楊光武，田嫄

果蠅F-box基因促進脂肪儲存

楊光武，田嫄

貴州大學生命科學學院，貴陽 550025

脂質(zhì)是構成生物體的重要成分之一，脂質(zhì)代謝的精確調(diào)節(jié)和穩(wěn)態(tài)維持對人類健康至關重要。泛素化途徑通過降解脂質(zhì)相關蛋白來調(diào)控脂質(zhì)代謝。()編碼一種F-box蛋白，后者是SCF (Skp1-Cullin1-F-box)泛素化復合體成員之一。已有的研究表明在調(diào)控果蠅體節(jié)的正常發(fā)育和著絲粒組蛋白的正確定位方面發(fā)揮重要的作用，但在脂肪代謝方面的功能研究卻未見報道。本研究以黑腹果蠅()作為研究對象，探究了在脂肪儲存中的功能。通過與綠色熒光蛋白融合表達，檢測PPA的亞細胞定位；應用CRISPR/Cas9技術，構建的缺失突變體；通過BODIPY 493/503或Nile red脂滴染色，對缺失突變體和超量表達果蠅的脂滴形態(tài)改變進行分析。隨后，在缺失突變體中超量表達以驗證其功能。結果表明，PPA-GFP融合蛋白定位于唾液腺和脂肪體的細胞核中。與對照組果蠅相比，缺失突變體表現(xiàn)為脂滴變小；超量表達顯示出脂滴變大。在突變體中超量表達能夠?qū)⒅位貜椭琳顟B(tài)。綜上所述，本研究揭示了在果蠅中具有促進脂肪儲存的功能。

脂肪儲存；脂滴；CRISPR/Cas9；

脂質(zhì)代謝紊亂與肥胖、高血壓、糖尿病等代謝綜合征息息相關[1]。脂滴(lipid droplets, LDs)是由單層磷脂、中性核心脂質(zhì)和相關蛋白組成的細胞器，大多數(shù)動物的中性脂質(zhì)都儲存在脂滴中[2]。脂滴在許多方面都發(fā)揮著重要的生物學功能：首先，它是細胞內(nèi)脂肪酸轉(zhuǎn)運的重要位點，脂肪酸含量高的高脂細胞能夠通過脂滴向相臨的低脂細胞轉(zhuǎn)運脂肪酸[3]；其次，它是特定病毒的組裝平臺，肝細胞中的脂滴為極低密度脂蛋白的產(chǎn)生提供脂質(zhì)基礎，而丙肝病毒能夠侵入極低密度脂蛋白分泌途徑并附著在其表面，促進丙肝病毒以低密度脂病毒顆粒的形式釋放[4]；在神經(jīng)調(diào)節(jié)方面，遺傳性痙攣性截癱相關基因的敲除小鼠表現(xiàn)出運動協(xié)調(diào)和認知能力的缺陷，并且在神經(jīng)元中顯示出大量的異位脂肪累積[5]。脂滴的大小受到核心脂質(zhì)含量、單層磷脂組成和促進脂滴融合相關蛋白的影響[6,7]。大脂滴的形成有兩種機制，一種是脂滴的生長和膨脹，通常是通過將中性脂質(zhì)添加到脂滴核心來實現(xiàn)，另一種是由較小脂滴融合形成，但融合活性很低[8]。

真核生物中廣泛存在一類叫做F-box的蛋白家族[9]。F-box蛋白家族的N端具有特征性的F-box結構域，負責與其他蛋白結合形成SCF復合體，該復合體是一類E3泛素化連接酶，其C端具有底物識別結構域[10]。F-box蛋白與結合蛋白Skp1、骨架蛋白Cullin1和RING-finger蛋白Rbx1共同組成SCF復合體。該復合體招募攜帶泛素分子的E2結合酶并識別底物蛋白，參與選擇性降解生物活性蛋白質(zhì)的泛素–蛋白酶體途徑(ubiquitin proteasome pathway, UPP)，在細胞凋亡、細胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導和免疫應激等方面發(fā)揮重要作用[11,12]。研究表明，UPP介導多個脂滴相關蛋白的降解，例如，PLIN1是位于脂滴表面的特征性結合蛋白，能夠抑制脂質(zhì)降解，在小鼠的3T3-L1脂肪細胞中，PLIN1與選擇性自噬受體SQSTM1相互作用，并通過與泛素化蛋白特異性結合來降解PLIN1[13,14]。

是果蠅中繼后第二個被發(fā)現(xiàn)的編碼F-box蛋白的基因[15]。研究表明，在早期胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮作用。在體內(nèi)與由編碼的Eve共同作用，抑制轉(zhuǎn)錄激活因子Prd(由編碼，)，調(diào)控包括()在內(nèi)的體節(jié)極性基因的表達。在正常表達的細胞中，mRNA被Eve抑制，確保了Prd被激活，從而激活下游靶基因的表達；而在不表達的細胞中，mRNA緊挨Prd，并將Prd條帶降解，抑制下游靶基因的表達[16,17]。此外，在著絲粒的穩(wěn)定性維持方面也發(fā)揮重要作用，著絲粒組蛋白CID決定著絲粒的特性和功能，超量表達會使得該蛋白錯誤定位于染色體的非著絲粒區(qū)域，導致異位著絲粒的產(chǎn)生，從而引發(fā)染色體的錯誤分離[18]。介導的泛素化途徑能夠降解錯誤定位的CID，使該蛋白重新定位于著絲粒[19]。本研究通過蛋白定位、突變體分析和基因挽救實驗，發(fā)現(xiàn)可以促進果蠅中的脂肪儲存。

1 材料與方法

1.1 果蠅品系

實驗中所用到的果蠅均在玉米面培養(yǎng)基中飼養(yǎng)，嚴格按照實驗規(guī)章制度操作，果蠅來源及用途見表1。

1.2 果蠅組織染色

將3齡幼蟲在1×PBS緩沖液中解剖，獲得脂肪體和唾液腺。將組織放入4%多聚甲醛中固定30 min后，用1×PBS清洗2次，每次5 min。使用脂滴染料BODIPY 493/503或者Nile red避光染色30 min，使用細胞核染料DAPI避光染色10 min，使用細胞骨架染料Phalloidin 594避光染色30 min。用1×PBS清洗3次，每次5 min。在載玻片上滴加30 μL的70%甘油，將染色完畢的樣品轉(zhuǎn)移至載玻片上，蓋玻片壓片，最后用指甲油封片，將制作完成的片子在激光共聚焦顯微鏡上掃描成像。

表1 本研究中所用的果蠅品系

1.3 PPA的亞細胞定位分析

通過在/編碼區(qū)的C端添加表達綠色熒光蛋白的GFP序列，構建得到轉(zhuǎn)基因果蠅/。29℃下，利用驅(qū)動/的全身表達，解剖3齡幼蟲的唾液腺和脂肪體，使用DAPI和Phalloidin 594染色標記細胞核和細胞骨架，激光共聚焦顯微鏡下掃描成像。

1.4 sgRNA表達載體的構建

通過網(wǎng)站www.flyrnai.org/crispr2設計兩段sgRNA序列，其位于的CDS區(qū)的第78～97 nt和第518～538 nt，并在引物前添加I酶切位點。將設計好的sgRNA序列在Flybase上進行序列比對，確保在基因組中沒有其他配對區(qū)域。sgRNA及檢測引物序列見表2。

根據(jù)設計的sgRNA序列合成單鏈寡核苷酸片段，經(jīng)過退火形成兩端有粘性突出末端的雙鏈片段。用T4連接酶將sgRNA1和sgRNA2的退火片段分別連接到I酶切后的線性化載體pMD18T-U63- BsmB1上。經(jīng)過轉(zhuǎn)化實驗，篩選得到兩個連接成功的質(zhì)粒，pMD18T-U63--sgRNA1和pMD18T-U63--sgRNA2。通過PCR擴增給U63--sgRNA1和U63--sgRNA2添加接頭序列。利用Golden-gate連接將兩段由U63啟動子驅(qū)動的sgRNA連接到中間載體PCR/TOPO/GW-I-Bb。最后將組裝好的質(zhì)粒通過LR反應重組連接，得到pUAST-attB--sgRNAs表達載體。

表2 本研究中所用的引物序列

1.5 突變體鑒定與脂滴表型分析

將構建的pUAST-attB--sgRNA質(zhì)粒送至珠海聯(lián)合華益公司進行顯微注射，得到轉(zhuǎn)基因果蠅。將與表達Cas9蛋白的果蠅雜交，后代中得到同時表達Cas9蛋白與sgRNA的果蠅。使用-chk-F和-chk-R進行Founder的PCR鑒定，通過雜交得到純合的突變果蠅，并通過PCR擴增和DNA測序比對確定突變位點。具體的雜交策略如圖1所示。

研究選取了兩株突變體Ppa和Ppa以及兩者的雜交后代Ppa/Ppa進行分析，解剖獲得3齡幼蟲的脂肪體，使用DAPI和BODIPY 493/503標記細胞核和脂滴，激光共聚焦顯微鏡下掃描成像。通過Image-Pro Plus 6.0軟件對特定面積內(nèi)(143 μm×143 μm)的不同直徑脂滴進行數(shù)量統(tǒng)計，對照組與實驗組各選取3個樣本進行統(tǒng)計。通過GraphPad Prism 8軟件進行統(tǒng)計學分析并繪制統(tǒng)計圖。

圖1 利用CRISPR/Cas9技術的基因敲除雜交策略

1.6 超量表達Ppa的脂滴表型分析

T-A克隆/的編碼區(qū)，通過RⅠ和Ⅰ連接至pUAST-attB，獲得了轉(zhuǎn)基因果蠅/。29℃下，利用驅(qū)動/的全身表達，解剖3齡幼蟲的脂肪體，使用DAPI和Nile red染色標記細胞核和脂滴，激光共聚焦顯微鏡下掃描成像。通過Image-Pro Plus 6.0軟件對特定面積內(nèi)(143 μm×143 μm)的不同直徑脂滴進行數(shù)量統(tǒng)計，對照組與實驗組各選取3個樣本進行統(tǒng)計。通過GraphPad Prism 8軟件進行統(tǒng)計學分析并繪制統(tǒng)計圖。

1.7 基因挽救實驗

通過遺傳操作，構建得到Ppa;da>UAS-Ppa- RA/的果蠅。29℃下，在突變體Ppa中利用驅(qū)動/的全身表達，解剖3齡幼蟲的脂肪體，使用DAPI和BODIPY 493/503染色標記細胞核和脂滴，激光共聚焦顯微鏡掃描成像。

2 結果與分析

2.1 PPA融合熒光蛋白定位于細胞核

在前期工作中，發(fā)現(xiàn)超量表達能夠增強果蠅唾液腺的異位脂肪累積。本研究首先通過與綠色熒光蛋白融合表達，對PPA的定位進行分析。經(jīng)查Flybase得知，基因具有3個轉(zhuǎn)錄本，其中RA和RC具有相同的編碼區(qū)，RA與RB的mRNA序列一致，且RB的編碼區(qū)在RA/RC的基礎上越過了一個終止密碼子UGA。本研究克隆了/的編碼區(qū)，構建了融合蛋白表達載體并得到轉(zhuǎn)基因果蠅/。通過驅(qū)動/的全身表達，發(fā)現(xiàn)PPA-PA/PC在3齡幼蟲唾液腺的細胞核中檢測出強烈的熒光信號(圖2A)，并在3齡幼蟲脂肪體的細胞核中檢測出較弱的熒光信號(圖2B)，表明可能參與脂質(zhì)代謝。

2.2 Ppa缺失突變體的獲得與脂滴表型分析

為了進一步探究對脂肪代謝的影響，本研究利用CRISPR/Cas9技術構建基因缺失突變體。首先，構建了attB--sgRNA表達載體，通過顯微注射得到表達sgRNA的轉(zhuǎn)基因果蠅。將與表達Cas9蛋白的果蠅雜交，對進行基因敲除。通過對雜交后代的遺傳篩選和PCR鑒定，得到了兩株純合可活的缺失突變體Ppa和Ppa，具體策略詳見材料與方法。隨后對突變體進行測序鑒定，發(fā)現(xiàn)Ppa缺失了445 bp，Ppa缺失了446 bp，如圖3所示，缺失的片段位于編碼區(qū)的前端。

通過BODIPY對3齡幼蟲脂肪體中的脂滴進行染色標記，發(fā)現(xiàn)與對照組w相比，突變體Ppa和Ppa中的脂滴明顯減小(圖4：A～C)。在對照組中觀察到直徑較大的大脂滴，但在突變體中則表現(xiàn)為小脂滴的增加。由于CRISPR/Cas9技術具有潛在的脫靶效應，故本研究對兩個片段缺失等位基因的反式雜合突變體Ppa/Ppa的脂滴進行了分析，以消除遺傳背景上的其他未知突變對表型的影響，研究發(fā)現(xiàn)Ppa/Ppa的脂滴較對照組明顯減小，小脂滴數(shù)量明顯增多(圖4D)。隨后對特定面積內(nèi)不同直徑的脂滴進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)不同直徑的脂滴所占的比例具有顯著差異。與對照組相比，突變體表現(xiàn)出10 μm以上大脂滴減少(圖4F)。為了進一步驗證突變體中脂滴減小的表型，隨后在突變體Ppa中超量表達，發(fā)現(xiàn)脂滴較突變體明顯增大，但較對照組無顯著差異(圖4：E和F)，說明能夠回復突變體中脂滴減小的表型，并且提示的缺失是導致脂滴減小的原因，也進一步揭示了參與脂肪儲存的調(diào)控。

圖2 PPA-GFP在3齡幼蟲中的亞細胞定位

使用驅(qū)動/的全身表達。A：唾液腺的GFP信號；a：唾液腺的細胞核染色；a?：唾液腺的細胞骨架染色；a?：唾液腺的熒光信號合并圖。B：脂肪體的GFP信號；b：脂肪體的細胞核染色；b?：脂肪體的細胞骨架染色；b?：脂肪體的熒光信號合并圖。DAPI (藍色)：細胞核染色；GFP (綠色)：PPA-GFP的融合熒光蛋白；Phalloidin (紅色)：細胞骨架染色；Salivary gland：唾液腺；Fat body：脂肪體。標尺：25 μm。

圖3 突變體中的缺失區(qū)域示意圖與PCR擴增凝膠電泳圖

A：突變體缺失區(qū)域示意圖。只有一個外顯子，藍色方框表示sgRNA位點，虛線表示缺失片段。B：突變體的PCR擴增結果(使用檢測引物-chk-F和-chk-R進行鑒定)。M：2 kb DNA marker；：對照組(w)；Ppa和Ppa：片段缺失等位基因。

2.3 超量表達Ppa增強脂滴儲存的能力

為了進一步驗證在脂肪儲存中的作用，本研究檢測了超量表達對脂滴的影響。使用Nile red對3齡幼蟲脂肪體中的脂滴進行染色標記，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，超量表達/導致脂滴直徑明顯增加，表現(xiàn)為大脂滴的數(shù)量顯著增多(圖5：A和B)。針對脂滴大小的差異，統(tǒng)計了特定面積內(nèi)不同直徑脂滴的分布比例，與對照組相比，超量表達/表現(xiàn)出直徑10 μm以上的大脂滴比例明顯增加，而1～5 μm的小脂滴比例明顯減少(圖5C)，表明超量表達能夠?qū)е轮倔w中小脂滴減少和大脂滴增加。

綜上所述，本研究通過亞細胞定位分析，發(fā)現(xiàn)定位于唾液腺與脂肪體的細胞核中；通過缺失突變體的脂滴形態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)脂滴較對照組表現(xiàn)為直徑變小；通過超量表達，發(fā)現(xiàn)脂肪體中的脂滴較對照組表現(xiàn)為直徑增加，并且突變體中超量表達能夠?qū)⑼蛔凅w的脂滴減小表型回復至野生型狀態(tài)。以上結果表明具有促進脂肪儲存的作用。

圖4 Ppa缺失突變體在3齡幼蟲中的脂滴直徑變小

A～E：3齡幼蟲的脂滴染色圖。w：對照組；Ppa和Ppa：片段缺失等位基因；Ppa/Ppa：兩個等位基因的反式突變體；Ppa;/：突變體中超量表達；BODIPY (綠色)：脂滴染色；DAPI (藍色)：細胞核染色。F：特定面積內(nèi)(143 μm× 143 μm)不同直徑脂滴的分布比例統(tǒng)計圖。X軸是脂滴直徑(μm)，Y軸為特定面積內(nèi)不同直徑的脂滴所占的比例。1～5 μm：直徑1～5 μm的脂滴；5～10 μm：直徑5～10 μm的脂滴；>10 μm：直徑10 μm以上的脂滴。ns：>0.05；*：<0.05；**：<0.01；***：<0.001。標尺：25 μm。

圖5 超量表達Ppa導致3齡幼蟲中的脂滴大小增加

A、B：29℃下，和/的3齡幼蟲的脂滴染色圖。Nile red (紅色)：脂滴染色；DAPI (藍色)：細胞核染色。C：特定面積內(nèi)(143 μm×143 μm)不同直徑脂滴的分布比例統(tǒng)計圖。X軸是脂滴直徑(μm)，Y軸為特定面積內(nèi)不同直徑的脂滴所占的比例。1～5 μm：直徑1～5 μm的脂滴；5～10 μm：直徑5～10 μm的脂滴；>10 μm：直徑10 μm以上的脂滴。*：<0.05；***：<0.001。標尺：25 μm。

3 討論

在小鼠()中，F(xiàn)-box基因家族成員的缺失引發(fā)了高血糖和胰島素抵抗；同時，在小鼠肝臟中超量表達不僅能夠顯著抑制高脂喂養(yǎng)引發(fā)的胰島素抵抗，而且可以降低肥胖小鼠的高血糖[20,21]；人體細胞周期素依賴性激酶抑制蛋白(CDKIs)成員p27的缺失導致脂肪細胞數(shù)量的增加，F(xiàn)-box蛋白S期激酶Skp2能夠識別p27并對其進行降解；并且在的基因敲除小鼠中，皮下細胞和內(nèi)臟的脂肪細胞數(shù)量下降了50%，表明Skp2具有促進脂肪的作用[22]。在本研究中，選取了F-box家族成員PPA作為研究對象，發(fā)現(xiàn)片段缺失突變體表現(xiàn)為小脂滴增多，而超量表達導致大脂滴增加，并且突變體中超量表達能夠回復突變體脂滴減小的表型，這與的作用是相似的表明了F-box家族蛋白確實參與了脂質(zhì)代謝調(diào)控。

一般而言，F(xiàn)-box蛋白通過泛素-蛋白酶體途徑介導靶蛋白的降解，目前已報道的靶蛋白包括轉(zhuǎn)錄因子Prd和著絲粒組蛋白CID，它們調(diào)控著體節(jié)發(fā)育和著絲粒定位[17,19]，但未見報道與脂肪相關的靶蛋白。已有的研究表明，在HeLa細胞中敲除E3泛素連接酶編碼基因?qū)е轮呜S度增加，MARCHF6的泛素化底物包括Perilipin2 (PLIN2)、膽固醇轉(zhuǎn)運蛋白NPC1和膽固醇合成限速酶LDM，這些蛋白直接參與脂滴組成或膽固醇合成[23,24]。此外，泛素–蛋白酶體途徑參與調(diào)控脂質(zhì)代謝通路的多個關鍵酶。在小鼠肝臟中，脂肪甘油三酯脂酶ATGL是一種主要的甘油三酯分解酶，能夠?qū)⒏视腿シ纸獬捎坞x脂肪酸。研究表明，E3泛素連接酶COP1靶向降解ATGL，敲除小鼠的脂滴數(shù)量顯著減少，而超量表達引發(fā)小鼠脂滴數(shù)量的增加，表明COP1的功能是抑制脂肪分解[25]。此外，在奶牛乳腺上皮細胞中抑制蛋白酶體活性后，乙酰輔酶A羧化酶ACC的mRNA表達量顯著下調(diào)，但脂肪酸合成酶FASN的mRNA表達量顯著上調(diào)，說明泛素蛋白酶體途徑能夠調(diào)控脂肪酸合成[26]。作為SCF泛素化復合體的組分，具有富亮氨酸重復序列，該結構域能夠識別底物蛋白，推測其底物蛋白可能與脂質(zhì)合成或者脂滴結構形成相關。也有研究報道，F(xiàn)-box蛋白可以與其他蛋白結合形成復合體發(fā)揮作用，在釀酒酵母中，F(xiàn)-box蛋白Ctf13與Skp1、Cep3形成核心，這個由3種蛋白組成的核心與Ndc10結合，形成著絲粒復合體CBF3，該復合體對動粒的組裝至關重要[9,27]。本研究發(fā)現(xiàn)具有促進脂肪儲存的功能，而其下游的調(diào)控網(wǎng)絡還有待進一步研究。

致謝：

感謝中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所黃勛研究員提供的果蠅工具株和表達載體；感謝廣州霍夫曼免疫研究所焦仁杰教授和四川大學華西醫(yī)院陳海洋教授提供的sgRNA載體構建和基因敲除方案。

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The F-box genepromotes lipid storage in

Guangwu Yang, Yuan Tian

Lipid is one of the important components of living organisms. The precise regulation and homeostasis maintenance of lipid metabolism are essential to human health. The ubiquitination pathway regulates lipid metabolism by degrading lipid-related proteins.encodes an F-box protein, which is a member of the SCF ubiquitination complex. Previous studies reported thatregulated the body segmentation and the correct localization of centromere histones, while its function in lipid metabolism has not been reported. In this study,was used to explore the function ofin lipid storage.The subcellular localization of PPA was detected by fusion with green fluorescent protein. The deletion mutant ofwas constructed via CRISPR/Cas9 technology. The morphological changes of lipid droplets in deletion mutants andoverexpression flies were analyzed by BODIPY 493/503 or Nile red staining.Further,was overexpressed in the deletion mutant to verify its function.The results showed that PPA-GFP fusion protein were localized in the nuclei of salivary gland and fat body. Compared with the control flies, the lipid droplets indeletion mutants became smaller, and overexpression ofexhibited larger lipid droplets. Overexpression ofin the deletion mutant could restore the lipid droplets to normal state. In summary, this study demonstrated thatcould promote lipid storage in.

lipid storage; lipid droplets; CRISPR/Cas9;

2021-03-05;

2021-04-28

國家自然科學基金項目(編號：31600962)和貴州省科學技術基金資助項目(編號：[2017]1043)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31600962) and Guizhou Provincial Science and Technology Foundation (No. [2017]1043)]

楊光武，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：發(fā)育生物學。E-mail: ygw1996426@163.com

田嫄，博士，副教授，研究方向：果蠅脂肪代謝。E-mail: ytian1@gzu.edu.cn

10.16288/j.yczz.21-084

2021/5/7 14:44:00

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210507.1031.002.html

(責任編委: 閻言)