奧沙利鉑(Ⅳ)納米藥物在原發(fā)性肝癌小鼠中的作用機制及對瘤體體積的影響*

張月凡 張游 胡家駿 黃文秋 王靜波

(1.航天中心醫(yī)院，北京 100049；2.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都610072)

原發(fā)性肝癌(Primary liver cancer,PLC)致死率較高，死亡率占全球疾病死亡人數(shù)的43%，嚴重威脅人類生命和健康[1]。癌癥的侵襲轉移過程十分復雜，與各種黏附相關分子、細胞因子、調(diào)節(jié)因子、信號轉導通路密切相關[2]。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌β-catenin的異常改變與Wnt信號激活有極大關系，Wnt與關聯(lián)受體互相作用，使無法被水解的β-catenin與目的基因在細胞核中結合，因此β-catenin水平上升。隨著對β-catenin的深入研究，發(fā)現(xiàn)β-catenin在肝癌增值、轉移過程中扮演重要角色[3]。臨床肝癌治療藥物以2價的奧沙利鉑(Ⅱ)最為常見，但與其他鉑藥相同，存在毒副作用大、靶向治療效果較差、有效藥物吸收濃度低等不確定因素。近年來，4價奧沙利鉑(Ⅳ)納米膠束 M(Pt)藥物，因其可降解、毒副作用小在臨床得到廣泛應用[4-5]。但其具體作用機制的研究還處于起步階段，4價奧沙利鉑(Ⅳ)通過阻斷wnt1、β-catenin信號的激活能否作為肝癌的治療策略還有待考察[6]。由此，本文通過建立分組進行實驗，探討奧沙利鉑(Ⅳ)納米藥物在原發(fā)性肝癌小鼠中的作用機制及對瘤體體積的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 Trizol試劑(浙江AMEKO)，逆轉錄試劑盒(武漢 賽維爾)，RT-PCR試劑盒(上海 優(yōu)予)，RPMI-1640培養(yǎng)基(上海 博升)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海 撫生實業(yè))，腹水型H22肝癌細胞(上海 奧陸生物)，40只雄性昆明小鼠(長沙 天勤生物)，體重(19.15±2.12)g。

1.2 模型制備 選取40只小鼠用于建立原發(fā)性肝癌模型，于小鼠左葉肝臟接種濃度為2×107/mL的H22肝癌細胞懸液0.05 mL，正常飼養(yǎng)1周后，選取30只模型小鼠分Ha組(原發(fā)性肝癌模型+奧沙利鉑(Ⅳ)納米藥物)、Hb組(原發(fā)性肝癌模型+奧沙利鉑(Ⅱ)、Hc組(原發(fā)性肝癌模型+生理鹽水)，Ha組小鼠與尾靜脈注射奧沙利鉑(Ⅳ)納米藥物5 mg/kg隔天給藥，Hb組注射同等劑量奧沙利鉑(Ⅱ)，Hc組注射生理鹽水。

1.3 腫瘤體積計算 2周后麻醉，打開小鼠腹腔，取完整的肝組織后斷髓處死，檢查發(fā)現(xiàn)左肝葉凹凸不平，可明顯見到腫瘤生成，小鼠造模成功率95%(38/40)，縫合腹部切口，實驗在無菌環(huán)境下進行。原位肝癌腫瘤組織完整剝除，采用腫瘤的體積測量公式:長×寬2×0.5[1]，電腦測算出每組肝臟腫瘤的體積，取平均值，實驗在無菌環(huán)境下進行。

1.4 HE染色 小鼠肝組織利用甲醛溶液固定，乙醇溶液脫水，5 μm連續(xù)切片，蘇木精和伊紅染色液復染分別為6～8 min和10s，與顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)，對肝臟病變程度進行觀測，將剩余肝組織保存在-80℃下封存，以便后續(xù)實驗中提取蛋白。

1.5 RT-PCR檢測肝組織wnt1、β-catenin水平變化 將胰蛋白酶加入小鼠肝組織中進行消化反應，進行PBS沖洗，然后滴入0.9%Nacl溶液，總RNA采用rizol法來提取，總RNA提取反轉錄成 cDNA，按全說明書進行實驗，用DNA熒光染料SYBR GreenⅠ對wnt1、β-catenin表達水平進行檢測，內(nèi)參采用GAPDH，60℃，10 min、95℃、72℃，各 30 s 、95℃ 5 min，循環(huán)次數(shù)以40為準，實驗次數(shù)至少3次，用相對定量2-ΔΔCT計算wnt1、β-catenin表達，見表1。

1.6 Westernblot法檢測肝組織wnt1、β-catenin蛋白表達 在6孔板中加入100 μg的胰蛋白酶提取液，再注入2 mL的培養(yǎng)基，將轉染后的細胞放入EP管中,并與胰蛋白酶提取液按照1∶100進行混合,再放入冰箱中冷凍10分鐘，使細胞完全裂變，成為E溶液;再EP管中按照1∶100比例加入胰蛋白酶提取液2mL，使細胞完全裂變成為F溶液，把E和F溶液以80∶1的體積進行搖勻，配制成工作液，放入37.5℃的保溫箱中20分鐘，冷卻后計算wnt1、β-catenin蛋白濃度。

1.7 流式細胞術檢測肝組織細胞調(diào)亡情況 取小鼠肝組織乙醇溶液固定，剪碎后置于100目的網(wǎng)上輕搓，PSB沖洗后收集沖洗液，300目尼龍網(wǎng)過濾，收集懸浮液，置于離心機中，600 rpm離心8 min，除去上清液，制成細胞懸浮液，緩沖后加入5μL的碘化丙啶、V-FITC，無光條件孵育20 min，經(jīng)過濾后上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2 結果

2.1 瘤體體積變化 與Hc組瘤體積對比，Hb組有所下降，與Hb組對比，Ha組瘤體體積明顯下降，瘤體積從高到低依次為Hc組、Hb組、Ha組(P<0.05)，見圖1。

圖1 瘤體體積變化Figure 1 Changes in tumor volume注：與Ha組對比，①P<0.05；與Hb組對比，②P<0.05

2.2 HE染色 Hc組組織中出現(xiàn)大量腫瘤壞死區(qū)域，纖維增生明顯，細胞核呈分裂狀態(tài)，Hb組纖維增生狀態(tài)、壞死區(qū)域、細胞核分裂情況好于Hc組，Ha組纖維增生明顯減少，肝組織病理改變情況好于Hb組、Hc組，見圖2。

圖2 HE染色(200×)Figure 2 HE staining

2.3 RT-PCR檢測肝組織wnt1、β-catenin水平變化 RT-PCR檢測顯示：與Hc組對比，Hb組小鼠wnt1、β-catenin水平下降明顯，與Hb組對比，Ha組小鼠wnt1、β-catenin水平有所下降，Hc組wnt1、β-catenin水平最高，Hb組其次，Hc組最低(P<0.05)，見圖3。

圖3 肝組織wnt1、β-catenin水平變化Figure 3 Changes of wNT1 and -catenin levels in liver tissues注：與Ha組對比，①P<0.05；與Hb組對比，②P<0.05

2.4 Westernblot法檢測肝組織wnt1、β-catenin蛋白表達 Westernblot法檢測顯示：與Hc組對比，Hb組小鼠wnt1、β-catenin蛋白表達下降明顯，與Hb組對比，Ha組小鼠wnt1、β-catenin蛋白表達有所下降，Hc組wnt1、β-catenin蛋白表達最高，Hb組其次，Ha組最低(P<0.05)，見圖4。

圖4 3組大鼠肝組織wnt1、β-catenin蛋白表達Figure 4 Expression of wNT1 and -catenin protein in liver tissues of rats in the three groups注：A.三組wnt1、β-catenin蛋白表達；B.三組wnt1、β-catenin蛋白表達比較。與Ha組對比，①P<0.05；與Hb組對比，②P<0.05

2.5 流式細胞術檢測肝組織中的肝細胞調(diào)亡情況 流式細胞術檢測顯示：與Ha組對比，Hb組小鼠肝細胞凋亡率降低，與Hb組對比，Hc組小鼠肝組織細胞凋亡率有所下降，Hc組小鼠肝細胞凋亡率最高，Hb組其次，Hc組最低(P<0.05)，見圖5。

圖5 3組大鼠肝組織中干細胞凋亡情況Figure 5 Apoptosis of stem cells in liver tissues of rats in the three groups注：A.肝組織中的肝細胞調(diào)亡情況；B.肝組織中的肝細胞調(diào)亡情況比對。與Ha組對比，①P<0.05；與Hb組對比，②P<0.05

3 討論

多年來，肝癌治療仍以手術切除最常見，雖然術后進行放療、化療生存率有較大的提高，但依舊存在復發(fā)和轉移的風險[7-8]。近年來有研究報道，Wnt信號通路在細胞增殖，細胞分化和細胞凋亡方面的作用機制[9]。在肝癌中，運用轉基因小鼠對Wnt信號通路進行研究，顯示W(wǎng)nt信號通路在肝癌組織中異常激活，并與下游β-catenin產(chǎn)生作用，對肝癌的增值、轉移有促進作用[10-12]。近年來，奧沙利鉑(Ⅳ)納米藥物因其具有生物可降解功能、見效快、藥效持久、不良反應較少等優(yōu)點，得到臨床工作者的廣泛認同[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與Hc組瘤體積對比，Hb組有所下降，與Hb組對比，Hz組瘤體體積明顯下降，瘤體積從高到低依次為Hc組、Hb組、Ha組。Hc組組織中出現(xiàn)大量腫瘤壞死區(qū)域，纖維增生明顯，細胞核呈分裂狀態(tài)，Hb組纖維增生狀態(tài)、壞死區(qū)域、細胞核分裂情況好于Hc組，Ha組纖維增生明顯減少，肝組織病理改變情況好于Hb組、Hc組。相關文獻報道，奧沙利鉑(Ⅳ)納米藥物屬于抗腫瘤藥物，被認定是抗肺癌效果較好的藥物，以奧沙利鉑(Ⅱ)為基礎研制而出，與奧沙利鉑(Ⅱ)擁有的抗癌譜類似，但兩者中奧沙利鉑(Ⅳ)納米藥物溶解性能、生物利用度偏高[14-15]。奧沙利鉑(Ⅳ)納米藥物可提升腫瘤的免疫原性，促進荷瘤機體中免疫細胞功能的恢復，毒副作用小，同時不易產(chǎn)生耐藥性[16-17]。還有研究證實，奧沙利鉑(Ⅳ)納米藥物對癌細胞的作用時間長，抗腫瘤活性能力較紫杉醇高，能殺死組織內(nèi)的癌細胞，加快藥物吸收，在腫瘤細胞侵入其他器官之前將之殺死，從根本上減少了癌癥的復發(fā)和轉移的可能性[18-19]，與本文研究相符。

本研究還發(fā)現(xiàn)，Hc組wnt1、β-catenin水平最高，Hb組其次，Ha組最低。與Ha組對比，Hb組小鼠肝細胞凋亡率降低，與Hb組對比，Ha組小鼠肝組織細胞凋亡率有所下降。相關研究證實，調(diào)節(jié)Wnt信號相關蛋白的活性可以產(chǎn)生“癌基因”作用，而抑制一些腫瘤癌基因的表達，可發(fā)揮“抑癌基因”的作用，奧沙利鉑(Ⅳ)納米藥物能有效抑制Wnt/β-catenin 活性[20]。有研究者發(fā)現(xiàn)，多數(shù)癌癥患者機體中β-catenin的表達都有提升，異常表達的Wnt/β-catenin 可加劇機體免疫細胞的損傷。奧沙利鉑(Ⅳ)納米藥物抑制Wnt信號表達后，癌細胞的放射敏感性就會降低，從而提高放療和化療的效果[21]。Wnt通路還在眾多腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，例如在胃癌和子宮內(nèi)膜癌中的異常變化具有重要參考價值，Wnt通路信號被激活時，靶器官的分化受到限制，干細胞特異性被保留，會加快肝癌細胞的分化，導致腫瘤形成[22]。

4 結論

奧沙利鉑(Ⅳ)納米藥物對原發(fā)性肝癌的療效好于奧沙利鉑(Ⅱ)，能明顯縮小肝癌小鼠瘤體積，其作用機制可能與抑制Wnt/β-catenin 活性有關系。