李 瑩， 楊超群， 高梓峰， 婁鳳菊， 杜鑫宇， 樸世領*

(1.延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 13302；2.通化農(nóng)業(yè)學校，吉林 通化 134001 )

低溫是造成早花的主要原因，而早花是影響煙株品質(zhì)的重要因素[1]。當煙草遭遇低溫脅迫時，會由營養(yǎng)生長迅速轉(zhuǎn)向生殖生長，進而導致葉片數(shù)減少，且葉片偏小、品質(zhì)不佳，造成產(chǎn)量和品質(zhì)降低[2]。低溫脅迫下，煙草的理化性質(zhì)會發(fā)生變化：1) 低溫脅迫會影響植物光合作用和呼吸速率，從而抑制水分和養(yǎng)分的吸收，生物膜結(jié)構(gòu)被破壞，最終致使細胞死亡[3]。2) 低溫脅迫能降低葉綠體合成，相關酶活性抑制葉綠素的合成，造成植物光抑制現(xiàn)象產(chǎn)生，葉綠素含量的下降限制了植物光合速率，從而影響植物正常光合產(chǎn)物的合成[4]。

植物可以調(diào)節(jié)滲透來維持細胞內(nèi)外平衡，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)pH值維持正常代謝從而維持反應平衡響應低溫脅迫。植物體內(nèi)游離脯氨酸在正常生長條件下含量很低，但當植物受到逆境脅迫后，游離脯氨酸大量積累[5]。有關研究指出[6-8]，在低溫脅迫下植物脯氨酸含量增加的幅度越大，其抗寒性越強。植物細胞中存在的可溶性糖與植物抗寒性密切相關[9]，受低溫的作用后可溶性糖含量會升高，它不僅是細胞代謝過程中的產(chǎn)物，也是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的信號，其信號通路與脅迫通路相互作用形成復雜的網(wǎng)絡，調(diào)節(jié)植物的代謝反應。可溶性蛋白能與水結(jié)合，可在低溫脅迫下維持細胞內(nèi)部的水分，此外，可溶性蛋白也可以通過影響基因的表達來提高植物的耐寒性[10]。

植物的耐寒性一直是植物抗逆研究的熱點，溫度是限制我國北方煙草生長最主要的影響因子，因早春低溫導致幼苗長勢差，誘導早花，嚴重影響煙葉的產(chǎn)量與質(zhì)量。該文旨在探討低溫脅迫下滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化規(guī)律及篩選耐寒性強的煙草品種，為煙葉生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

以烤煙品種龍江981、NC89及曬煙品種大蘭花、延曬9號為試材，通過人工氣候箱對4份煙草品種進行低溫處理。

1.2 試驗設計

將4份煙草種子在溫室進行播種，煙苗達到7～8葉齡時，放入人工氣候箱。處理組設置晝夜溫度均為9 ℃，對照組設置晝夜溫度均為24 ℃，晝夜?jié)穸染鶠?0%，設置晝夜光照為7 500 lx/0 lx，持續(xù)時間為9 d，分別在1.5、3、4.5、6、7.5和9 d 6個低溫脅迫時間進行取樣。每個階段取由上至下第3～6片葉作為試驗材料，3次重復。4份煙草品種低溫處理的設計方案見表1。

表1 試驗設計方案

1.3 試驗測定以及計算方法

1.3.1 干物重、葉綠素測定

每個處理階段取長勢一致的煙苗3株，洗凈表面灰塵后同時放入DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱中(65～80 ℃)，烘至恒重，冷卻后測定質(zhì)量即為干物重。葉綠素含量通過葉綠素儀(SPAD-205)測定。

1.3.2 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)測定

采用蒽酮法[11]測定煙葉可溶性糖含量。采用考馬斯亮藍法[11]測定可溶性蛋白含量。采用茚三酮比色法進行測定游離脯氨酸含量[11]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 隸屬函數(shù)法

采用隸屬函數(shù)法[12]，對不同品種低溫處理9 d時生理指標數(shù)據(jù)進行計算，按照耐寒能力的強弱進行排序。用隸屬函數(shù)進行綜合評價，能對各品種的各項指標進行綜合分析，從而對品種做出耐寒性評價。

1.4.2 數(shù)據(jù)分析

低溫下所有品種的生理生化指標利用Excel進行簡單處理，利用SPSS 20對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Duncan多重比較法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫進程中4份煙草品種苗期干物重、葉綠素含量的變化

2.1.1 低溫脅迫進程中煙草苗期干物重的變化

不同煙草品種在低溫脅迫下干物質(zhì)的變化規(guī)律分析結(jié)果表明(表2)：與對照相比，低溫處理品種干物重增長較慢，低溫處理1.5 d時所有品種對照與相應處理之間均無顯著性差異(P>0.05)，低溫處理3～9 d期間，除3 d時T1(龍江981)外，其他品種的對照與其相應處理間均存在顯著性差異(P<0.05)。低溫處理9 d時，干物重較高的為T1(龍江981)與T4(延曬9號)，分別為0.86和0.84 g。

表2 低溫脅迫下不同煙草品種干物重的變化

不同煙草品種低溫持續(xù)下干物重的增幅變化可知(圖1)，隨著低溫脅迫的延長，與對照相比所有品種干物重降幅隨時間延長而不斷增大。在脅迫1.5 d時，僅有龍江981干物重含量為增幅，其他均為降幅。在3～9 d時，龍江981與延曬9號干物重含量降幅始終較小，NC89與大蘭花降幅始終最大，龍江981與延曬9號降幅之間無顯著性差異(P>0.05)，但龍江981與NC89、大蘭花之間均存在顯著性差異(P<0.05)。

2.1.2 低溫脅迫進程中煙草苗期葉綠素含量的變化

不同煙草品種在低溫脅迫下葉綠素變化規(guī)律分析結(jié)果表明(表3),當?shù)蜏孛{迫不斷加劇時，4份處理的煙草品種葉綠素含量均呈下降趨勢，而對照處理逐漸上升，低溫脅迫的4.5～9 d時，T2(NC89)、T3(大蘭花)與其相應對照之間存在顯著性差異(P<0.05)，而在7.5～9 d時，T1(龍江981)、T4(延曬9號)才與相應對照之間出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，說明龍江981與延曬9號受低溫脅迫后仍能較好的保持體內(nèi)葉綠素的含量，而NC89、大蘭花較差。

表3 低溫脅迫下不同煙草品種葉綠素含量的變化

由表3和圖2可知，低溫脅迫下4份煙草品種葉綠素含量變化規(guī)律與干物重變化規(guī)律基本一致。在4.5～9 d期間，龍江981與NC89、大蘭花葉綠素含量降幅之間始終存在顯著性差異(P<0.05)，而與延曬9號之間無顯著性差異(P>0.05)。脅迫9 d時，所有品種降幅均達到最大，降幅由小到大依次為龍江981(-14.31%)，延曬9號(-15.48%)、NC89(-24.93%)、大蘭花(-27.95%)。

2.2 低溫脅迫進程中4份煙草品種苗期滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化

2.2.1 低溫脅迫進程中煙草苗期Pro含量的變化

脯氨酸可以使細胞水勢增高保持細胞與外界壓強的穩(wěn)定[13]。從表4可以看出，不同煙草品種在低溫脅迫下，所有低溫處理脯氨酸含量均隨著脅迫天數(shù)的增加而不斷升高，而對照處理一直保持平穩(wěn)的水平；1.5 d時，T2(NC89)、T3(大蘭花)、T4(延曬9號)與其相應對照之間無顯著性差異(P>0.05)，而T1(龍江981)與其對照之間存在顯著性差異(P<0.05)；低溫處理至9 d時，T1(龍江981)與T4(延曬9號)的脯氨酸含量較高，分別為46.93和45.30 U/g，而T3(大蘭花)的含量最低，為37.19 U/g且與其對照之間存在顯著性差異(P<0.05)。

表4 低溫脅迫下不同煙草品種Pro含量的變化

由圖3可知，在低溫脅迫的期間龍江981的脯氨酸含量增幅始終最高，而大蘭花的增幅始終最低。在3～9 d期間，龍江981與NC89、大蘭花增幅之間均有顯著性差異(P<0.05)。由此可知，龍江981的耐寒性最強，而大蘭花的耐寒能力最弱。

2.2.2 低溫脅迫進程中煙草苗期可溶性糖(SS)含量的變化

低溫脅迫下植物體內(nèi)可溶性糖含量會不斷積累[14-15]。4份煙草葉片中的可溶性糖含量在低溫脅迫的環(huán)境下發(fā)生了顯著的變化(表5)，低溫處理的煙苗可溶性糖含量變化呈逐漸上升的趨勢，而對照處理緩慢上升。1.5～3 d期間，T2(NC89)、T3(大蘭花)與其相應對照之間均無顯著性差異(P>0.05)，而T1(龍江981)、T4(延曬9號)在低溫脅迫過程中始終與其相應對照有顯著性差異(P<0.05)；9天時，各個品種可溶性糖累積量均達到最高，T1(龍江981)與T4(延曬9號)可溶性糖累積量最高且顯著高于其他低溫處理，T3(大蘭花)的累積量最低，且與其對照之間存在顯著性差異(P<0.05)。

表5 低溫脅迫下不同煙草品種可溶性糖含量的變化

不同煙草品種在低溫脅迫下可溶性糖的增幅變化規(guī)律如圖4?？扇苄蕴堑脑龇S脅迫的延長逐漸上升。在1.5～9 d期間，龍江981與延曬9號增幅之間始終無顯著性差異(P>0.05)，并且顯著高于其他品種(P<0.05)，NC89和大蘭花增幅之間始終無顯著性差異(P>0.05)。9 d時，龍江981與延曬9號的增幅較高，說明其耐寒性較好，而NC89與大蘭花其體內(nèi)可溶性糖含量積累較少，耐寒性較弱。

2.2.3 低溫脅迫進程中煙草苗期可溶性蛋白(SP)含量的變化

可溶性蛋白能與水結(jié)合，可在低溫脅迫下維持細胞內(nèi)部的水分，此外，可溶性蛋白也可以通過影響基因的表達來提高植物的耐寒性[16]。低溫脅迫下4份煙草葉片可溶性蛋白含量發(fā)生了明顯的變化(表6)。所有低溫處理的可溶性蛋白含量不斷下降，且與相應對照處理之間均有顯著性差異(P<0.05)。低溫脅迫至9 d時，T1(龍江981)與T4(延曬9號)可溶性蛋白的含量高于其它低溫處理，其中T3(大蘭花)的可溶性蛋白含量最低。

表6 低溫脅迫下不同煙草品種可溶性蛋白含量的變化

由圖5可知，隨低溫脅迫的延長可溶性蛋白含量降幅越來越大。在低溫脅迫期間，龍江981與延曬9號之間始終無顯著性差異(P>0.05)。低溫脅迫至9 d時所有品種的降幅均達到最大。其中，龍江981的降幅最小(-17.12%)，而大蘭花的降幅最大(-25.56%)。

2.3 低溫脅迫9 d時，隸屬函數(shù)值及綜合排序

4份煙草品種在低溫脅迫9 d時的隸屬函數(shù)值均采用模糊數(shù)學中隸屬函數(shù)計算公式，先將9 d的生理生化指標測定值的變化幅度進行定量轉(zhuǎn)換為隸屬函數(shù)值，再將其隸屬函數(shù)值取平均進行比較。由表7可知，低溫脅迫9d后隸屬函數(shù)值排序由大到小依次為龍江981、延曬9號、NC89、大蘭花。龍江981的隸屬函數(shù)值最高，為0.724，大蘭花的隸屬函數(shù)值最低，為0.436。

表7 低溫脅迫9 d時隸屬函數(shù)值及排序

3 討論與結(jié)論

煙草在低溫脅迫條件下其生長受到抑制，隨著低溫脅迫的延長植物生長愈加緩慢甚至停滯[17]。而葉綠素作為植物光合作用的重要物質(zhì)，其含量的多少直接影響植物光合能力的強弱。該試驗結(jié)果表明，隨著低溫持續(xù)天數(shù)的延長，4份煙草品種干物重及葉綠素含量均呈下降趨勢，其降幅由小到大依次均為龍江981、延曬9號、NC89和大蘭花。說明植物體受低溫脅迫程度越大，其體內(nèi)葉綠素含量越低，導致植物光合能力減弱，影響干物質(zhì)的積累減少。

滲透調(diào)節(jié)是植物在逆境脅迫時出現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)方式，由細胞生物合成和吸收積累某些物質(zhì)來完成其調(diào)節(jié)過程。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)主要包括可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和甜菜堿等。植物細胞中存在的可溶性糖不僅是細胞代謝過程中的產(chǎn)物，也是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的信號[18]，在低溫脅迫的條件下會不斷的積累有利于提高植物的抗逆性[19]，同時，可溶性糖可以為植物代謝提供大量的碳源，能夠在逆境下為各種代謝提供基礎，從而增強植物的耐寒性[20]。脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)能保持環(huán)境滲透平衡。游離脯氨酸能促進蛋白質(zhì)的水合作用，蛋白質(zhì)膠體親水面積增大，保護酶的空間結(jié)構(gòu)為生化反應提供足夠的生理活性物質(zhì)，從而對細胞起到一定的保護作用。李建設等[21]以茄子為材料的試驗中得出，茄子在低溫脅迫后，脯氨酸的含量會大幅度上升，這說明脯氨酸與耐寒性密切相關，可以作為煙草耐寒性評價的指標之一。該試驗結(jié)果表明，隨低溫脅迫時間的延長，4份煙草品種的可溶性糖與脯氨酸含量均逐漸增加。其中，龍江981可溶性糖與脯氨酸含量增幅在各個時期均最大，而大蘭花增幅始終最小?？扇苄缘鞍椎挠H水性較強，能增加細胞的保水能力，從而提高植物的抗寒性?？购詮姷钠贩N可溶性蛋白含量高，反之則低。該試驗結(jié)果表明，隨低溫脅迫的延長，可溶性蛋白含量呈下降趨勢，降幅由大到小依次為大蘭花、NC89、延曬9號和龍江981，與陳衛(wèi)國[22]的研究結(jié)果相近。

該試驗采用隸屬函數(shù)法對4份煙草品種的耐寒性進行排序。隸屬函數(shù)是采用模糊數(shù)學理論來解決問題，是模糊集合的特征函數(shù)。隸屬函數(shù)分析提供了一條在多指標測定基礎上，對各植物特性進行綜合評價的途徑[23]。該試驗基于隸屬函數(shù)的耐寒性綜合評價結(jié)果為4份煙草品種耐寒性由強到弱依次為龍江981、延曬9號、NC89和大蘭花。

綜上所述，龍江981煙草品種耐低溫能力最強，而大蘭花對低溫敏感且耐寒性最差。