高迎新，應(yīng)沖濤，崔 迪，梅傳忠,3

腎癌(renal cell carcinoma,RCC)是我國常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率及死亡率呈現(xiàn)逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]。RCC的發(fā)生是多因素、多基因參與的復(fù)雜過程。微小RNA(micro-RNA,miRNA)是生物體內(nèi)高度保守的單鏈RNA分子，在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲等多種生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[2]。miR-143是miRNA家族的重要成員，研究[3]發(fā)現(xiàn)，miR-143在RCC細(xì)胞中表達(dá)異常，其可能參與了RCC發(fā)生、發(fā)展過程。RCC的治療以手術(shù)切除為主，但術(shù)后效果不理想，因此，尋找有效的靶向藥物是近年來RCC治療研究的熱點(diǎn)。舒尼替尼作為RCC治療的一線藥物，可以阻斷腫瘤的營養(yǎng)供給并直接攻擊腫瘤細(xì)胞，臨床作用明顯[4]。已有證據(jù)[5]表明，舒尼替尼與腫瘤細(xì)胞中miR-143的表達(dá)相關(guān)。本研究將786-O細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-143序列及用舒尼替尼處理后，觀察細(xì)胞增殖、侵襲能力的改變，并檢測(cè)舒尼替尼作用細(xì)胞后miR-143的表達(dá)變化，探討miR-143在RCC細(xì)胞中的作用,舒尼替尼對(duì)miR-143表達(dá)的影響及與細(xì)胞增殖、侵襲的關(guān)系，以期為RCC的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人RCC786-O細(xì)胞株購自中科院細(xì)胞研究所，舒尼替尼購自上海麥克林公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶及Transwell小室購自美國Corning公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司，總小RNA試劑盒、PCR試劑盒購自北京全式金公司，兔抗人單克隆抗體DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B(DNMT3B)、兔抗人單克隆抗體p-Akt-S473、兔抗人單克隆抗體tubulin購自上海優(yōu)寧維公司，miR-143及miR-NC慢病毒載體由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成，miR-143引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、miR-143組、舒尼替尼組、共同作用組。對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列，miR-143組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-143序列，舒尼替尼組細(xì)胞用舒尼替尼處理48 h，共同作用組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-143序列并用舒尼替尼處理48 h。

1.3 構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期786-O細(xì)胞，5×104/孔接種24孔板，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中過夜。次日移去培養(yǎng)液，向孔中加入含5 μg/mL聚凝胺的1640完全培養(yǎng)液480 μL，分別將miR-143、miR-NC慢病毒顆粒懸液20 μL加至對(duì)應(yīng)孔中，混勻并孵育過夜。次日棄上清液，每孔加入0.5 mL 1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育細(xì)胞過夜。然后將細(xì)胞傳至六孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入足夠劑量的嘌呤霉素，篩選陽性克隆。qRT-PCR檢測(cè)miR-143表達(dá)量。

1.4 檢測(cè)舒尼替尼IC50值 將786-O細(xì)胞種至96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)5×103，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日加入不同濃度的舒尼替尼(2、4、6、8、10、12 μmol/L)，每個(gè)濃度值設(shè)5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，于培養(yǎng)箱中孵育4 h后吸棄液體，每孔加入200 μL DMSO，避光低速振蕩10 min后酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度值。根據(jù)所測(cè)的吸光度值計(jì)算舒尼替尼作用于786-O細(xì)胞48 h的IC50值，并選取該值作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用藥濃度。

1.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)照組和miR-143組細(xì)胞，消化離心后將細(xì)胞種至96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)5×103，37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育過夜。次日向相應(yīng)組中加入藥物舒尼替尼，每組細(xì)胞均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，其余操作與步驟1.4相同。

1.6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲 取各組細(xì)胞，消化離心后，用無血清1640培養(yǎng)基稀釋至2.5×105/mL，每個(gè)小室加入200 μL細(xì)胞懸液，24孔板中加入800 μL含20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育24 h后取出小室，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色30 min，水洗，風(fēng)干后，顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野拍照(200倍)。

1.7 qRT-PCR檢測(cè)miR-143表達(dá) 用總小RNA試劑盒提取對(duì)照組、miR-143組、舒尼替尼組RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，再用PCR試劑盒進(jìn)行PCR操作。miR-143引物序列：上游5′- CGC GTG AGA TGA AGC ACT G-3′；下游5′-AGT GCA GGG TCC GAG GTA TT-3′。GAPDH引物序列：上游5′-CAA TGA CCC CTT CAT TGA CC-3′；下游5′-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃ 15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。每組樣品均設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔。以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算各組細(xì)胞中miR-143表達(dá)量。

1.8 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，用RIPA蛋白裂解液提取蛋白，將適量蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入兔抗人DNMT3B、兔抗人p-Akt-S473和兔抗人tubulin一抗，4 ℃搖床孵育過夜后TBST洗3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫?fù)u床上孵育2 h后TBST洗3次，加入ECL顯色液后于暗室曝光，經(jīng)顯影定影后，將底片掃描并分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建miR-143穩(wěn)轉(zhuǎn)RCC786-O細(xì)胞株 786-O細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-143慢病毒顆粒懸液48 h后，與顯微鏡明場(chǎng)下觀察相比，熒光下可見幾乎全部細(xì)胞內(nèi)均有熒光分布(見圖1)；qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-143轉(zhuǎn)染組細(xì)胞miR-143表達(dá)量增高(P<0.01)，與對(duì)照組比較，舒尼替尼處理786-O細(xì)胞48 h后，miR-143表達(dá)量亦升高(見表1)。786-O細(xì)胞經(jīng)舒尼替尼處理48 h后，增殖明顯受抑制，呈現(xiàn)劑量依賴性。舒尼替尼作用于786-O細(xì)胞48 h的IC50值為6 μmol/L，選取該值作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用藥濃度。

表1 qRT-PCR檢測(cè)miR-143表達(dá)量

2.2 不同組細(xì)胞存活、侵襲、DNMT3B蛋白、p-AktS473蛋白表達(dá)比較 miR-143組和舒尼替尼組細(xì)胞存活率、細(xì)胞侵襲數(shù)、DNMT3B和p-AktS473蛋白表達(dá)量均低于對(duì)照組，且高于共同作用組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～P<0.01)(見圖2～3、表2)。

表2 不同組細(xì)胞存活、侵襲、DNMT3B蛋白、p-AktS473蛋白表達(dá)比較

3 討論

RCC具有發(fā)現(xiàn)晚、進(jìn)展快、異質(zhì)性大、預(yù)后差等特點(diǎn)，需要對(duì)其進(jìn)行綜合治療，化療是重要方法之一。舒尼替尼作為一種受體酪氨酸激酶抑制劑，可以作用于人體內(nèi)多個(gè)靶點(diǎn)抑制多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在RCC的治療中起重要作用[6]。

miRNA是近年來腫瘤研究的熱點(diǎn)，舒尼替尼抑制腫瘤細(xì)胞活性的過程常常伴隨miRNA表達(dá)情況的改變，這些改變的miRNA分子與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[7]。miR-143位于人類第5號(hào)染色體，其在RCC、肺癌、宮頸癌等多種腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)，可以通過與多個(gè)靶基因相互作用，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)[8]。為了研究miR-143對(duì)786-O細(xì)胞增殖與侵襲的影響，本研究利用慢病毒介導(dǎo)miR-143過表達(dá)轉(zhuǎn)染RCC 786-O細(xì)胞，qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-143轉(zhuǎn)染組細(xì)胞miR-143表達(dá)量明顯增高(P<0.01)，說明成功將miR-143穩(wěn)轉(zhuǎn)入細(xì)胞。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-143組細(xì)胞增殖與侵襲能力降低，提示miR-143可能參與了786-O細(xì)胞增殖與侵襲的過程，并在該過程中發(fā)揮重要作用。本研究還表明，靶向藥物舒尼替尼作用786-O細(xì)胞48 h后能明顯降低細(xì)胞的增殖活性與侵襲能力，顯示出較好的抗腫瘤作用，藥物與miR-143共同作用時(shí)抑制效果更明顯，說明miR-143可以提高舒尼替尼的敏感性。本研究通過qRT-PCR技術(shù)，對(duì)舒尼替尼處理48 h后的細(xì)胞進(jìn)行了miR-143表達(dá)量的測(cè)定，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，舒尼替尼上調(diào)了miR-143的水平，結(jié)合本研究證明了過表達(dá)miR-143能抑制786-O細(xì)胞的增殖與侵襲，因此推測(cè)舒尼替尼可能通過上調(diào)miR-143水平抑制786-O細(xì)胞的生物學(xué)活性。研究[9-11]發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇3激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶(PI3K-Akt)信號(hào)通路在RCC中異常高表達(dá)，該通路的持續(xù)激活能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖與侵襲，miR-143可通過抑制p-Akt的表達(dá)降低PI3K-Akt信號(hào)通路的活性進(jìn)而抑制腫瘤的進(jìn)展。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)是調(diào)節(jié)DNA甲基化的關(guān)鍵酶，DNMT3B是DNMTs中的一種，在RCC中的表達(dá)水平明顯升高[12]。目前認(rèn)為，在RCC中，DNMT3B導(dǎo)致多種抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化降低了抑癌基因的功能，使腫瘤細(xì)胞易于增殖和轉(zhuǎn)移，與RCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，逆轉(zhuǎn)RCC細(xì)胞中DNMT3B的高甲基化狀態(tài)，可以起到抗腫瘤作用[13-15]。子宮內(nèi)膜癌中的研究發(fā)現(xiàn)，miR-143可以直接調(diào)控DNMT3B表達(dá)[16]。本研究顯示，miR-143組細(xì)胞DNMT3B、p-AktS473蛋白表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，說明過表達(dá)miR-143可以降低DNMT3B、p-Akt蛋白的表達(dá)，推測(cè)miR-143可能通過調(diào)控DNMT3B、p-Akt的表達(dá)影響786-O細(xì)胞的增殖與侵襲。同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)，舒尼替尼也能降低DNMT3B、p-AktS473蛋白的表達(dá)，推測(cè)部分原因可能與舒尼替尼上調(diào)細(xì)胞miR-143含量有關(guān)。

綜上所述，miR-143可以降低786-O細(xì)胞增殖、侵襲能力，這可能與miR-143降低DNMT3B、p-Akt的表達(dá)有關(guān)。舒尼替尼可能通過上調(diào)miR-143水平抑制786-O細(xì)胞的增殖與侵襲，但具體的分子機(jī)制并不清楚，仍需進(jìn)一步研究。