除草活性菌株HL-1產(chǎn)孢發(fā)酵條件研究

高漢峰，劉雨芹，程 亮，郭青云

(青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西寧作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，青海 西寧 810016)

植物內(nèi)生真菌HL-1分離自青海省化隆縣刺兒菜患病的葉片，并由青海省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所保存。研究發(fā)現(xiàn)，該菌株發(fā)酵液對(duì)藜(Chenopodiumalbum)和豬秧秧(Galiumaparine)等部分闊葉雜草具有較好的防除效果且對(duì)青稞(HordeumvulgareL. var.nudumHook.f.)、油菜(BrassicanapusL.)等主栽作物沒有影響，有望制成微生物菌劑，用于防除以闊葉雜草為主要草害的農(nóng)田[1]。該菌株以同心圓方式在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，分生孢子橢圓形，具有較發(fā)達(dá)的氣生菌絲；經(jīng)鑒定，菌株HL-1本質(zhì)為植物內(nèi)生真菌[1]。碳氮源、培養(yǎng)基含水量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度等都屬于控制參數(shù)，它們可以直接影響菌體的產(chǎn)量和質(zhì)量[2]。一般來說，生防菌的發(fā)酵方式有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種方式，但是液體發(fā)酵極容易受到細(xì)菌等雜菌的污染且長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵菌種易退化；而固體發(fā)酵由于成本低廉、發(fā)酵菌運(yùn)輸方便且容易儲(chǔ)藏等優(yōu)點(diǎn)受到了人們的青睞[3]。目前關(guān)于生防菌產(chǎn)孢發(fā)酵的報(bào)道有很多[4-5]。張潔等[6]以粉紅螺旋聚孢霉NF-06產(chǎn)孢量為目標(biāo)，篩選出麥麩和麥秸稈以質(zhì)量比4∶1混合后作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并在其中添加10%的玉米粉，2%蠶豆粉，0.05%KH2PO4時(shí)產(chǎn)孢量達(dá)到最大；后期正交優(yōu)化了初始pH、含水量、接種量的比例使其產(chǎn)孢量最大。Kaur等[7]以生防菌AlternariamacrosporaMKP1產(chǎn)孢量為考察，優(yōu)化結(jié)果表明該菌株在pH為6.5，溫度為25 ℃，相對(duì)濕度93%條件下產(chǎn)孢量最大。朱海霞等[8]以多孢木霉HZ-31為研究對(duì)象，篩選出了該菌的最適碳氮源為小麥粉和硫酸銨，適合的基質(zhì)為麥稈糠，并以培養(yǎng)基含水量、溫度、培養(yǎng)時(shí)間為考察因素優(yōu)化了其產(chǎn)孢的最佳組合。而盧智琴等[3]對(duì)禾谷孢囊線蟲(Heteroderaavenae)生防真菌AT9固體底物、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，篩選出了適合該菌株生長(zhǎng)的基質(zhì)、附加的碳氮源及比例并得出該菌株在20%接種量、32 ℃的黑暗培養(yǎng)、8 d的培養(yǎng)時(shí)間為最佳培養(yǎng)條件。綜上所述，生防菌的固體發(fā)酵不論是代謝產(chǎn)物還是產(chǎn)孢都具有研究意義。目前對(duì)于植物內(nèi)生菌的發(fā)酵條件研究主要集中在以內(nèi)生菌產(chǎn)生的一類化學(xué)物質(zhì)為目標(biāo)，以其優(yōu)化出最適合產(chǎn)該物質(zhì)的條件；而對(duì)于內(nèi)生菌的產(chǎn)孢量的研究涉及很少。本實(shí)驗(yàn)也以HL-1菌株的最大產(chǎn)孢量為最終目標(biāo)，利用單因素法確定了該菌株產(chǎn)孢的最適碳源、氮源以及培養(yǎng)基質(zhì)，利用正交試驗(yàn)確定基質(zhì)的最佳組合和菌株基質(zhì)培養(yǎng)條件的優(yōu)化。對(duì)于菌株而言，明確各產(chǎn)孢量與各因素關(guān)系，為該菌的菌劑研制提供理論基礎(chǔ)，也為后期該菌的各項(xiàng)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

植物內(nèi)生真菌HL-1分離于青海省化隆縣自然感病的刺兒菜，由青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)基

(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基Ⅱ配方：葡萄糖40 g，酵母膏10 g，磷酸鈉2 g，硫酸鎂1 g，自然pH值[9]。

(2)PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，瓊脂粉20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L，自然pH值。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 最適碳源氮源的確定

設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，以等質(zhì)量的玉米粉、小麥粉、蔗糖、葡萄糖分別作為C1、C2、C3、C4的碳源；以等質(zhì)量的硝酸鉀、大豆粉、酵母浸膏、(NH4)2SO4分別作為N1、N2、N3、N4的氮源，按2%的添加量，將供試碳氮源添加到PDA培養(yǎng)基中，充分混勻，配制成不同碳氮源類型的培養(yǎng)基[10]。在經(jīng)活化的且菌絲生長(zhǎng)旺盛的邊緣用打孔器(8 mm)取菌餅，接入培養(yǎng)基(9 cm)的中央，在 26 ℃條件下黑暗倒置培養(yǎng)7 d并定期以血球計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)產(chǎn)孢量，同時(shí)用分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)其菌懸液D值。以不加碳氮源的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)。

最后再將篩選出的最適碳氮源結(jié)合制成培養(yǎng)基，統(tǒng)計(jì)其產(chǎn)孢量，得出最適碳氮源的最終產(chǎn)孢量，確定篩選效果[11-13]。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)篩選

選用低成本的羊糞、麥麩、菜籽餅、麥稈糠、珍珠巖和蛭石為培養(yǎng)基質(zhì)[14]。將基質(zhì)分別放入白塑料盤中，將一定量的無菌水加入到待選的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中混勻，加入水的量剛好使得基質(zhì)可以在手中攢成團(tuán)為宜，然后加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基Ⅱ的營(yíng)養(yǎng)成分，充分混勻，于121 ℃滅菌 30 min，待冷卻后每個(gè)處理接菌液200 mL。放入20 ℃的室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d后測(cè)出其孢子懸浮液的D值。

1.3.3 最適接菌量確定

將25 g菜籽餅加入三角瓶(150 mL)中，滅菌后，在超凈工作臺(tái)中加入培養(yǎng)基Ⅱ的營(yíng)養(yǎng)成分并混勻，再在每個(gè)三角瓶中加入無菌水20 mL。將基質(zhì)體積的10%、20%、40%、60%、80%、100%菌懸液接入三角瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)7 d后用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)確定產(chǎn)孢量最高的接菌量。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.3.4 最適培養(yǎng)基含水量范圍

準(zhǔn)確稱取25 g菜籽餅后，裝入三角瓶(150 mL)，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基Ⅱ營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)混勻，按基質(zhì)體積分?jǐn)?shù)分別加 10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%蒸餾水[15-16]，滅菌后接種基質(zhì)體積分?jǐn)?shù)30%的該菌株，放入恒溫培養(yǎng)箱25 ℃培養(yǎng)，觀察三角瓶?jī)?nèi)菌落的生長(zhǎng)狀況，7 d后測(cè)孢子懸浮液的D值，結(jié)合D值和菌落生長(zhǎng)狀況，得出適合該菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基含水量范圍。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.5 最適培養(yǎng)基溫度范圍

準(zhǔn)確稱取25 g菜籽餅后，裝入三角瓶(150 mL)，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基Ⅱ營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)混勻后滅菌30 min，在超凈工作臺(tái)上加無菌水40 mL，將適量菌懸液接入三角瓶?jī)?nèi)，在恒溫箱中設(shè)定15、20、25、30、35 ℃黑暗培養(yǎng)，7 d后測(cè)孢子懸浮液的D值，結(jié)合D值和三角瓶?jī)?nèi)菌落生長(zhǎng)狀況，得出適合該菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)溫度范圍。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

表1 HL-1菌株發(fā)酵條件的二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)

1.3.6 二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)

取培養(yǎng)時(shí)間和單因素實(shí)驗(yàn)篩選出培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)基含水量作為3個(gè)考察因素，分別各取5個(gè)水平，二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)以確定HL-1的最優(yōu)培養(yǎng)條件[16-17]。在三角瓶?jī)?nèi)做正交試驗(yàn)，方法同上，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HL-1菌株碳氮源篩選

2.1.1 HL-1在PDA上的菌落形態(tài)

菌落疏松，易挑取。菌落以同心圓的方式生長(zhǎng)，具有發(fā)達(dá)的氣生菌絲，生長(zhǎng)前期為白色，后期顏色逐漸變?yōu)楹稚?，最后變成黑?圖1)。

圖1 HL-1菌株在PDA上的菌落形態(tài)(25 ℃，7 d)Fig.1 Colony morphology of HL-1 strain on PDA (25 ℃，7 d)

2.1.2 不同的碳氮培養(yǎng)基HL-1菌株的菌落形態(tài)

如表2和圖2所示，在碳源培養(yǎng)基上HL-1菌落生長(zhǎng)為白色或者乳白色，在氮源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為褐色或灰褐色；在C4培養(yǎng)基上菌落旺盛的生長(zhǎng)，在C1和C3培養(yǎng)基上生長(zhǎng)有發(fā)達(dá)的氣生菌絲；在N3培養(yǎng)基上，HL-1具有較大的菌落且長(zhǎng)勢(shì)最好，N4上具有較小的菌落，長(zhǎng)勢(shì)也較差。

表2 HL-1菌株在不同碳氮源培養(yǎng)基上菌落形態(tài)記錄表

圖2 不同的碳氮培養(yǎng)基HL-1菌株的菌落形態(tài)Fig.2 The colony morphology on different carbon and nitrogen sources of HL-1 strain

在不同碳氮源培養(yǎng)基上HL-1孢子數(shù)及菌懸液D值分別用血球計(jì)數(shù)法和分光光度計(jì)法測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表3。在4種碳源的培養(yǎng)基中，C4的產(chǎn)孢量最高，為1.50×108CFU·mL-1，孢子懸浮液的D值同樣也最大，且測(cè)定懸浮液D值與其他碳源孢子懸浮液D值之間具有極顯著(P<0.01)的差異；在4種氮源培養(yǎng)基中，N3產(chǎn)孢量最高，為2.20×109CFU·mL-1，懸浮液D值與其他氮源孢子懸浮液D值之間有極顯著(P<0.01)差異；把C4和N3結(jié)合制成的混合培養(yǎng)基，產(chǎn)孢量為4.81×109CFU·mL-1，是最大的產(chǎn)孢培養(yǎng)基質(zhì)。綜上，菌落生長(zhǎng)形態(tài)、氣生菌絲發(fā)達(dá)狀況、產(chǎn)孢量和D值，確定葡萄糖和酵母浸膏是最適HL-1產(chǎn)孢的碳源和氮源。

表3 不同碳氮源培養(yǎng)基上HL-1菌株的平均產(chǎn)孢量和孢子懸浮液D值

2.2 HL-1菌株固態(tài)基質(zhì)篩選

觀察基質(zhì)表面菌絲生長(zhǎng)狀況，7 d后將其過濾后制成孢子懸浮液，然后使用紫外分光光度計(jì)測(cè)出每種懸浮液的D值，D值可以衡量該菌株在不同基質(zhì)內(nèi)的產(chǎn)孢量大小。

由朗伯-比爾定律可知孢子懸浮液孢子濃度和D值為正比關(guān)系，而孢子懸浮液的濃度反映了產(chǎn)孢量大小。由圖3可以看出：HL-1菌株培養(yǎng)的基質(zhì)中D值最大的為菜籽餅，最小的為蛭石。顯著性方面，菜籽餅與其他5種培養(yǎng)基質(zhì)差異顯著(P<0.05)；而麥稈糠、羊糞、麥麩、珍珠巖，它們之間的差異不顯著(P>0.05)，蛭石與其他5種培養(yǎng)基差異也顯著(P<0.05)。由此可知，在供試的6種基質(zhì)中，適合HL-1菌株產(chǎn)孢的是菜籽餅。

不同處理間沒有相同大寫字母或小寫字母表示在0.01水平和0.05水平上差異顯著。The bars without the same uppercase letters and lowercase letters indicated the significant differences at 0.01 and 0.05 level，respectively.圖3 不同培養(yǎng)基質(zhì)下HL-1菌株的孢子懸浮液平均吸光度Fig.3 Average absorbance of spore suspension of HL-1 strain in different culture substrates

2.3 HL-1菌株發(fā)酵最適接種量

HL-1菌株在接種量分別為10%、20%、40%、60%、80%、100%的條件下，平均產(chǎn)孢量分別為2.20×105、3.54×106、3.55×108、2.78×107、1.03×105、5.11×104CFU·mL-1。產(chǎn)孢量最高為3.55×108CFU·mL-1，與之對(duì)應(yīng)的接種量為40%。接種量高于或低于此值都會(huì)引起產(chǎn)孢量急劇下降且菌落生長(zhǎng)變差。故HL-1菌株的最適接種量為40%。

2.4 HL-1菌株培養(yǎng)條件正交優(yōu)化試驗(yàn)

在含水量這個(gè)單因素對(duì)固態(tài)基質(zhì)產(chǎn)孢量影響的試驗(yàn)表明：HL-1的培養(yǎng)基質(zhì)的含水量為50%～80%，菌落生長(zhǎng)旺盛；在培養(yǎng)溫度這個(gè)單因素對(duì)產(chǎn)孢量的影響的試驗(yàn)表明：HL-1菌株的生長(zhǎng)適宜的溫度范圍為20～35 ℃。為下一步的正交試驗(yàn)提供溫度標(biāo)準(zhǔn)；培養(yǎng)時(shí)間范圍：HL-1菌株培養(yǎng)時(shí)間為3～14 d，14 d后生長(zhǎng)基本停止。

選用三角瓶(150 mL)中加入菜籽餅后進(jìn)行正交試驗(yàn)，取培養(yǎng)基含水量，培養(yǎng)溫度以及培養(yǎng)時(shí)間作為考察條件，分別取5水平來優(yōu)化該菌培養(yǎng)條件(表4)。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，當(dāng)二次回歸模型建立后，對(duì)回歸模型做方差分析。

表4 正交優(yōu)化試驗(yàn)方案及結(jié)果

由回歸方程得，3個(gè)因素中系數(shù)最大的為X1(培養(yǎng)基含水量)，X1對(duì)HL-1菌株的Y(產(chǎn)孢量)的值起主要效應(yīng)；系數(shù)最小的X3(培養(yǎng)時(shí)間)對(duì)Y值的影響最?。蝗蛩氐念l率95%分布區(qū)間均在一定范圍內(nèi)服從正態(tài)分布；分析時(shí)可忽略X1X2、X1X3和X2X3的互作效應(yīng)。數(shù)據(jù)處理后，得出植物內(nèi)生真菌HL-1優(yōu)化后的產(chǎn)孢的條件：含水量37%培養(yǎng)基質(zhì)，27.5 ℃黑暗培養(yǎng)溫度，8 d的培養(yǎng)時(shí)間。

3 結(jié)論與討論

不同菌株具有不同的發(fā)酵條件，優(yōu)化出的合適的發(fā)酵條件可以幫助菌株在工業(yè)化生產(chǎn)中降低成本，減少工作量[18]。從青藏高原特殊的環(huán)境中患病的大刺兒菜中分離出的植物內(nèi)生真菌HL-1菌株，前人研究表明：該菌株對(duì)闊葉雜草藜等具有很強(qiáng)的致病性，但對(duì)青稞、油菜等作物安全，具有制成生物除草劑的潛力。本研究選擇單因素法來篩選適宜HL-1菌株生長(zhǎng)的碳氮源、發(fā)酵基質(zhì)并確定了最佳接種量。正交優(yōu)化試驗(yàn)得出各因素組合產(chǎn)孢量最大的組合。獲得了產(chǎn)孢量較大的發(fā)酵條件，為該菌工業(yè)化生產(chǎn)和商品化開發(fā)除草劑奠定基礎(chǔ)。

研究結(jié)果表明：碳氮源、接菌量、培養(yǎng)溫度可以顯著提高HL-1菌株的產(chǎn)孢量。除草活性HL-1菌株最適產(chǎn)孢的碳源為葡萄糖，氮源為酵母浸膏；在待選培養(yǎng)基質(zhì)中菜籽餅最適合該菌株產(chǎn)孢。不同的培養(yǎng)基質(zhì)產(chǎn)孢量有較大的差異，可能是因?yàn)椴煌幕|(zhì)內(nèi)含有的菌株所需求的大量元素及微量元素等不同或者它們的比例不同。有趣的是，在最適碳氮源混合培養(yǎng)基內(nèi)HL-1產(chǎn)孢量達(dá)4.81×109CFU·mL-1，但在PDA培養(yǎng)基內(nèi)產(chǎn)孢量?jī)H為5.79×108CFU·mL-1；前者較后者有了顯著的提升，達(dá)到了10倍的數(shù)量級(jí)，這說明PDA培養(yǎng)基本身并不適合HL-1生長(zhǎng)，加入適合的碳氮源對(duì)于菌株的利用具有意義。有研究表明：合適的接種量不但能增加產(chǎn)孢量，而且也能減少發(fā)酵的周期甚至可以避免雜菌污染。本研究結(jié)果表明，該菌的固態(tài)發(fā)酵的最適的接種量為體積分?jǐn)?shù)40%，低于或者高于這個(gè)值產(chǎn)孢量會(huì)降低很多，這也間接說明了接種量的研究對(duì)該菌株的重要性。另外，正交優(yōu)化試驗(yàn)中以固態(tài)培養(yǎng)基含水量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間作為考察，得出在固態(tài)培養(yǎng)基含水量37%、培養(yǎng)溫度27.5 ℃、發(fā)酵8 d的條件下該菌株產(chǎn)孢量達(dá)到了最大。史毅等[19]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的不同成分碳源、氮源、微量元素等以及發(fā)酵條件溫度、pH值、溶氧量等對(duì)菌株的液體及固體發(fā)酵具有很大的影響，因?yàn)镠L-1菌株的發(fā)酵目的是產(chǎn)孢量且后期可能需要開發(fā)成可濕性粉劑，所以本文主要優(yōu)化了固態(tài)發(fā)酵。本研究中獲得了HL-1菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)孢量最大的條件，旨在為該菌的生物除草劑研究奠定基礎(chǔ)。生防菌的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)要求既要節(jié)約成本，又要符合國(guó)家的可持續(xù)發(fā)展的整體目標(biāo)；故農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的下腳料由于容易得到且價(jià)格較低成為了固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的首選[20]。本研究中，HL-1菌株適合的固態(tài)培養(yǎng)基為菜籽餅，由于價(jià)格便宜等原因更適合HL-1菌株的大批量生產(chǎn)。下一步將篩選適合HL-1菌株孢子儲(chǔ)藏、運(yùn)輸，且具有保護(hù)作用的助劑，為HL-1菌株的劑型的制備提供參考。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1] 程亮，郭青云. 內(nèi)生真菌HL-1的除草活性及對(duì)作物的安全性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，31(5): 1012-1016.

CHENG L，GUO Q Y. Herbicidal activity of fungal endophyte HL-1 against weeds and its safety to crops[J].JiangsuJournalofAgriculturalSciences，2015，31(5): 1012-1016.(in Chinese with English abstract)

[2] 劉冬. 發(fā)酵工程[M]. 2版. 北京: 高等教育出版社，2015: 8.

[3] 盧智琴，李惠霞，羅寧，等. 禾谷孢囊線蟲生防真菌AT9的固體發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 草原與草坪，2020，40(1): 35-40.

LU Z Q，LI H X，LUO N，et al. Optimization of solid fermentation conditions ofAspergillusterreusfor wheat cyst nematode biocontrol[J].GrasslandandTurf，2020，40(1): 35-40.(in Chinese with English abstract)

[4] 石振宇，紀(jì)明山. 蠟蚧輪枝菌VL17菌株固體發(fā)酵培養(yǎng)基篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(4): 129-130.

SHI Z Y，JI M S. Fermentation conditions optimization and selection of solid culture medium ofVerticilliumlecaniistrain VL17[J].JiangsuAgriculturalSciences，2009，37(4): 129-130.(in Chinese with English abstract)

[5] MASMOUDI F，BEN KHEDHER S，KAMOUN A，et al. Combinatorial effect of mutagenesis and medium component optimization onBacillusamyloliquefaciensantifungal activity and efficacy in eradicatingBotrytiscinerea[J].MicrobiologicalResearch，2017，197: 29-38.

[6] 張潔，郭雪萍，夏明聰，等. 粉紅螺旋聚孢霉NF-06固體發(fā)酵條件優(yōu)化及對(duì)南方根結(jié)線蟲的防治效果[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2020，36(1): 105-112.

ZHANG J，GUO X P，XIA M C，et al. Optimization of solid state fermentation conditions ofClonostachysroseaNF-06 and its control efficiency onMeloidogyneincognita[J].ChineseJournalofBiologicalControl，2020，36(1): 105-112.(in Chinese with English abstract)

[7] KAUR M，KUMAR V. Optimizing conditions for growth and sporulation ofAlternariamacrosporaMKP1:a biocontrol agent of Parthenium weed[J].TurkishJournalofWeedScience，2019，22(1) : 17-23.

[8] 朱海霞，馬永強(qiáng)，魏有海，等. 多孢木霉HZ-31菌株發(fā)酵條件研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，26(1): 132-136.

ZHU H X，MA Y Q，WEI Y H，et al. Study on culture conditions ofTrichodermapolysporumHZ-31[J].ActaAgriculturaeBoreali-OccidentalisSinica，2017，26(1): 132-136.(in Chinese with English abstract)

[9] 王學(xué)奎. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M]. 2版. 北京: 高等教育出版社，2006: 169-170.

[10] 孫婷，劉鳳民，許修宏. 小核盤菌生物除草劑固體發(fā)酵研究[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，37(4): 496-499.

SUN T，LIU F M，XU X H. Study on solid fermentation of bioherbicidalSclerotiniaminor[J].JournalofNortheastAgriculturalUniversity，2006，37(4): 496-499.(in Chinese with English abstract)

[11] 許修宏，WATSON A K，TESHLER M P. 發(fā)酵時(shí)間和乙二酸前體對(duì)小核盤菌生物除草劑致病力的影響[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2005，32(4): 421-424.

XU X H，WATSON A K，TESHLER M P. Effects of fermentation duration and precursors of oxalic acid on the virulence of herbicide ofSclerotiniaminor[J].JournalofPlantProtection，2005，32(4): 421-424.(in Chinese with English abstract)

[12] 冀媛媛. SC11放線菌劑的研制及其復(fù)配菌劑對(duì)西瓜枯萎病的控制作用[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué)，2011.

JI Y Y. Production of biocontrol agent SC11 and research on the combination of biocontrol agents[D]. Yangling: Northwest A & F University，2011.(in Chinese with English abstract)

[13] 田曉麗，金雪菲，趙紅杰，等. 高嶺土、殼聚糖和幾丁質(zhì)作為Fo47菌劑填料的研究[J]. 中國(guó)生物防治，2010，26(S1): 73-79.

TIAN X L，JIN X F，ZHAO H J，et al. Use of kaolin，chitosan and chitin as the formulation filler of Fo47 agent[J].ChineseJournalofBiologicalControl，2010，26(S1): 73-79.(in Chinese with English abstract)

[14] 吳洵恥，魏晉云，任平，等. 尖孢鐮刀菌F86-15防治西瓜枯萎病的研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，1991，23(6): 40-41.

WU X C，WEI J Y，REN P，et al. Study onFusariumoxysporumF86-15 to control watermelon wilt[J].ShandongAgriculturalSciences，1991，23(6): 40-41.(in Chinese)

[15] 金水明，張海，虞虓峰. 助劑在農(nóng)藥中的應(yīng)用[J]. 上海農(nóng)業(yè)科技，2008(4): 32-33.

JIN S M，ZHANG H，YU X F. Application of additives in pesticides[J].ShanghaiAgriculturalScienceandTechnology，2008(4): 32-33.(in Chinese)

[16] 錢長(zhǎng)英. 淺談農(nóng)藥可濕性粉劑的配方研制及加工工藝[J]. 安徽化工，2005，31(1): 37-38.

QIAN C Y. Talking about the formulation and processing technology of pesticide wettable powder[J].AnhuiChemicalIndustry，2005，31(1): 37-38.(in Chinese)

[17] 張秋華. 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化單細(xì)胞蛋白飼料的研究[D]. 延吉: 延邊大學(xué)，2010.

ZHANG Q H. Optimization of single cell protein by quadratic orthogonal rotation combination design[D]. Yanji: Yanbian University，2010.(in Chinese with English abstract)

[18] 許潔，周惠茹，馬君千，等. 1株抗腫瘤銀杏內(nèi)生真菌的發(fā)酵條件及活性產(chǎn)物穩(wěn)定性研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(13): 226-229.

XU J，ZHOU H R，MA J Q，et al. Study on fermentation conditions and active product stability of an anti-tumor ginkgoendophyticfungus[J].JiangsuAgriculturalSciences，2017，45(13): 226-229.(in Chinese)

[19] 史毅，陳文彬，張博文，等. 內(nèi)生菌發(fā)酵工藝的研究進(jìn)展[J]. 江西中醫(yī)藥，2018，49(9): 76-80.

SHI Y，CHEN W B，ZHANG B W，et al. Research progress of endophytic fermentation technology[J].JiangxiJournalofTraditionalChineseMedicine，2018，49(9): 76-80.(in Chinese)

[20] 李國(guó)霞，周夏娣，郭友中. 蠟蚧輪枝菌固體發(fā)酵基質(zhì)優(yōu)化組合正交篩選[J]. 植物保護(hù)，2003，29(1): 28-30.

LI G X，ZHOU X D，GUO Y Z. Fermentation of mixed solid substrates ofVerticilliumlecaniiby orthogonal selection[J].PlantProtection，2003，29(1): 28-30.(in Chinese with English abstract)