根腫病生防放線菌B18發(fā)酵條件的研究

蔣歡 唐貴婷 吳朝君 張勇 彭玉梅 蘇宇 趙冰峰 王旭祎

摘要 ：B18是一株對十字花科根腫病菌Plasmodiophora brassicae具有抑制作用的優(yōu)良生防放線菌，其活菌以及發(fā)酵液都可抑制根腫病菌休眠孢子萌發(fā)。為提高其菌體量以及孢子萌發(fā)抑制率，本文以菌體生物量和發(fā)酵液抑制根腫病菌休眠孢子活性為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)優(yōu)化B18的發(fā)酵培養(yǎng)基組分以及培養(yǎng)條件。結(jié)果表明：B18最適發(fā)酵培養(yǎng)基（1L）為蔗糖20 g，大豆粉10 g，牛肉膏5 g，NaCl 2.5 g，CaCO32.0 g;且在初始pH 7.0，初始接種量3%～7%，裝瓶量150 mL/250 mL，溫度25～30℃，150～200 r/min下發(fā)酵 72 h 所得的發(fā)酵液對孢子萌發(fā)抑制率最高且菌體量最大。隨后測定了發(fā)酵條件優(yōu)化后的B18發(fā)酵液的熱、酸堿、紫外線以及儲藏穩(wěn)定性。結(jié)果表明：B18發(fā)酵產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性較差，40℃以上其抑菌活性隨著溫度的升高而降低;發(fā)酵液在酸性、中性以及弱堿性條件下穩(wěn)定性較好，在強(qiáng)堿性條件下穩(wěn)定性變差;發(fā)酵液對紫外線不敏感，有較好的穩(wěn)定性;發(fā)酵液在4℃條件下更穩(wěn)定，30 d時(shí)孢子萌發(fā)抑制率仍可達(dá)到61.58%，常溫條件下不穩(wěn)定，15 d后抑制率明顯降低。

關(guān)鍵詞 ：根腫菌; 生防菌B18; 榨菜; 發(fā)酵條件; 發(fā)酵液

中圖分類號：

S 436.344

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020070

A study of cultural conditions for biocontrol actinomycetes

strain B18 against clubroot disease

JIANG Huan， TANG Guiting， WU Chaojun， ZHANG Yong， PENG Yumei，

SU Yu， ZHAO Bingfeng， WANG Xuyi*

（1. Southeast Chongqing Academy of Agricultural Sciences， Fuling 408099， China）

Abstract

Antagonistic Zhihengliuella aestuarii B18 is an excellent biocontrol actinomycetes which can inhibit Plasmodiophora brassicae. The living bacteria and fermentation broth can inhibit the germination of dormant spores. In order to increase the biomass and the inhibition rate of B18， the biomass and the inhibitory activity of fermentation liquid against resting spores of rhizopus were used as indicators， and the media and cultural conditions of strain B18 were optimized by single factor tests and orthogonal design. The results showed that the optimum fermentation medium（1L） for B18 included 20 g sucrose， 10 g soybean powder， 5 g beef extract， 2.5 g NaCl and 2.0 g CaCO3. When fermented at 25-30℃ and 150-200 r/min for 72 h， with an initial pH 7.0， initial inoculum amount of 3%-7% and a medium volume of 150 mL in 250 mL flask， the largest volume of B18 and the highest inhibition rate could be achieved. The heat， acid， alkali， ultraviolet and storage stability of B18 fermentation broth were determined. The results showed that the thermal stability of B18 fermentation products was poor; the bacteriostatic activity decreased with increasing temperature after 40℃; the stability of fermentation broth under acidic， neutral and weak alkaline conditions was better; the stability of fermentation broth became worse under strong alkaline conditions; the fermentation broth was insensitive to ultraviolet light and had a strong UV stability; the fermentation broth was more stable under 4℃ conditions， and the inhibition rate could reach 61.58% 30 d after storage， unstable at room temperature and decreased obviously after 15 d.

Key words

Plasmodiophora brassicae; antagonistic actinomycetes strain B18; mustard; fermentation conditions;fermentation broth

十字花科根腫病俗稱根癌病，是由蕓薹根腫菌Plasmodiophora brassicae Woron. 引起的十字花科作物的土傳病害，現(xiàn)全世界均有分布[1]。在中國，根腫病常年危害面積占十字花科作物種植面積的 1/3以上，平均產(chǎn)量損失達(dá) 20%～30%，發(fā)病嚴(yán)重田塊產(chǎn)量損失可達(dá) 60%以上，有的甚至絕收[24]。根腫病菌是一種專性寄生菌，不可人工培養(yǎng)，其休眠孢子可以在土壤中存活20年以上[5]，其寄主范圍廣，可危害榨菜、油菜、大白菜、甘藍(lán)、芥菜、蘿卜和板藍(lán)根等多種栽培以及野生的十字花科作物[610]。

國內(nèi)外已針對該病原菌進(jìn)行了大量防治技術(shù)的研究，包括抗病品種選育[11]、農(nóng)業(yè)和化學(xué)防治[1213]、生物防治[1415]等，其中生物防治因具有對人畜安全，環(huán)境兼容性好且病菌不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)而被重視并初見成效。本團(tuán)隊(duì)在對榨菜根腫病的生物防治前期研究中，從榨菜根際土壤中篩選出一株對榨菜根腫病防治效果良好的菌株B18。通過形態(tài)特征、生理生化特征、16S rDNA序列、DNA-DNA雜交，保守基因比對等鑒定方法，得到菌株B18的16S rDNA序列與模式菌株劉志恒屬Zhihengliuella aestuarii DY66T （EU939716）的相似度為100%，大于97%;與劉志恒屬菌落雜交相似度為76.4%，大于70%，綜合各項(xiàng)指標(biāo)，將B18歸類為劉志恒菌屬Zhihengliuella aestuarii。目前關(guān)于劉志恒屬菌的報(bào)道較少，在潮汐沉淀物中曾分離得到該屬放線菌[16]。但目前還沒有劉志恒屬菌作為生防菌的報(bào)道。該屬菌的生防機(jī)制目前還不清楚，抑制根腫病菌休眠孢子萌發(fā)可能是其主要的生防機(jī)制。在溫室和田間試驗(yàn)中，使用B18菌液的防治效果最好，離心后的上清液效果次之，菌沉淀效果最差。因此可能是B18的代謝產(chǎn)物和菌體同時(shí)發(fā)揮了生防作用。我們在前期研究中對B18做了全基因組測序，測序結(jié)果表明，B18含有抗生素萬古霉素和鏈霉素合成基因，以及幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶等降解細(xì)胞壁的酶基因，這些數(shù)據(jù)都很好地解釋了B18的生防功能，所以該菌具有良好的生防產(chǎn)品應(yīng)用開發(fā)前景。

為進(jìn)一步提高B18的生防效果，本文以菌體生物量和發(fā)酵液對根腫病菌休眠孢子的抑制率（后文簡稱孢子萌發(fā)抑制率）為指標(biāo)，應(yīng)用單因素以及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對B18的發(fā)酵培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件進(jìn)行篩選，確定其最適培養(yǎng)基組分、各組分的最佳組合和最佳組合下的最適培養(yǎng)條件，以期能提高菌株對根腫病菌休眠孢子萌發(fā)的抑制率，并為其在生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

生防菌發(fā)酵產(chǎn)物施用后，會受到陽光、溫度、土壤的酸堿性等各種因素的影響，本文將對B18培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件優(yōu)化后的發(fā)酵液進(jìn)行UV穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性以及儲藏穩(wěn)定性測定，作為評價(jià)B18發(fā)酵液是否具有應(yīng)用開發(fā)價(jià)值的參考指標(biāo)之一。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試榨菜‘涪雜5號，為本單位自制雜交品種。根腫病生防放線菌菌株B18為本團(tuán)隊(duì)從榨菜根際土壤中篩選出對榨菜根腫病防治效果良好的菌株;榨菜根腫病菌（未進(jìn)行單孢分離）采自重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院根腫病試驗(yàn)田，均放置冰箱-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

初始發(fā)酵培養(yǎng)基為豆粉液體培養(yǎng)基：大豆粉10.0 g，葡萄糖10.0 g，NaCl 2.5 g，蛋白胨 3.0 g，CaCO32.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

NA固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂粉15.0～18.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子液制備

B18接入NA培養(yǎng)基平板上進(jìn)行活化，30℃條件下培養(yǎng)72 h。再將活化的菌株接入豆粉液體培養(yǎng)液中，180 r/min，30℃條件下振蕩培養(yǎng)48 h，得到的培養(yǎng)液即為種子液。

1.2.2 發(fā)酵液制備

將種子液以1%的量接入豆粉液體培養(yǎng)基中，180 r/min，30℃下振蕩培養(yǎng)3 d，6 000 r/min離心5 min，收集上清液即為B18發(fā)酵液。

1.2.3 拮抗活性測定

1.2.3.1 根分泌物的收集

將榨菜種子在24℃條件下催芽2 d，播種在盛有100 mL 1/2 Hoagland營養(yǎng)液的100 mL小燒杯中的紗布上（紗布用橡皮筋固定在小燒杯杯口且與液面剛好接觸，后續(xù)培養(yǎng)過程中需要每天觀察，及時(shí)添加營養(yǎng)液以保持營養(yǎng)液體積不變），每杯播20粒，在24℃恒溫培養(yǎng)箱中（光照16 h，黑暗8 h）光暗交替培養(yǎng)14 d后收集含根分泌物的溶液，0.22 μm細(xì)菌過濾器過濾后4℃保存?zhèn)溆茫糜谛菝哝咦用劝l(fā)試驗(yàn)。

1.2.3.2 根腫菌孢子懸浮液的制備

根腫菌休眠孢子懸浮液的制備參照肖崇剛等[17]和郭向華[18]的方法。

1.2.3.3 根腫菌休眠孢子萌發(fā)抑制試驗(yàn)

在15 mL 離心管內(nèi)進(jìn)行根腫菌休眠孢子萌發(fā)抑制試驗(yàn)。首先將無菌根分泌物溶液和休眠孢子懸浮液（由無菌根分泌物溶液懸?。┗旌暇鶆?，休眠孢子終濃度為1.0×108個(gè)/mL，混合液 pH 用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至6.2。

在無菌條件下將混合液加入15 mL離心管中，無菌根分泌物溶液和休眠孢子囊懸浮液混合液4.5 mL， 生防菌發(fā)酵液0.5 mL，空白對照用等量液體培養(yǎng)基代替，每個(gè)處理重復(fù)3次。所有處理均置于24℃、黑暗條件下培養(yǎng)（每天需振蕩離心管2次以分散休眠孢子），于第10天 鏡檢休眠孢子萌發(fā)情況。

1.2.4 B18菌體生物量測定

B18培養(yǎng)液稀釋至10-7～10-9后取樣100 μL，涂布于NA平板，倒置于恒溫培養(yǎng)箱30℃培養(yǎng)36～48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.5 最適培養(yǎng)基組分以及培養(yǎng)條件對B18孢子萌發(fā)抑制率以及菌體生物量的影響

1.2.5.1 不同碳源對B18孢子萌發(fā)抑制率以及菌體生物量的影響

將初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源依次用10 g/L可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖替換，其他條件保持不變。測定不同碳源條件下的發(fā)酵液孢子萌發(fā)抑制率以及B18菌體生物量，確定最佳碳源，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.5.2 不同氮源對B18孢子萌發(fā)抑制率以及菌體生物量的影響

將初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源依次用10 g/L的大豆粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硫酸銨，及1%大豆粉+0.3% 蛋白胨、1%大豆粉+0.3%酵母膏、1%大豆粉+0.3%牛肉膏、1%大豆粉+0.3%硫酸銨替換（大豆粉用量為10 g/L，其余氮源用量為3 g/L），其他條件保持不變。測定不同氮源條件下的發(fā)酵液孢子萌發(fā)抑制率以及B18菌體生物量，確定最佳氮源，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.5.3 無機(jī)鹽對B18孢子萌發(fā)抑制率以及菌體生物量的影響

將初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽依次用2.5 g/L K2HPO4、MgSO4·7H2O、NaCl、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O替換。由于CaCO3在培養(yǎng)基中起調(diào)節(jié)的作用，液體發(fā)酵培養(yǎng)基中往往要加入一定的量，所以需要保持初始發(fā)酵培養(yǎng)基中CaCO3的量，其他條件保持不變。測定不同無機(jī)鹽條件下的發(fā)酵液孢子萌發(fā)抑制率以及B18菌體生物量，確定最佳無機(jī)鹽，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.5.4 發(fā)酵培養(yǎng)基成分正交試驗(yàn)

以單因子試驗(yàn)篩選出的最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽為變異因素，采用L9（34）正交表進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)，確定培養(yǎng)基各組分的最佳配比。

1.2.5.5 B18 發(fā)酵條件優(yōu)化

對B18發(fā)酵時(shí)間、溫度、初始pH、轉(zhuǎn)速、裝液量、初始接菌量等發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。發(fā)酵時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6、7、8 d;溫度分別為10、15、20、25、30、35℃;初始pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0;轉(zhuǎn)速分別為60、90、120、150、180、200 r/min;裝液量為250 mL三角瓶分別裝液30、60、90、120、150、180 mL;初始接菌量分別為裝液量的1%、3%、5%、7%、10%、15%。每個(gè)處理3次重復(fù)，測定各處理?xiàng)l件下發(fā)酵液的孢子萌發(fā)抑制率以及B18菌體生物量。

1.2.6 發(fā)酵液穩(wěn)定性測定

1.2.6.1 熱處理對B18發(fā)酵液抑菌效果的影響

將10 mL B18發(fā)酵液置于15 mL離心管中于20、40、60、80℃和100℃ 分別處理30 min 和 60 min，3次重復(fù)。待自然冷卻后以原發(fā)酵液為對照測定孢子萌發(fā)抑制率。

1.2.6.2 酸堿度變化對B18發(fā)酵液抑菌效果的影響

將發(fā)酵液用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH分別調(diào)整 pH 至3、5、7、9、11和13，靜置6 h后，再分別將各發(fā)酵液的 pH 慢慢調(diào)至7.2，每處理3次重復(fù)，測定孢子萌發(fā)抑制率。

1.2.6.3 紫外線照射對B18發(fā)酵液抑菌效果的影響

在15 mL離心管中加入10 mL B18發(fā)酵液后置于30 W紫外燈下（距燈管20 cm）分別照射15、30、45、60、75 min 和 90 min 后測定孢子萌發(fā)抑制率。

1.2.6.4 B18發(fā)酵液儲藏穩(wěn)定性測定

將B18發(fā)酵液置于4℃和常溫（重慶涪陵6月日均氣溫約為白天25～33℃，夜間20～25℃）下，保存1、8、15、22 d 和 30 d 后測定孢子萌發(fā)抑制率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用DPS軟件進(jìn)行差異顯著性分析，用Microsoft Excel軟件作圖并進(jìn)行分析。

孢子萌發(fā)率=視野下萌發(fā)孢子數(shù)/視野下總孢子數(shù)×100%;

孢子萌發(fā)抑制率=（對照組孢子萌發(fā)率-處理組孢子萌發(fā)率）/對照組孢子萌發(fā)率×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化

2.1.1 不同碳源條件下孢子萌發(fā)抑制率以及B18菌落數(shù)測定結(jié)果

不同碳源條件下孢子萌發(fā)抑制率以及B18菌落數(shù)差異顯著，多重比較結(jié)果（表1）顯示，以蔗糖為碳源時(shí)孢子萌發(fā)抑制率以及B18菌落數(shù)最高，分別為84.46%和7.49×1011 cfu/mL，顯著高于其他4種碳源;以乳糖為碳源時(shí)孢子萌發(fā)抑制率以及B18菌落數(shù)最低，分別為62.16%和0.79×1011 cfu/mL，顯著低于其他4種碳源，但菌落數(shù)與麥芽糖為碳源時(shí)差異不顯著，因此選擇蔗糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基碳源。

2.1.2 不同氮源條件下孢子萌發(fā)抑制率以及B18菌落數(shù)測定結(jié)果

不同氮源條件下孢子萌發(fā)抑制率以及B18菌落數(shù)差異顯著。多重比較結(jié)果（表2）顯示，以1%大豆粉+0.3%牛肉膏為氮源時(shí)孢子萌發(fā)抑制率以及B18菌落數(shù)最高，分別為84.39%和8.95×1011 cfu/mL，顯著高于其他氮源;以硫酸銨為氮源時(shí)孢子萌發(fā)抑制率以及B18菌落數(shù)最低，分別為52.62%和0.11×1011 cfu/mL，顯著低于其他氮源，所以選擇1%大豆粉+0.3%牛肉膏作為培養(yǎng)基氮源。

2.1.3 不同無機(jī)鹽條件下孢子萌發(fā)抑制率以及B18菌落數(shù)測定結(jié)果

不同無機(jī)鹽條件下孢子萌發(fā)抑制率以及B18菌落數(shù)差異顯著。多重比較結(jié)果（表3）顯示，以NaCl為無機(jī)鹽時(shí)孢子萌發(fā)抑制率以及B18菌落數(shù)最高，分別為78.43%和4.25×1011 cfu/mL，顯著高于其他4種無機(jī)鹽;以MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O 和CuSO4·5H2O為無機(jī)鹽時(shí)孢子萌發(fā)抑制率以及菌落數(shù)均較低，分別為7.56%、12.88%、7.28%，4.97×106、5.15×106、4.92×106cfu/mL，顯著低于NaCl和K2HPO4，所以選擇NaCl作為培養(yǎng)基無機(jī)鹽。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基成分正交試驗(yàn)

B18培養(yǎng)基營養(yǎng)成分正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表4所示，F(xiàn)檢驗(yàn)表明不同營養(yǎng)成分組合對B18發(fā)酵液的孢子萌發(fā)抑制率存在顯著影響，通過極差分析（k）可知，3種因素對菌株抑菌效果的影響依次為蔗糖>大豆粉>牛肉膏。蔗糖作為碳源對孢子萌發(fā)抑制率的影響最大。根據(jù)均值大小，得出發(fā)酵培養(yǎng)基中最佳的因素和水平組合為A3B1C3，即蔗糖20 g/L，大豆粉10 g/L，牛肉膏5 g/L是B18碳氮用量的最佳組合。

1） 各成分列括號內(nèi)數(shù)值代表各因素的值，即1 L培養(yǎng)基中的添加量（單位：g）。

Value in the brackets in the columns of nutrient components represent the content per one liter medium （Unit： g）.

選取正交試驗(yàn)中抑菌效果較好的3個(gè)組合（A3B1C3、A3B2C1、A3B3C2）測定B18生長情況，結(jié)果如表5所示。多重比較結(jié)果顯示，組合A3B1C3中B18生長最好，菌落數(shù)為7.68×1011 cfu/mL，顯著高于其他兩種組合和NA;NA中B18生長最差，菌落數(shù)僅為0.85×1011 cfu/mL，顯著低于其他3種組合，所以選擇A3B1C3作為B18發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組合。

2.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

B18在不同發(fā)酵條件下孢子萌發(fā)抑制率以及菌落數(shù)如圖1所示，不同初始pH（圖1a）下B18孢子萌發(fā)抑制率以及菌落數(shù)差異顯著，在pH 5.0～7.0范圍內(nèi)孢子萌發(fā)抑制率和菌落數(shù)隨 pH 升高而上升，pH超過7.0時(shí)隨 pH 升高而下降;pH 7.0時(shí)孢子萌發(fā)抑制率和菌落數(shù)最高，顯著高于其他pH， pH 5.0時(shí)最低，顯著低于其他pH;堿性條件下孢子萌發(fā)抑制率以及菌落數(shù)均優(yōu)于酸性條件。

不同接種量對B18孢子萌發(fā)抑制率以及菌落數(shù)影響顯著，接種量為15%時(shí)，孢子萌發(fā)抑制率顯著低于其他接種量，菌落數(shù)與接種量1%、7%差異不顯著，但顯著低于其他接種量;接種量為5%時(shí)，孢子萌發(fā)抑制率最高，顯著高于其他接種量，但與3%接種量差異不顯著;接種量為3%時(shí)，菌落數(shù)最多，顯著高于其他接種量，但與10%接種量差異不顯著;接種量在1%～7%時(shí)，孢子萌發(fā)抑制率在73.97%～78.69%，接種量為10%、15%時(shí)，降至63.47%～66.21%，綜合分析選擇初始接菌量為3%～7%（圖1b）。

不同發(fā)酵溫度對B18孢子萌發(fā)抑制率以及菌落數(shù)影響顯著，30℃以前孢子萌發(fā)抑制率以及菌落數(shù)隨溫度升高而上升，隨后隨溫度升高而下降;30℃時(shí)孢子萌發(fā)抑制率和菌落數(shù)最高，顯著高于其他溫度，但與25℃時(shí)的孢子萌發(fā)抑制率差異不顯著， 40℃時(shí)最低，顯著低于其他溫度;故選擇25～30℃為B18發(fā)酵溫度（圖1c）。

不同轉(zhuǎn)速對B18孢子萌發(fā)抑制率以及菌落數(shù)影響顯著，隨轉(zhuǎn)速增大而升高;孢子萌發(fā)抑制率在轉(zhuǎn)速為60 r/min時(shí)最低，顯著低于其他轉(zhuǎn)速，轉(zhuǎn)速為150、180、200 r/min時(shí)，差異不顯著，但顯著高于其他轉(zhuǎn)速;菌落數(shù)在轉(zhuǎn)速為60 r/min時(shí)最低，顯著低于其他轉(zhuǎn)速，轉(zhuǎn)速為180 r/min和200 r/min時(shí)，B18菌落數(shù)差異不顯著，但顯著高于其他轉(zhuǎn)速（圖1d）。

不同裝液量之間B18孢子萌發(fā)抑制率差異不顯著。裝液量為90 mL時(shí)，生長最好，菌落數(shù)除與150 mL裝液量差異不顯著外，顯著高于其他裝液量;裝液量為30 mL時(shí)生長最差，菌落數(shù)顯著低于60、90 mL和150 mL，與120 mL和180 mL差異不顯著（圖1e）。

發(fā)酵時(shí)間對B18孢子萌發(fā)抑制率以及菌落數(shù)影響顯著，前3 d孢子萌發(fā)抑制率以及菌落數(shù)隨發(fā)酵時(shí)間延長而升高，3 d后隨時(shí)間延長逐漸遞減，第3天最高，顯著高于其他發(fā)酵天數(shù)，但與第2天差異不顯著;第8天孢子萌發(fā)抑制率顯著低于前5 d，與第6天和第7天差異不顯著，菌落數(shù)顯著低于前6 d，與第7天差異不顯著（圖1f）。

2.4 B18發(fā)酵液穩(wěn)定性測定結(jié)果

2.4.1 熱穩(wěn)定性

溫度對B18發(fā)酵液孢子萌發(fā)抑制率影響顯著，40℃以上各溫度處理間差異顯著，隨溫度升高孢子萌發(fā)抑制率降低，且處理時(shí)間越長，孢子萌發(fā)抑制率越低，在100℃處理30 min 和 60 min 時(shí)，孢子萌發(fā)抑制率最低，僅為27.30%和28.79%（圖2）。說明B18發(fā)酵液熱穩(wěn)定性差。

2.4.2 酸堿穩(wěn)定性

pH 對B18發(fā)酵液孢子萌發(fā)抑制率影響顯著，pH 7.0時(shí)孢子萌發(fā)抑制率最高，顯著高于其他pH，但與pH 5.0差異不顯著;pH 13.0時(shí)最低，孢子萌發(fā)抑制率顯著低于其他pH;發(fā)酵液在酸性、中性以及弱堿性（pH 3.0～9.0）條件下，孢子萌發(fā)抑制率達(dá)到50.09%～72.75%;pH大于9.0的堿性條件下發(fā)酵液對孢子萌發(fā)抑制率均低于50%（圖3）。

2.4.3 紫外線穩(wěn)定性

紫外線照射對B18發(fā)酵液孢子萌發(fā)抑制率無顯著影響，發(fā)酵液對紫外線照射不敏感。在紫外線照射時(shí)間15～90 min范圍內(nèi)，孢子萌發(fā)抑制率在70.24%～76.17%（圖4）。

2.4.4 儲藏穩(wěn)定性

儲藏時(shí)間以及溫度對B18發(fā)酵液穩(wěn)定性影響顯著，發(fā)酵液在4℃下較常溫下更穩(wěn)定，孢子萌發(fā)抑制率隨存放時(shí)間延長而緩慢降低，到第30天時(shí)抑制率仍可達(dá)61.58%;常溫下，儲藏穩(wěn)定性差，孢子萌發(fā)抑制率隨時(shí)間延長顯著降低，在第22天和第30天時(shí)，抑制率分別為40.25%和32.36%，說明菌株的發(fā)酵液在低溫下儲藏更穩(wěn)定，30 d時(shí)仍可達(dá)到61.58%的孢子萌發(fā)抑制率;常溫下不穩(wěn)定，只能在15 d 之內(nèi)維持較高的孢子萌發(fā)抑制率（圖5）。

綜上所述，B18發(fā)酵液熱穩(wěn)定性差，40℃以上對根腫病菌孢子萌發(fā)抑制率降低;在酸性、中性以及弱堿性條件下，發(fā)酵液的穩(wěn)定性較好，強(qiáng)堿性條件下，穩(wěn)定性差;對紫外線不敏感;4℃低溫儲藏更穩(wěn)定，30 d之內(nèi)孢子萌發(fā)抑制率可保持61.58%～78.55%，常溫條件下僅在15 d 之內(nèi)維持較高的孢子萌發(fā)抑制率。

3 結(jié)論與討論

根腫病是由根腫病菌侵染引起，最明顯的特征是植物根部形成“腫瘤”，故名根腫病。對于該病的防治目前主要還是以化學(xué)防治為主，但生物防治由于具有與生態(tài)環(huán)境相和諧、和可持續(xù)發(fā)展等特點(diǎn)[19]，越來越受重視，目前已有許多關(guān)于根腫病生物防治的報(bào)道。Lee等[20]從大白菜根際土壤中篩選出3株內(nèi)生放線菌，對根腫病溫室防效分別為58%、33%和42%。Jaschke等[19]篩選出的內(nèi)生真菌Acremonium alternatum可以有效緩解感病擬南芥根腫病的發(fā)生，病情指數(shù)降低50%，侵染率降低20%。與正常發(fā)病植株相比，A.alternatum接種的宿主腫根小，含有的休眠孢子數(shù)少。Li等[21]通過化學(xué)誘變劑誘變生防菌株Bacillus subtilis XF-1，獲得了4株防治根腫病效果更好的突變株。Zhou等[22]在白菜根際土壤中分離到3株防治根腫病效果良好的抗生素溶桿菌菌株 Lysobacter antibioticus。

眾多研究表明，對發(fā)酵過程進(jìn)行科學(xué)合理的優(yōu)化，可以使目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量得到較大水平的提高。生防菌培養(yǎng)液組分以及培養(yǎng)條件優(yōu)化后可顯著提高菌株的防病效果、菌體生物量[23]以及抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量[2426]， Kiers等[27]研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的組成和配比對菌體生長、抗生素提煉工藝以及產(chǎn)品質(zhì)量等都有相當(dāng)大的影響。牛紅杰[28]通過對黃瓜枯萎病生防放線菌HS57液體發(fā)酵產(chǎn)孢培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝進(jìn)行研究，獲得適宜菌株 HS57 孢子產(chǎn)生的培養(yǎng)基。為提高B18的防效，本文以B18菌體生物量以及抑制根腫病菌休眠孢子萌發(fā)率為指標(biāo)，對培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同培養(yǎng)基組分對B18抑菌效果以及生長影響顯著，進(jìn)一步采應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對最優(yōu)培養(yǎng)基組分進(jìn)行組合試驗(yàn)，得到了B18培養(yǎng)基組分的最佳組合為A3B1C3，即蔗糖20 g/L，大豆粉10 g/L，牛肉膏5 g/L，培養(yǎng)基組分優(yōu)化后B18菌體生物量較NA培養(yǎng)基顯著提高。

菌株的發(fā)酵水平還與pH、發(fā)酵時(shí)間、通氣量、溫度等因素有關(guān)。pH可影響菌體的生長和代謝產(chǎn)物的合成，尤其是產(chǎn)物的穩(wěn)定性，杜連祥[29]研究發(fā)現(xiàn)放線菌生長的最適pH范圍是6.0～8.0。溫度對放線菌的生長亦有影響，Breidt等[30]的研究表明大多數(shù)放線菌的最適生長溫度為23～37℃。發(fā)酵時(shí)間的長短也是發(fā)酵生產(chǎn)中一個(gè)非常重要的指標(biāo)，直接影響代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率和質(zhì)量。本文通過單因素試驗(yàn)篩選B18的最佳發(fā)酵條件，結(jié)果顯示pH、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對B18孢子萌發(fā)抑制率以及生長影響顯著。初始接種量對B18孢子萌發(fā)抑制率影響顯著，但對B18生長影響不大。B18在不同的轉(zhuǎn)速和裝液量條件下孢子萌發(fā)抑制率以及生長情況均差異不大，說明B18對pH、溫度和發(fā)酵時(shí)間較敏感，其次初始接種量對B18孢子萌發(fā)抑制率有一定影響，最后得出B18最佳發(fā)酵條件為：在初始pH 7.0條件下，接種3%～7%種子液于150 mL（250 mL三角瓶）培養(yǎng)基中，在25～30℃，150～200 r/min下發(fā)酵3 d。故后續(xù)進(jìn)行大量發(fā)酵過程中，需關(guān)注pH、發(fā)酵溫度且嚴(yán)格把握發(fā)酵時(shí)間和初始接種量。

微生物的發(fā)酵是一個(gè)動(dòng)態(tài)的生物學(xué)過程， 培養(yǎng)基pH、組分含量以及溶氧量等不斷變化，這些變化會直接影響最終的發(fā)酵產(chǎn)物， 而在本文中僅考慮了最初的培養(yǎng)基組分以及培養(yǎng)條件，未監(jiān)測發(fā)酵過程中各因素的動(dòng)態(tài)變化。故在后續(xù)的研究中，應(yīng)對發(fā)酵過程中各因素進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測， 找到菌株發(fā)酵過程中各因素間更密切的聯(lián)系，進(jìn)一步提高菌株的生物量和孢子萌發(fā)抑制率。

生防菌發(fā)酵產(chǎn)物在各種環(huán)境條件下的穩(wěn)定性是評價(jià)該放線菌是否有開發(fā)價(jià)值的重要指標(biāo)之一。熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性等也是生防菌次級代謝產(chǎn)物開發(fā)中重要的衡量依據(jù)。王婧[31]研究發(fā)現(xiàn)放線菌A316和A10發(fā)酵液在紫外線、酸性或中性條件下比較穩(wěn)定，A316對熱的穩(wěn)定性較好，菌株A10在中低溫條件下穩(wěn)定。本文測定了B18發(fā)酵液的熱穩(wěn)定性，酸堿穩(wěn)定性，紫外線穩(wěn)定性和儲藏穩(wěn)定性，結(jié)果顯示B18發(fā)酵液對40℃以上的高溫以及強(qiáng)堿敏感，這與前面發(fā)酵條件的篩選結(jié)果一致。另外B18發(fā)酵液在常溫條件下儲藏穩(wěn)定性差，故在后續(xù)的產(chǎn)品開發(fā)中需選擇合適的劑型或添加合適的保護(hù)劑對菌株進(jìn)行保護(hù)以延長貨架期。B18發(fā)酵液對紫外線不敏感，這有利于B18田間施用后持續(xù)發(fā)揮抑菌作用。

后續(xù)還需要繼續(xù)研究B18在田間的定殖菌量隨時(shí)間的變化規(guī)律，確定B18的田間定殖能力，再結(jié)合本文的研究結(jié)果，以確定B18的開發(fā)與應(yīng)用價(jià)值。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）