周 倩，王嘉福*，冉雪琴，牛 熙，黃世會

1.貴州大學生命科學學院，貴州貴陽 550025；2.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽 550025

大腸桿菌存在于人和動物腸道中[1]，某些大腸桿菌是導致仔豬腹瀉的主要病原菌之一[2]，其導致的疾病發(fā)病率高、發(fā)病急、死亡率高、涉及范圍廣，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，嚴重影響了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[3]。然而由該菌引發(fā)的疾病目前缺少有效的治療手段，臨床上主要以母體抗原、抗血清、抗生素等為主，容易產(chǎn)生耐藥性、藥物殘留等問題[4-5]。

大腸桿菌通過黏附素黏附于斷奶仔豬小腸上皮細胞，就定居在小腸上并開始大量繁殖并產(chǎn)生毒素，產(chǎn)生的毒素被吸收后，引起胃腸道血管、皮下組織和腦血管的損傷，從而使宿主發(fā)生一系列疾病[6]。致病性大腸桿菌侵襲宿主組織引起其發(fā)病的過程是由多種毒力因子相互協(xié)調(diào)而發(fā)揮作用，大腸桿菌的主要毒力因子包括毒素、黏附素、外膜蛋白、鐵轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和吸收系統(tǒng)等[7]。為研究致病性大腸桿菌致病力差異的原因，采用二代高通量測序技術(shù)對7株不同致病力的大腸桿菌進行全基因組測序，分析毒力基因的差異，以期解析大腸桿菌的致病因子和致病機制。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株P(guān)211、P555、P32、P444和P111由本實驗室從貴州某豬場腹瀉仔豬糞樣中分離，菌株S10670、E24190購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。40只SPF級小鼠購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。

1.2 菌株純化鑒定

使用EMB、MAC和LB固體培養(yǎng)基對7菌株進行純化，隨后對菌株進行革蘭氏染色鏡檢和生理生化鑒定，再用細菌16S rDNA基因通用引物27F和1 492R進行擴增(表1)，擴增產(chǎn)物進行Sanger測序，用NCBI網(wǎng)站對測序產(chǎn)物進行Blast同源比對，對菌株進行分子系統(tǒng)學鑒定。

表1 細菌16S rDNA擴增引物

1.3 小鼠致病性試驗

挑取單個純化后的7株菌株于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至濃度為1×108CFU/mL的菌懸液，將40只小鼠隨機分為8組，7個實驗組和一個對照組，每組5只小鼠，實驗組小鼠的給藥途徑、給藥方法和給藥劑量參照《藥理實驗方法學》的動物實驗技術(shù)進行[8]，按照10 g/0.2 mL 的劑量腹腔注射菌懸液，對照組則按照10 g/0.2 mL 的劑量腹腔注射生理鹽水。正常飼喂，自由飲水，感染后觀察48 h，記錄小鼠臨床癥狀和死亡時間，死亡小鼠及時剖檢觀察內(nèi)臟組織病變并制作病理切片，觀察病理變化。

1.4 測序樣品

挑取單個純化鑒定后的菌株用LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)于37 ℃、160 r/min培養(yǎng)過夜后收集菌體，使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組，經(jīng)酶標儀及1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度、純度均達到基因組DNA 的測序要求后進行全基因組測序。測序工作由華大深圳股份有限公司完成，測序平臺為DNBSEQ。

1.5 基因文庫構(gòu)建

將基因組DNA的大片段隨機打斷獲得200 bp～400 bp的DNA片段，然后修復雙鏈DNA末端，并在3'末端加上A堿基，配制接頭連接反應(yīng)體系使接頭與DNA連接，擴增連接產(chǎn)物并純化回收，將PCR產(chǎn)物變?yōu)閱捂満?，配制環(huán)化反應(yīng)體系，得到單鏈環(huán)形產(chǎn)物，消化掉未被環(huán)化的線性DNA分子后，即得到最終的文庫。

1.6 全基因組測序與基因組組裝

檢測合格文庫安排上機測序(DNBSEQ)：單鏈環(huán)狀DNA分子通過滾環(huán)復制，形成一個包含300多個拷貝的DNA納米球(DNB)。將得到的DNBs采用高密度DNA納米芯片技術(shù)，加到芯片上的網(wǎng)狀小孔內(nèi)。通過聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)(cPAS)進行測序。得到測序原始數(shù)據(jù)后，對raw reads過濾質(zhì)控，去除低質(zhì)量reads以及adapter和duplication污染后，從而得到高質(zhì)量Clean Reads后，采用SOAPdenovo[9]組裝軟件進行序列組裝,通過不斷優(yōu)化參數(shù)Kmer值為15獲得最好的組裝結(jié)果。

1.7 基因預(yù)測及注釋

采用Glimmer 3.02[10]進行組裝結(jié)果的基因預(yù)測，分別采用RNAmmer-1.2[11]和tRNAscan-SE[12]軟件對基因組中包含的rRNA和tRNA進行預(yù)測。將預(yù)測基因的氨基酸序列與eggNOG(http://eggnog-mapper.embl.de/)[13]數(shù)據(jù)庫和VFDB(https://card.mcmaster.ca)[14]數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，將得到的基因進行功能注釋，獲得COG注釋信息和菌株毒力基因，并對COG注釋結(jié)果進行統(tǒng)計和分類,通過VFBD數(shù)據(jù)庫注釋到的毒力因子，分析不同致病力菌株的毒力基因差異。

2 結(jié)果

2.1 菌株的鑒定

2.1.1菌落形態(tài)特征

7株菌株在MAC瓊脂平板上形成圓形、表面光滑、濕潤的粉紅色菌落(圖1A)；在EMB瓊脂培養(yǎng)基上形成表面光滑、凸起、帶黑色金屬光澤的菌落(圖1B)；在LB固體培養(yǎng)基上形成圓形、表面光滑、半透明的乳白色菌落(圖1C)；革蘭氏染色，鏡檢可見紅色短桿菌、中等大小、兩頭鈍圓、呈單個或多數(shù)散在排列(圖1D)，鑒定結(jié)果均與大腸桿菌形態(tài)特征相符。

A

2.1.2生理生化鑒定

7株菌株均能發(fā)酵葡萄糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖，尿素、蛋白胨水、乙酰甲基甲醇(V-P)、Koser肉湯、氧化酶、硫化氫試驗陰性，甲基紅試驗(MR)陽性，具有動力，結(jié)果顯示該7株菌與大腸桿菌具有相似的生理生化特性(表2)。

表2 7株菌株生理生化鑒定結(jié)果

2.1.3分子生物學鑒定

菌株16S rDNA基因經(jīng)PCR擴增獲得1 500 bp的片段，與預(yù)期相符(圖2)，將16S r DNA基因序列與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫比對，7株菌株與已知大腸桿菌的相似性最高，均在99.5%以上，將7株菌株鑒定為大腸桿菌。

注：M：D 2 000 DNA marker ;1.S40670;2.E24190;3.P211;4.P555;5.P32;6.P444;7.P111圖2 16S rDNA基因擴增結(jié)果

2.2 小鼠致病性試驗

7株菌株用相同濃度(1×108CFU/mL)的菌懸液對小鼠進行感染試驗，結(jié)果顯示(表3)，48 h后S10670和E24190實驗組小鼠死亡5只，病死率為100%，P211和P555實驗組小鼠死亡2只，病死率為40%，P32、P444和P111試驗組小鼠死亡1只，病死率為20%，對照組小鼠全部存活。因此，將菌株S10670和E24190歸為強毒株，P211和P555定為中等毒株，P32、P444和P32為弱毒株。感染后的小鼠出現(xiàn)背毛聳亂無光澤，進食少，活動緩慢，精神萎靡不活躍，倦怠、嗜睡，并且扎堆出現(xiàn)，對外界刺激遲鈍，其中S10670和E24190組臨床現(xiàn)象最嚴重，重度腹瀉，接種菌株S10670的小鼠還有眼角包裹著眼屎，眼部出現(xiàn)水腫現(xiàn)象；P211和P555臨床現(xiàn)象次之，P32、P444和P111臨床現(xiàn)象最弱。

表3 小鼠致病性試驗結(jié)果

2.3 剖檢和組織病理學觀察

對死亡小鼠進行剖解后(圖3)觀察小組內(nèi)臟組織，與對照組相比實驗組小鼠內(nèi)臟組織出現(xiàn)不同程度的病變，表現(xiàn)為心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟腫大充血，顏色變深；腸道變薄，內(nèi)有大量內(nèi)容物，且味道惡臭。病理切片顯示(圖4)，實驗組小鼠心臟組織心肌纖維紊亂、排列不整齊，部分出現(xiàn)斷裂崩解伴有出血；肝臟組織出現(xiàn)充血，細胞腫大，局部呈紅色塊狀，組織界限模糊；脾臟組織出現(xiàn)充血；肺臟組織部分輪廓不清晰，出血，肺泡腔內(nèi)有紅細胞，肺泡壁增厚；腎臟組織出現(xiàn)充血，腎小球結(jié)構(gòu)不明顯；腸上皮細胞受損、腫大，腸黏膜壞死，腸絨毛脫落。其中組織病變和病理現(xiàn)象強毒株病變最嚴重，中等毒株次之，弱毒株最不明顯。

心

圖4 組織切片圖

2.4 基因組組裝

對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估和組裝，由結(jié)果可得菌株S10670、E24190、P211、P555、P32、P444和P111組裝后得基因組大小依次為5.3 Mb、5.1 Mb、4.7 Mb、4.8 Mb、4.9 Mb、4.8 Mb和4.6 Mb，GC含量均在50%左右，基因組大小和GC含量均在大腸桿菌基因組大小和GC含量的正常范圍，其它詳細信息見表4，組裝結(jié)果可知菌株S10670的基因組最大。

表4 基因組組裝結(jié)果

2.5 基因預(yù)測

對組裝好的序列進行基因組成分析，菌株S10670、E24190、P211、P555、P32、P444和P111采用Glimmer軟件預(yù)測基因數(shù)量分別為5 124、4 936、4 563、4 601、4 762、4 724和4 376，用rRNAmmer1.2軟件預(yù)測出的rRNA數(shù)量依次為9個、9個、5個、5個、3個、3個和7個，tRNAscan軟件預(yù)測出的tRNA數(shù)量依次為85個、74個、75個、66個、77個、70個和74個，基因、rRNA、tRNA數(shù)量和GC含量均符合大腸桿菌基因組的基本特征(表5)。

表5 基因預(yù)測結(jié)果統(tǒng)計

2.6 COG功能注釋

本研究7株菌株基因的COG分類得到22類，菌株S10670、E24190、P211、P555、P32、P444和P111注釋到的功能基因數(shù)量分別為3 482個、3 483個、3 274個、3 286個、3 342個、3 341個和3 183個。由圖5可知，注釋到的與代謝相關(guān)基因的數(shù)量最多。

圖5 COG注釋分類統(tǒng)計

2.7 VFDB注釋

通過與毒力因子數(shù)據(jù)庫(VFDB)比對，菌株S10670、E24190、P211、P555、P32、P444和P111注釋到的毒力基因數(shù)量分別為126、61、52、55、47、44、38個，其中分泌系統(tǒng)和黏附與侵襲毒力基因最多。由表6可知，強毒株S10670的基因組中含有志賀毒素基因(Stx)，溶血素基因(hlyA,hlyB,hlyC,hlyD,hlyE/clyA)，黏附相關(guān)的毒力基因有外膜蛋白黏附素基因(paa)、緊密黏附素基因eae、緊密黏附素易位受體蛋白基因Tir、toxB，血紅素吸收相關(guān)基因(chuA,chuT,chuW,chuX,chuY)，大量III型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因如NLE系列基因(nleA,nleB1,nleB2-1,nleC,nleE-1,nleF,nleG-1,nleG2-3,nleG7,nleH1-1,nleH1-2)、Esp系列基因(espB,espF,espG,map,tir,espJ,espL1,espL2,espL4,espM1,espR1,espR3,espR4,espW,espX1～espX6,espY1～espY5)、Esc系列基因(escC,escD,escF,escJ,escL,escN,escO,escR,escS,escT,escU,escV)和VI型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因(aec15～aec19,aec22～aec32)；強毒株E24190基因組中含有腸毒素基因(LT)、溶血素基因(hlyA)和CFA/I菌毛相關(guān)基因(cfaA,cfaB,cfaC,cfaD/cfaE)；中等毒株P(guān)211基因組中含有CFA/I菌毛相關(guān)基因(cfaA,cfaB,cfaC,cfaD/cfaE)、P菌毛相關(guān)基因(papA,papC,papD,papH)和鐵轉(zhuǎn)運系統(tǒng)吸收系統(tǒng)相關(guān)基因(sitA,sitB,sitC,sitD)；中等毒株P(guān)555基因組中含有12個VI分泌系統(tǒng)相關(guān)基因(aec15～aec19,aec22～aec32)；弱毒株P(guān)32、P444和111基因組中含有的毒力基因也存在于菌株S10670、E24190、P211和P555中，如黏附相關(guān)毒力因子大腸桿菌普通菌毛(ECP)、大腸桿菌層粘連蛋白結(jié)合蛋白菌毛(ELF)、出血性大腸桿菌菌毛(HCP)和I型菌毛(Fim)，侵襲素相關(guān)毒力因子(ibeB,ibeC)，鐵轉(zhuǎn)運系統(tǒng)相關(guān)毒力基因(entA,entB,entC,entE,entS,hitC)分泌系統(tǒng)相關(guān)毒力基因(espL1,espL4,espR1,espX1,espX4,espX5,aec15)和溶血素基因(hlyE/clyA)。

表6 毒力因子統(tǒng)計

3 討論與結(jié)論

大腸桿菌的致病性是由多種毒力因子互相協(xié)作產(chǎn)生。志賀樣毒素(Stx)是一種志賀毒素,具有細胞毒性、腸毒性、神經(jīng)毒性作用，是毒性最強的細菌毒素之一，包括Stx1和Stx2兩種亞型，Stx2較Stx1的毒力更強，Stx2的變異體Stx2e是導致仔豬發(fā)生水腫病的重要毒素[15]。緊密黏附素eae能使細菌緊密黏附到腸上皮細胞，eae與緊密黏附素易位受體蛋白Tir結(jié)合引起進一步的信號傳導，細胞內(nèi)鈣離子濃度驟增，腸內(nèi)液體分泌增加，引起特征性的粘附脫落病變(attaching and effacing,A/E)[16,17]。Chu系列基因編碼的蛋白與血紅素的吸收有關(guān)，血紅素是宿主體內(nèi)最豐富的鐵離子資源，主要由chuA基因從細胞外或者宿主的血紅素中攝取鐵和血紅蛋白中的鐵元素[18]。溶血素(Hemolysin)基因(hlyA,hlyB,hlyC,hlyD,hlyE/clyA)孔道形成蛋白家族的成員，溶血素可溶解哺乳動物紅細胞，在靶細胞膜上形成孔道繼而殺死靶細胞[19]。Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)因子( Non-LEE encoded effactor ，Nle ) NleH和NleD具有抗凋亡活性，NleH能夠促進細胞的生存，抑制腸細胞的丟失，從而維持大腸桿菌的定值[20]。在感染期過程中，大腸桿菌表面分子能夠誘導外源性的細胞凋亡，Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)因子如EspF，Map能夠誘導內(nèi)源性的凋亡途徑[21]。EspF能夠誘導線粒體的溶解﹑破壞細胞緊密聯(lián)接結(jié)構(gòu)和促進抗凋亡蛋白的降解[22]。Map能夠破壞細胞之間的緊密聯(lián)結(jié)，誘導線粒體功能失活[23]。毒力因子Stx、eae、Tir、Chu、hlyB、hlyC、hlyD和III型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因Nle、EspF 、Map在本研究中僅存在于強毒株S10670中，hlyA存在于強毒株S10670和E24190中。熱敏腸毒素(LT)為一種免疫蛋白，與霍亂腸毒素(CT)有著密切關(guān)系，組成一個毒素家族，LT是產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的主要致病因子之一，可引起水樣腹瀉[24]。LT在本研究中僅存在于強毒株E24190中。

VI型分泌系統(tǒng)(T6SS)是一種新型的分泌系統(tǒng)，普遍存在于革蘭氏陰性菌中，最早是在霍亂弧菌中發(fā)現(xiàn)的，T6SS參與細菌生物膜的形成，并介導細菌與宿主之間的粘附和毒性作用[25]，本研究檢測到的VI分泌系統(tǒng)是ACE T6SS相關(guān)毒力因子。ACE T6SS僅存在于強毒株S10670和中等毒株P(guān)555中。CFA/I是一種優(yōu)勢血清型定居因子，整個CFA/I定居因子由4個基因 (cfaA,cfaB,cfaC,cfaD/E) 編碼[26,27]，編碼的相應(yīng)多肽稱為cfaA,cfaB,cfaC,cfaD/E，成熟定居因子由cfaB和cfaE組成，cfaB是主要結(jié)構(gòu)亞單位，cfaE位于定居因子頂端,二者均能介導CFA/I對人小腸上皮細胞相應(yīng)受體的結(jié)合，致病性大腸桿菌通過其菌體表面的宿主特異性定居因子CFA/I介導粘附于小腸黏膜上皮細胞[28]，大量增殖,釋放腸毒素，引起仔豬腹瀉，CFA/I在本研究中存在于強毒株E24190和中等毒株P(guān)211中。

P型菌毛多分布于尿道致病性大腸桿菌(UPEC)的黏附素，能介導大腸桿菌粘附于上尿道，P型菌毛是UPEC導致腎盂腎炎的主要毒力因子，已知的編碼P菌毛操縱子的基因有papA、papB、papC、papD、papE、papF、papG、papH和papI，其中 PapA 蛋白是 P 菌毛的主要成分[29]。鐵/錳轉(zhuǎn)運蛋白(Iron/manganese transport)是鐵攝取轉(zhuǎn)運系統(tǒng)毒力因子，由sitA、sitB、sitC和sitD四個基因編碼組成，該系統(tǒng)中的sitB是ATP結(jié)合蛋白，所以該系統(tǒng)相當于是ATP離子泵，可以提供細菌轉(zhuǎn)運過程所需的能量，外膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)還可以將二價鐵載入細胞內(nèi)，參與營養(yǎng)物質(zhì)的攝取、細菌毒素的分泌以及將抗生素泵出細胞使細菌具有抗藥性[30]。P菌毛和鐵/錳轉(zhuǎn)運蛋白本研究中僅存在于中等毒株P(guān)211中。

綜上所述，本研究通過細菌感染小鼠鑒別7株菌株的致病力，采用二代測序技術(shù)測定7株致病性大腸桿菌的基因組序列，經(jīng)組裝，得到致病力相關(guān)的毒力基因，研究結(jié)果為大腸桿菌分子致病機制奠定理論基礎(chǔ)。