付滿玲，九紅，袁葉飛

（西南醫(yī)科大學藥學院，四川瀘州 646000）

肝臟是人體最重要的代謝器官，承擔著代謝、氧化、還原等重要的生理功能，肝臟疾病已成為危害人類健康的重要疾病之一[1]。肝損傷是各類肝病共有的一種病理狀態(tài)，化學性肝損傷是臨床中最為常見的肝損傷類型?；瘜W性肝損傷主要包括環(huán)境毒物性肝損傷、酒精性肝損傷和藥物性肝損傷[2]。隨著工業(yè)發(fā)展、環(huán)境污染的加重，飲酒人群的增多以及藥物的濫用，化學性肝損傷發(fā)病率越來越高，嚴重影響人們的生命健康。如何有效的預防和治療化學性肝損傷，阻止其進一步惡性發(fā)展為脂肪肝、肝硬化、肝癌和肝功能衰竭等嚴重肝臟疾病，已成為醫(yī)藥及保健食品領域的研究熱點。

趕黃草（Penthorum chinensePursh.）是虎耳草科扯根菜屬植物扯根菜的干燥地上部分，主產于四川、貴州、湖南等地。趕黃草為藥食同源植物，于2020年6月被國家衛(wèi)健委正式批準為新食品原料。趕黃草性平、味苦、微辛、無毒，歸肝、腎經，具有主治黃疸、經閉、水腫、跌打損傷等癥。趕黃草有上千年的用藥史和食用史，對于肝病治療[3]，具有獨特療效，被譽為“神仙草”[4]。

趕黃草對化學性肝損傷具有保護作用[5-7]，但其功效成分尚未闡明。目前已從趕黃草中分離得到約120個化合物，其中黃酮類化合物大約為40個，黃酮類化合物是趕黃草的主要化學成分[8-10]；趕黃草總黃酮在趕黃草中的含量為3.92%，趕黃草總黃酮是趕黃草的主要活性部位[11]。項目組前期制備了純度超過50%的趕黃草總黃酮（以喬松素計），趕黃草總黃酮主要由異槲皮苷、喬松素、槲皮素、山奈酚和芹菜素組成[11]（圖1），其中喬松素、槲皮素、山奈酚和芹菜素為已報道的保護化學性肝損傷化合物[12-15]。據此我們推測趕黃草總黃酮可能對化學性肝損傷具有保護作用。

圖1 趕黃草總黃酮高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography (HPLC) on total flavonoids of Penthorum chinense Pursh

四氯化碳（CCl4）是公認的復制肝損傷動物模型的化學物質[16]，其優(yōu)點為造模時間短、方便可行、誘導的動物肝毒性特征與人類相似[17]。本試驗建立CCl4誘導的小鼠急性肝損傷模型，分析小鼠肝臟指數、病理切片、血清和肝臟的生化指標，探討趕黃草總黃酮對CCl4誘導的急性肝損傷的保護作用及可能機制，闡明趕黃草總黃酮是趕黃草保護化學性肝損傷的功效成分，為其開發(fā)為輔助保護化學性肝損傷的保健食品提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

趕黃草，采自四川古藺縣，經西南醫(yī)科大學稅丕先教授鑒定為虎耳草科植物扯根菜（Penthorum chinesePursh.）的干燥全草；趕黃草總黃酮（自制，純度為50.34%，批號20200621），以含水乙醇加熱回流提取趕黃草，并利用聚酰胺柱色譜純化而得；聯(lián)苯雙酯滴丸（批號19j200607），萬邦德制藥有限公司；四氯化碳（CCl4，分析純，批號01162305），上海泰坦化學有限公司；95%乙醇（分析純，批號2019022201），成都市科隆化學品有限公司；橄欖油（批號692247659371），四川省青川縣川珍實業(yè)有限公司；4%多聚甲醛（批號70081800），中國Biosharp公司；丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒（批號1219051）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate transaminase，AST）試劑盒（批號0120051）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒（批號0120091）、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）試劑盒（批號0720091），邁克生物股份有限公司；腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，α，TNF-α）試劑盒（批號EK282/3-96）和白介素-6（interleukin-6，IL-6）試劑盒（批號EK206/3-96），聯(lián)科生物；丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒（批號A003-1）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒（批號A001-3），南京建成生物工程研究所；PBS磷酸鹽緩沖液（0.01 M，pH 7.2~7.4，批號ZLI-9062），京中杉金橋生物技術有限公司。

1.1.2 動物

SPF級成年昆明小鼠，雄性，體重（20±2 g），購于西南醫(yī)科大學實驗動物中心[許可證號：SCXK(川)2018-17)]。

1.1.3 主要儀器

EYELA OSB-2200旋轉蒸發(fā)儀，東京理化公司；mini spin離心機，德國eppendorf公司；ME204E/02電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UPH-1-20L超純水系統(tǒng)，四川優(yōu)普超純科技有限公司；7180全自動生化分析儀，日立公司；移液器，艾本德公司；HZ-9201K恒溫搖床，華利達公司；LDZX-40BI高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；TD-5Z離心機，蜀科公司；TECAN酶標儀，瑞士SUNRISE公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、給藥及處理

50只雄性昆明小鼠適應性飼養(yǎng)一周后，按體重隨機分為正常組、模型組、聯(lián)苯雙酯滴丸陽性對照組（150 mg/kg）、趕黃草總黃酮高劑量組（800 mg/kg)和趕黃草總黃酮低劑量組（400 mg/kg)，每組10只。正常組和模型組每日灌胃給藥（ig）等體積蒸餾水（0.2 mL/10 g），其余各組每日ig相應藥物1次，連續(xù)21 d。末次給藥1 h后，除正常組腹腔注射（ip）等體積蒸餾水外，其余各組均ip 1% CCl4橄欖油溶液10 mL/kg。禁食不禁水16 h，小鼠眼球取血，3000 r/min離心10 min，分離得到血清，小鼠脫臼處死后，采集肝臟組織，稱量肝臟重量計算臟器系數，將肝臟組織分為兩部分，一部分肝臟于-80 ℃凍存?zhèn)溆?，另一部分?%多聚甲醛固定。

1.2.2 生化指標檢測

取各組小鼠血清上清液，按照試劑盒說明書進行操作，采用全自動生化儀測定ALT、AST、ALP和LDH水平；同時，各組取一定的肝組織，按1:9的比例進行肝組織勻漿，制備10%肝組織勻漿樣本，取上清液用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）按照試劑盒進行操作，測定TNF-α、IL-6和MDA含量，以及SOD活力。

1.2.3 肝臟組織病理切片觀察

取出固定于4%多聚甲醛的肝臟，進行石蠟包埋并切片，切片厚度約4 μm，采用蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE染色法），光學顯微鏡下觀察肝臟組織病理學改變，比較各組小鼠肝臟組織損傷情況。

1.3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學處理，數據以均數±標準差（x±s）表示，用單因素方差分析（ANOVA）進行差異性檢驗，p<0.05表示有統(tǒng)計學差異。

2 結果與討論

2.1 趕黃草總黃酮對小鼠體重和肝臟系數的影響

正常時，動物肝臟系數比較穩(wěn)定；動物染毒后，肝臟系數會發(fā)生改變。肝臟系數增加，表明肝臟充血、水腫或增生肥大等。由表1可知，模型組的肝臟系數為4.94%，較正常組4.49%上升了10.02%，具有極顯著差異（p<0.01），表明模型組小鼠有明顯的肝充血和腫脹情況，與肉眼觀察基本一致；趕黃草總黃酮高劑量組和低劑量組的肝臟系數分別為4.31%和4.50%，較模型組4.94%分別下降12.75%和8.91%，且均具有顯著差異（p<0.05），表明趕黃草總黃酮對四氯化碳所致小鼠肝充血和肝腫脹具有明顯改善作用。

表1 趕黃草總黃酮對小鼠肝臟系數的影響Table 1 Effects of total flavonoids of Penthorum chinense Pursh on liver coefficient in mice (x±s, n=10)

2.2 趕黃草總黃酮對小鼠血清肝功能指標ALT、AST、ALP、LDH水平的影響

AST和ALT是檢測肝功能最敏感的指標，其活性的高低反映了肝臟受損的程度[18]。正常狀態(tài)時，AST與ALT存在于肝細胞漿；肝細胞受到損傷時，二者則會從肝臟滲漏到血液中，導致AST與ALT在血清中的濃度急劇上升。ALP、LDH也常用于肝臟疾病的診斷，當肝細胞發(fā)生損傷時值會升高，其可在一定范圍內可反映生物體內肝細胞損傷程度。由表2可知，正常組小鼠血清ALT、AST、ALP和LDH分別為41.91、134.58、138.00和1078.00 IU/L，而模型組小鼠血清ALT、AST、ALP和LDH水平均顯著升高，分別為330.89、1871.50、173.00和34931.00 IU/L，均具有統(tǒng)計學差異（p<0.05，p<0.01），表明CCl4對小鼠造成了急性肝損傷，造模成功；趕黃草總黃酮高劑量組的ALT、AST、ALP和LDH較模型組分別顯著降低了86.01%（p<0.01）、91.03%（p<0.01）、25.50%（p<0.05）和95.54%（p<0.01），趕黃草總黃酮低劑量組的ALT、AST和LDH活性分別較模型組顯著降低了76.06%（p<0.01）、84.91%（p<0.01）、93.87%（p<0.01）；趕黃草總黃酮高、低劑量組LDH分別為1556.90和2142.00 IU/L，較陽性藥聯(lián)苯雙酯組23437.45 IU/L分別降低93.36%和90.86%，均具有極顯著性（p<0.01）。上述表明趕黃草總黃酮對CCl4引起的小鼠血清ALT、AST、ALP和LDH升高具有拮抗作用，并且在拮抗ALP和LDH方面本試驗發(fā)現(xiàn)趕黃草總黃酮（800，400 mg/kg）優(yōu)于陽性藥聯(lián)苯雙酯滴丸（150 mg/kg），表明趕黃草總黃酮對CCl4引起的化學性肝損傷具有很好的保護作用。

表2 趕黃草總黃酮對小鼠血清ALT、AST、LDH、LDH水平的影響Table 2 The effect of total flavonoids of Penthorum chinense Pursh on serum ALT, AST, LDH and LDH levels in mice (x±s, n=10)

2.3 趕黃草總黃酮對小鼠肝組織中炎癥因子TNF-α、IL-6水平的影響

腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-6（IL-6）等炎癥因子的釋放和浸潤，會促使細胞凋亡壞死，引發(fā)炎癥反應而導致肝損傷甚至肝纖維化[19,20]。由表3可知，模型組的TNF-α和IL-6水平分別為339.19和279.49 pg/mL，正常組分別為201.77和205.37 pg/mL，模型組較正常組均顯著升高（p<0.01）；趕黃草總黃酮高劑量組的TNF-α為254.75 pg/mL，與模型組比較顯著降低了24.89%（p<0.05）；趕黃草總黃酮高劑量組、低劑量組的IL-6活性分別為221.05和227.50 pg/mL，與模型組相比分別降低20.91%和18.60%，均具有顯著性差異（p<0.05），表明趕黃草總黃酮可通過抑制TNF-α和IL-6活性而對CCl4引起的小鼠急性肝損傷具有保護作用。

表3 趕黃草總黃酮對小鼠肝組織中TNF-α、IL-6水平的情況Table 3 The effect of total flavonoids of Penthorum chinense Pursh on the levels of TNF- and IL-6 in the liver of mice (x±s,n=10)

2.4 趕黃草總黃酮對小鼠肝組織中氧化應激指標SOD和MDA水平的影響

在CCl4刺激肝臟導致急性肝損傷過程中，機體內的氧化和抗氧化過程失衡從而激活氧化應激過程，產生的大量氧化中間產物誘導一系列的炎癥反應，加劇疾病進展。當CCl4進入肝臟后產生大量的氧自由基，與細胞膜上的磷脂結合后會生成脂質過氧化物，最終形成丙二醛（MDA）引起細胞進一步損傷。超氧化物歧化酶（SOD）是機體內重要的抗氧化酶，能清除CCl4生成的自由基，減少過氧化物對肝細胞的侵襲損害[21]。MDA作為脂質過氧化終產物，是反映組織損傷時出現(xiàn)過強氧化作用的指標之一，其活性越高，表明氧化活性越強，組織受損程度越大[18]。由表4可知，模型組小鼠肝組織中的SOD活力為122.78 U/mg，正常組為203.66 U/mg，模型組顯著低于正常組（p<0.01）；模型組的MDA含量為181.48 U/mg，正常組為85.65 U/mg，模型組顯著高于正常組（p<0.01），表明CCl4造模成功，也說明CCl4損傷肝臟后，機體內氧化和抗氧化失衡，清除自由基能力明顯降低，導致SOD活性下降和脂質過氧化產物MDA增加。趕黃草總黃酮高、低劑量組小鼠肝臟組織SOD活力分別為181.99和174.63 U/mg，與模型組比較分別升高了48.22%和42.23%，均具有極顯著性差異（p<0.01）；趕黃草總黃酮高、低劑量組小鼠肝臟組織 MDA含量分別為109.88和134.98 U/mg，與模型組比較分別降低了39.45%和25.62%，具有極顯著或顯著性差異（p<0.01，p<0.05），表明趕黃草總黃酮可能通過上調SOD活性，降低MDA含量來緩解氧化應激，從而改善CCl4誘導的小鼠肝損傷。

表4 趕黃草總黃酮對小鼠肝組織中SOD、MDA活性的影響Table 4 The effect of total flavonoids of Penthorum chinense Pursh on SOD and MDA activities in the liver of mice (x±s,n=10)

2.5 趕黃草總黃酮對小鼠肝組織病理變化的影響

2.5.1 大體肉眼觀察

正常組小鼠肝臟外觀呈紅褐色，質軟富有彈性；模型組小鼠肝臟顏色偏白，體積明顯增大，有腫脹感；聯(lián)苯雙酯滴丸組、趕黃草總黃酮高劑量組、趕黃草總黃酮低劑量組肝臟狀態(tài)有所改善，接近正常組。

2.5.2 肝臟組織HE染色光鏡觀察

肝臟病理學檢查被認為是判斷肝臟損傷的金標準[22]，小鼠肝組織病理檢測結果如圖2所示。正常組小鼠肝小葉結構完整清晰，以中央靜脈為中心呈放射狀排布，肝細胞索排列整齊，肝細胞形態(tài)正常，無細胞壞死等病變，與王凱[23]等報道基本一致；模型組小鼠肝小葉結構模糊，肝細胞索排列紊亂，肝細胞正常結構消失出現(xiàn)片狀壞死（1號箭頭），有炎性細胞浸潤小灶（2號箭頭），殘留的細胞胞體腫脹，出現(xiàn)空泡變性（藍色箭頭），胞質疏松淡然，表明CCl4引起了小鼠肝組織損傷，造模成功，與翟紅月[24]等報道基本一致；聯(lián)苯雙酯組肝小葉結構尚模糊，肝細胞索排列紊亂，較多肝細胞胞質中有微小的空泡（3號箭頭），細胞狀態(tài)較模型組有所改善；趕黃草總黃酮高劑量組肝細胞索排列整齊，無炎性細胞，有少量空泡細胞（藍色箭頭），肝小葉結構和細胞形態(tài)基本正常較模型組改善狀態(tài)較好；趕黃草總黃酮低劑量組肝細胞索排列尚整齊，肝小葉結構清晰，無炎性細胞，胞體略腫脹，有少量空泡細胞（藍色箭頭），較模型組有所改善，表明趕黃草總黃酮具有改善CCl4對肝臟的病理損傷。

圖2 CCl4對小鼠肝組織病理變化的影響（HE染色，×200）Fig.2 Effects of CCl4 on pathological changes of liver tissues in mice

3 結論

趕黃草對化學性肝損傷具有保護作用，但其功效成分尚未闡明。項目組前期制備了純度超過50%的趕黃草總黃酮，趕黃草總黃酮作為中藥活性部位，具有功效成分富集、功效作用強的特點。本研究我們發(fā)現(xiàn)趕黃草總黃酮能有效降低CCl4所致肝損傷小鼠體內肝臟系數、血清肝功能相關指標酶（ALT、AST、ALP、LDH）和肝組織炎性因子（TNF-α、IL-6）水平，趕黃草總黃酮（800，400 mg/kg）在拮抗ALP和LDH方面優(yōu)于陽性藥聯(lián)苯雙酯滴丸（150 mg/kg）；趕黃草總黃酮能有效提高CCl4所致肝損傷小鼠肝臟中抗氧化物酶SOD活性，降低脂質過氧化物MDA含量，改善肝損傷病理狀態(tài)。上述表明趕黃草總黃酮對四氯化碳所致急性化學性肝損傷具有較好的保護作用，作用機制可能與其抑制氧化應激反應及炎癥反應有關。本試驗闡明了趕黃草總黃酮是趕黃草保護化學性肝損傷的功效成分，為把趕黃草總黃酮開發(fā)為輔助保護化學性肝損傷的保健食品提供了依據。