℃）高4.73%，且差異顯著（P<0.5）；鏡檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌體隨著溫度升高至50℃，有變粗的趨勢(shì)。乳酸菌需要脅迫反應(yīng)，它們依靠脅迫反應(yīng)可以適應(yīng)不良環(huán)境（Spano G，2006）。植物乳桿菌BLCC2-0015發(fā)酵液在對(duì)數(shù)期低溫20℃亞致死處理1h可提高發(fā)酵液活菌數(shù)。

2.3 不同pH處理乳酸菌發(fā)酵液活菌數(shù)影響

不同pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.5、9.0）處理1h分階段(24、26、30h)取樣計(jì)數(shù)。

如表所示，不同pH處理發(fā)酵24h時(shí)pH6.0處理組最活菌數(shù)較CK組高31.67%，且差異顯著（P<0.05）；培養(yǎng)至26h時(shí)pH 6.0處理與對(duì)照組差異不顯著（P>0.05），pH5.0處理組較對(duì)照組高10.42%，且差異顯著（P<0.05）；培養(yǎng)至30h時(shí)，各處理組隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)活菌數(shù)下降明顯。如上可見pH6.0處理組發(fā)酵24h活菌數(shù)較高，這與呂嘉櫪等（2020）報(bào)道的培養(yǎng)基pH 6時(shí)7株乳酸菌活性均最高結(jié)果一致。

表3 不同金屬離子處理對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)影響

2.4 2%(W/V)不同金屬離子（NaCl、MgCl2、CaCl2）處理對(duì)乳酸菌發(fā)酵液活菌數(shù)影響

以2%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期（約4h）施以2%不同金屬離子處理37℃繼續(xù)發(fā)酵不同時(shí)間取樣計(jì)數(shù)，結(jié)果如表所示：

除去6h時(shí)CaCl2處理組活菌數(shù)高于CK組外，其余各組與對(duì)照組差別不大，且到24～30h時(shí)各金屬離子處理組活菌數(shù)與對(duì)照組相比活菌數(shù)均較低，可能是金屬離子2%濃度對(duì)于植物乳桿菌BLCC2-0015過高，處理時(shí)間過長(zhǎng)，發(fā)酵液滲透壓變高，造成細(xì)胞增殖過緩甚至死亡。

鹽離子在一定濃度范圍內(nèi)可以維持微生物細(xì)胞內(nèi)滲透壓的平衡，超過一定量則會(huì)使細(xì)胞死亡（Pedersen，2012）。適當(dāng)?shù)牡望}濃度對(duì)部分乳酸菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，植物乳桿菌和副干酪乳桿菌的最適鹽濃度為1%（呂嘉櫪等，2020）。有研究發(fā)現(xiàn)一定范圍內(nèi)的NaCl與細(xì)胞的生長(zhǎng)量呈正相關(guān)關(guān)系，適量濃度的NaCl不僅能夠增加生物量，提升抗逆性能，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2%時(shí)菌株的生長(zhǎng)受到延滯，這與本項(xiàng)目研究結(jié)果一致（畢潔等，2005；王婧瑩等，2019；畢夢(mèng)迪等，2020）。

3 總結(jié)

本研究以植物乳桿菌BLCC2-0015為研究對(duì)象，發(fā)酵過程處以不同溫度、pH、鹽離子亞致死處理，以期提高發(fā)酵液活菌數(shù)。結(jié)果表明，在對(duì)數(shù)期20℃及pH6.0處理1h發(fā)酵液活菌數(shù)分別可以達(dá)到3.23、3.95×109cfu/mL，與對(duì)照組相比活菌數(shù)分別可以提高14.73、31.67%，且差異顯著（P<0.05）。2%的NaCl、CaCl2、MgCl2亞致死處理不能提高發(fā)酵液活菌數(shù)。乳酸菌亞致死脅迫適應(yīng)性的研究，對(duì)于篩選優(yōu)良菌株、制備發(fā)酵制劑以及構(gòu)建工程菌株都具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義（趙文英等，2008）。植物乳桿菌BLCC2-0015發(fā)酵對(duì)數(shù)期進(jìn)行低溫度（20℃）處理、酸度（pH6.0）亞致死處理可以提高發(fā)酵液活菌數(shù)，以期達(dá)到提高該類產(chǎn)品貨架期的目的。