康松松,楊雪苗,馮智翱,楊 丹,薄彧坤,安 明
(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,內(nèi)蒙古包頭 014040)
蒙藥古日古木-13丸,又名紅花清肝十三味丸,由紅花、麥冬、丁香、蓮子、木香、訶子、川楝子、梔子、紫檀香、水牛角濃縮粉、人工牛黃、麝香、銀朱13味藥組成,收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(蒙藥分冊)》[1]。古日古木-13丸清肝熱,在蒙藥歷史中使用較廣泛,臨床上用于治療眼科類疾病、肝臟類疾病、“亞瑪”病、心絞痛、腦梗死、腎熱癥等[2-4]。為完善藥材的有效性控制,以質(zhì)量可控為目標(biāo),擬建立古日古木-13丸中紅花、訶子和丁香的薄層鑒別標(biāo)準(zhǔn),測定羥基紅花黃色素A的含量,制定古日古木-13丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
1.1儀器 GenPure UV-TOC/UF超純水機(jī)、Thermo Ultimate3000高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾科技有限公司);BSA224S-CW萬分之一電子天平、SQP型十萬分之一電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);AS系列超聲波清洗機(jī)-220 V/50 Hz(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);TDZ5-WS多管架自動平衡離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。
1.2試劑藥品 對照品羥基紅花黃色素A(180323-017)購于內(nèi)蒙古伏安瓦科技有限公司,沒食子酸(110831-201605)、丁香酚(110725-201615)和對照藥材紅花(120907-201412)、訶子(121015-201004)均購于中國食品藥品檢定研究院;古日古木-13丸(806221、901112、901113)由內(nèi)蒙古包頭市中蒙醫(yī)院制劑室提供;甲醇、乙腈為色譜純,水為超純水,其余試劑為分析純。
1.3方法
1.3.1薄層鑒別
1.3.1.1紅花薄層鑒別 取紅花對照藥材0.5 g、古日古木-13丸3.5 g、陰性(不含紅花的處方其余藥材)3.0 g,加80 %丙酮10 mL,超聲10 min,離心,取上清液即得。照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn),各取10 μL,點(diǎn)于硅膠H薄層板上,以乙酸乙酯-甲酸-水(4∶1∶1)為展開劑,展開,取出,晾干。
1.3.1.2訶子薄層鑒別 取訶子對照藥材0.5 g、古日古木-13丸3.0g 、陰性(不含訶子的處方其余藥材)2.8 g,加甲醇10 mL,超聲30 min,離心,取上清液即得。取沒食子酸加甲醇制成8 mg/mL對照品溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn),各取10 μL,點(diǎn)于硅膠G薄層板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶0.6)展開劑,展開,取出,晾干,噴2 %三氯化鐵乙醇溶液,105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。
1.3.1.3丁香薄層鑒別 取古日古木-13丸3.0 g、陰性2.8 g,加甲醇10 mL,超聲30 min,離心,取上清液即得。取丁香酚加甲醇制成9 mg/mL對照品溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn),各取5 μL,點(diǎn)于硅膠G薄層板上,以環(huán)己烷-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴5 %香草醛硫酸溶液,105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。
1.3.2含量測定
1.3.2.1色譜條件 (1)色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);(2)流動相:甲醇-乙腈-0.7 %磷酸水溶液(26:2:72);流速1.0 mL/min;檢測波長403.0 nm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量10 μL。
1.3.2.2對照品溶液 精密稱定羥基紅花黃色素A對照品適量,加25 %甲醇制成109.4 μg/mL的對照品溶液。
1.3.2.3供試品溶液 取古日古木-13丸約2.8 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入25 %的甲醇50 mL,密塞,稱重,超聲處理40 min,放冷,補(bǔ)重,5 000 r/min離心10 min,取續(xù)濾液即得。
2.1薄層鑒別
2.1.1紅花薄層鑒別 在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上,樣品顯相同顏色的斑點(diǎn),陰性無干擾。見圖1。
圖1 古日古木-13丸中紅花的TLC圖譜
2.1.2訶子薄層鑒別 在與對照藥材、對照品色譜相應(yīng)位置上,樣品顯相同顏色的斑點(diǎn),陰性無干擾。見圖2。
圖2 古日古木-13丸中訶子的TLC圖譜
2.1.3丁香薄層鑒別 在與對照品色譜相應(yīng)位置上,樣品顯相同顏色的斑點(diǎn),陰性無干擾。見圖3。
圖3 古日古木-13丸中丁香的TLC圖譜
2.2含量測定
2.2.1提取效率試驗(yàn) 以25 %甲醇50 mL為溶劑,考察不同超聲提取時(shí)間對提取效率的影響。提取時(shí)間為40 min和50 min時(shí),羥基紅花黃色素A的含量幾乎相同,為節(jié)約能源,故選擇超聲時(shí)間為40 min。見表1。
表1 提取效率試驗(yàn)
2.2.2專屬性 稱取2.8 g除紅花外其他藥材研磨成粉,置于錐形瓶,照“1.3.2.3”項(xiàng)下制備陰性對照溶液。照“1.3.2.1”項(xiàng)下,分別精密吸取3種溶液各10 μL分析,結(jié)果表明陰性對照色譜圖(見圖6)中,在與羥基紅花黃色素A對照品(見圖4)以及供試品色譜圖(見圖5)相對應(yīng)的保留時(shí)間處無色譜峰出現(xiàn),專屬性好。
圖4 羥基紅花黃色素A對照品溶液色譜圖
圖5 供試品溶液色譜圖
圖6 陰性對照溶液色譜圖
2.2.3線性關(guān)系考察 取“1.3.2.2”項(xiàng)下對照品溶液,分別精密吸取6、8、10、12和14 μL進(jìn)樣分析,以峰面積對濃度進(jìn)行回歸分析,結(jié)果顯示,羥基紅花黃色素A的濃度分別為65.64、87.52、109.4、131.28、153.16 μg/mL時(shí),平均峰面積為32.4845、43.5125、54.3955、65.1595、75.983,回歸方程為y=0.4965x-0.015,r2=0.9999,可見羥基紅花黃色素A在65.64~153.16 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。
2.2.4精密度試驗(yàn) 取“1.3.2.2”項(xiàng)下對照品溶液,按照“1.3.2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5針,進(jìn)樣量10 μL,其峰面積的平均值為56.1818,RSD為0.083 %(n=5),說明精密度良好。
2.2.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液,分別在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h,按照“1.3.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定,樣品中羥基紅花黃色素A的峰面積分別為51.515、51.093、51.639、51.669、51.664、51.487,RSD為0.430 %。
2.2.6重復(fù)性試驗(yàn) 取批號901112樣品6份,每份約2.8 g,精密稱定,制備供試品溶液,進(jìn)樣分析,測定羥基紅花黃色素A的峰面積,結(jié)果見表2。
表2 重復(fù)性測定結(jié)果
2.2.7加樣回收率試驗(yàn) 取批號901112樣品9份,每份約1.4g ,分為3組,分別在3組具塞錐形瓶中加入羥基紅花黃色素A對照品溶液1 mL、2 mL、3 mL(約相當(dāng)于供試品含量的50 %,100 %,150 %),再加入25 %甲醇49 mL、48 mL、47 mL,按“1.3.2.3”項(xiàng)下進(jìn)樣分析,結(jié)果見表3。
表3 加樣回收率測定結(jié)果
2.2.8樣品含量測定 取樣品3批(批號為:901112、806211、901113),每批2份,另取模擬樣品3份,按正文“含量測定”項(xiàng)下的方法處理,分析測定,羥基紅花黃色素A的含量均在1.82 mg/g以上。見表4。采用同法,對模擬樣品用紅花藥材進(jìn)行了含量測定,結(jié)果見表5。
表4 樣品測定結(jié)果
表5 紅花藥材中羥基紅花黃色素A含量測定結(jié)果
按理論值折算,模擬樣品應(yīng)含羥基紅花黃色素A1.90337 mg/g,羥基紅花黃色素A轉(zhuǎn)移率=(1.89/1.90)×100 %=99.45 %。2020年版《中國藥典》一部“紅花”項(xiàng)下規(guī)定:含羥基紅花黃色素A不得少于1.0 %(相當(dāng)于10 mg/g)。含量低限=(28.6/200.4)×10×99.45 %=1.4193 mg/g??紤]到其他影響因素,下浮10 %,本品每1 g含紅花以羥基紅花黃色素A計(jì)不得少于1.2774 mg。
對蒙藥古日古木-13丸中紅花[5]、訶子[6]和丁香[7]建立了薄層色譜定性鑒別方法,在與對照藥材或?qū)φ掌飞V相應(yīng)位置上,樣品顯相同顏色的斑點(diǎn),陰性無干擾,專屬性強(qiáng)。與文獻(xiàn)相比,成功建立了紅花、訶子和丁香的薄層鑒別標(biāo)準(zhǔn),對古日古木-13丸的薄層定性鑒別進(jìn)行了補(bǔ)充。同時(shí)建立了羥基紅花黃色素A的含量測定方法[8-10],考察了提取時(shí)間對提取效率的影響,從環(huán)保和被測成分提取方面考慮,選擇了40 min;羥基紅花黃色素A在65.64 μg/mL~153.16 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系;平均回收率為100.4 %。根據(jù)2020年版《中國藥典》一部“紅花”項(xiàng)下規(guī)定,考慮到其他因素的影響,蒙藥古日古木-13丸每1 g含紅花以羥基紅花黃色素A計(jì)不得少于1.2774 mg。建立的羥基紅花黃色素A含量測定方法專屬性強(qiáng),重現(xiàn)性好,靈敏度高,簡便快捷。
綜上所述,成功地建立了蒙藥古日古木-13丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),為產(chǎn)品質(zhì)量控制提供了依據(jù)。
包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)2021年5期