基于線粒體D-loop區(qū)分析安徽省5個翹嘴鱖養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性

謝啟明 柯瑞林 劉帆 蘇時萍

摘要：為研究安徽省鱖魚的遺傳多樣性，對安徽省內(nèi)5個鱖魚養(yǎng)殖群體共125個樣本的線粒體D-loop區(qū)進行了擴增和測序分析。試驗最終共獲得125條長度為858 bp的D-loop區(qū)序列，共檢出260個變異位點，包括77個簡約信息位點和183個單核苷酸變異位點;堿基平均含量為T（29.3%）、C（20.6%）、A（33.8%）和G（16.2%），具有明顯的（A+T）堿基偏移。5個群體的遺傳多樣性較低（Hd，mean=0.596，Pi，mean=0.0 053），可能經(jīng)歷了瓶頸事件。此外，通過對群體遺傳結構及鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹的分析發(fā)現(xiàn)，5個養(yǎng)殖群體未表現(xiàn)出明顯地理聚集，不同群體間有少量個體混合。群體變異主要來自于群體內(nèi)部而非群體間。本研究可為鱖魚種質(zhì)資源的保護和恢復提供理論依據(jù)。

關鍵詞：鱖（Siniperca chuatsi）;線粒體基因組;D-loop區(qū);遺傳多樣性

中圖分類號： S932.4 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）09-0143-05

鱖（Siniperca chuatsi），隸屬硬骨魚綱、鱸形目、鱸形科、鱖亞科、鱖屬，廣泛分布于中國南部，是一種具有較高經(jīng)濟價值的特色魚類。安徽省是內(nèi)陸漁業(yè)大省，擁有全國第二大的水域總面積，水域生態(tài)良好、水產(chǎn)資源豐富，水產(chǎn)品產(chǎn)量穩(wěn)居全國前四。近年，安徽省一直在大力推進綠色生態(tài)養(yǎng)殖和特色水產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)，及漁業(yè)產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟體系的轉(zhuǎn)型。安徽省作為翹嘴鱖的兩大主產(chǎn)地之一，具有得天獨厚的優(yōu)勢。然而天然水域的破壞和過度商業(yè)捕撈，使得鱖魚的野生資源迅速減少，并且大規(guī)模的集中養(yǎng)殖又缺乏充足的親本補充，常常發(fā)生近親繁殖，使得生產(chǎn)性狀退化，種質(zhì)資源丟失。為緩解種質(zhì)質(zhì)量與生產(chǎn)需求間的矛盾，改良生產(chǎn)性狀，提高經(jīng)濟效益，并為優(yōu)良品種的選育提供科學依據(jù)，開展鱖種群遺傳多樣性與群體結構的分析非常重要。

遺傳多樣性是生物進化與適應環(huán)境的物質(zhì)基礎，其豐富程度反映了生物的進化與適應潛力的強弱。近年來，已有不少關于鱖魚遺傳多樣性的研究。如胡玉婷等基于線粒體Cyt b基因分析了安徽省養(yǎng)殖黃金鱖（翹嘴鱖選育種）群體與3個野生翹嘴鱖群體的遺傳多樣性，結果表明，4個群體具有較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸遺傳多樣性并發(fā)生了遺傳分化[1]。曾慶凱等基于10對微衛(wèi)星引物分析了3個野生翹嘴鱖群體的遺傳多樣性，得到了相似的結果[2]。顏元杰等基于20對微衛(wèi)星引物分析了江蘇省6個野生翹嘴鱖群體，結果表明其具有較高的遺傳多樣性[3]。然而，有關安徽省翹嘴鱖養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性研究并不多見。

線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是一種理想的分子標記，具有無重組、多拷貝無內(nèi)含子等特點[4]。mtDNA的不同區(qū)域具有不同的進化速率，如進化速率較低的12S rDNA、16S rDNA等用于科的標記;進化速率適中的Cyt b、CO Ⅰ用于屬、種的標記;進化速率較高的D-loop區(qū)用于種群內(nèi)部的標記[5]。

本研究基于能夠反映種群內(nèi)部遺傳多樣性的線粒體D-loop區(qū)引用，分析來自安徽省的5個翹嘴鱖養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性與群體結構，旨在為翹嘴鱖的品種選育與改良工作提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

翹嘴鱖樣品均采集自安徽省內(nèi)，包括肥東縣管灣水產(chǎn)養(yǎng)殖場（GW）、池州市秋浦特種水產(chǎn)開發(fā)有限公司（QP）、安慶市皖宜季牛水產(chǎn)養(yǎng)殖場（AQ）、滁州市隆財漁業(yè)有限公司（CZ）和明光市廣源水產(chǎn)養(yǎng)殖場（MG），共5個群體，每個群體25個樣本，取背部肌肉組織于無水乙醇中4 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 翹嘴鱖線粒體DNA的抽提 翹嘴鱖肌肉組織使用上海諾倫生物醫(yī)藥技術有限公司（LG-0107）新鮮動物組織和細胞線粒體DNA抽提試劑盒抽提線粒體DNA，-20 ℃保存。

1.2.2 翹嘴鱖D-loop區(qū)的擴增、測序 翹嘴鱖 D-loop區(qū)引物設計以NCBI：NC_015822為模板，使用Primer 5.0設計引物。F：5′-CCCAAAGCTAGGATTGTAAAC-3′;R：5′-CGGATACTTGCATGTGTAAG-3′，委托上海桑尼生物科技有限公司合成。

PCR擴增使用50 μL體系：Premix Taq（TaKaRa Taq Version2.0 plus dye）（25 μL），20 μmol/μL 的上游引物（1 μL），20 μmol/μL的下游引物（1 μL），DNA模板（2 μL），ddH2O補充至50 μL。

擴增程序為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性 30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán);最后一個循環(huán)結束后，72 ℃延伸10 min。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳初步確定片段長度后，由上海桑尼生物科技有限公司進行產(chǎn)物純化、測序。

1.2.3 遺傳多樣性和群體分化分析 序列的比對和堿基組成使用MEGAX[6]分析。序列的變異位點、核苷酸多樣性（Pi）、單倍型多樣性（Hd）、基因流（Nm）和分化系數(shù)（FST）使用DNAsp 5.0分析[7]。分子變異分析（A-MOVA）使用PopART8分析。

1.2.4 群體結構分析 單倍型網(wǎng)絡圖使用PopART[8]構建。鄰接法系統(tǒng)進化樹使用MEGAX6構建，并進行1 000次的Boot strap檢驗。

2 結果

2.1 遺傳多樣性和群體分化分析

測序返回的序列數(shù)據(jù)經(jīng)人工校正、比對去除兩端冗余序列、Blast驗證序列同源性后，共獲得150條長度為883 bp的D-loop區(qū)序列用以下游分析。

150條序列共檢出65個變異位點，包括18個簡約信息位點和47個單堿基變異位點;堿基平均含量為T（29.3%）、C（20.6%）、A（33.8%）和G（16.2%），具有明顯的（A+T）堿基偏倚。

由表1可知，多數(shù)群體具有較高的單倍型多樣性（0.33～0.71），其中，GW與AQ群體單倍型多樣性最高（0.71），只有QP群體較低（0.33<0.5）。除Hap 2、Hap 4、Hap 12為多群體共享單倍型外，其余均為群體內(nèi)獨有單倍型，其中MG群體擁有最多的單倍型（9個），QP群體單倍型最少（2個）。核苷酸多樣性均較低（0.00 311～0.00 732<0.05），其中MG群體稍高（0.00 732），QP群體最低（0.00 311），總體為高單倍型多樣性、低核苷酸多樣性。

由表3可知，5個群體的變異來源主要為群體內(nèi)部變異（93.93%），少量來自群體間（6.07%）。

2.2 群體結構分析

由圖2可知，個體間遺傳距離均不超過0.05，且多數(shù)接近0.00;除GW與QP群體的個體聚集外，其他群體間均有不同程度個體混合。由圖3可知，單倍型網(wǎng)絡圖也顯示出了相同的趨勢，單倍型間并沒有依據(jù)地理位置而聚集，而是通過Hap 2、Hap 4和Hap 12，替換數(shù)個堿基后相連接，多數(shù)單倍型為群體內(nèi)部獨有。

3 討論

遺傳多樣性是生物適應與進化的物質(zhì)基礎，豐富的遺傳多樣性使得物種能夠更好地適應環(huán)境，擁有巨大的進化潛力。人工養(yǎng)殖的動物，常因親本基數(shù)不足，產(chǎn)生奠基者效應，難以避免近交和遺傳漂變，使得遺傳多樣性迅速丟失[9]。本研究基于線粒體D-loop區(qū)序列分析了安徽省內(nèi)5個翹嘴鱖養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性與結構。結果顯示，150條 D-loop 序列共檢出18個單倍型，65個變異位點，其中，包括18個簡約信息位點與47個單堿基突變位點。D-loop區(qū)堿基組成呈現(xiàn)明顯的（A+T，63.1%）堿基偏倚，符合脊椎動物線粒體堿基構成的一般特征[10]。5個群體的遺傳多樣性指數(shù)表現(xiàn)為較高的單倍型多樣性（Hd，mean=0.596）與較低的核苷酸多樣性（Pi，mean=0.005 3）的模式。與野生鱖相比，養(yǎng)殖群體的單倍型多樣性與核苷酸多樣性都有較多的流失。比如，程起群等同樣使用線粒體D-loop 區(qū)作為分子標記，對長江流域的大眼鱖（Sinipercak nerii）進行了遺傳多樣性調(diào)查，結果顯示，Hd，mean=0.923，Pi，mean=0.009 5[11];成為為等使用微衛(wèi)星標記，對3個野生翹嘴鱖群體和2個養(yǎng)殖群體進行了遺傳多樣性調(diào)查，結果同樣表明野生群體的遺傳多樣性要高于養(yǎng)殖群體[12]。此外，這種模式暗示5個群體近期可能經(jīng)歷瓶頸事件，產(chǎn)生奠基者效應，使得核苷酸多樣性在小群體中經(jīng)由遺傳漂變迅速丟失[13]。這一模式在其他物種的養(yǎng)殖群體中也有所報道，蘇雨等基于D-loop區(qū)分析了中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）養(yǎng)殖群體的的遺傳多樣性，結果顯示，Hd，mean=0.931，Pi，mean=0.014 3;趙立祥等同樣采用D-loop區(qū)作為標記，分析了寶石鱸（Scortum barcoo）養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性，結果顯示Hd，mean=0.274，Pi，mean=0.000 8。

遺傳多樣性的時空差異分布，造成了不同的群體結構，對于群體結構的了解，有助于更好地制定養(yǎng)殖模式與育種策略。遺傳分化指數(shù)FST是用來衡量群體分化程度的一個指標，根據(jù)Wright的劃分標準可分為：0.00～0.05，無分化;>0.05～0.15，中度分化;>0.15～0.25，高度分化;>0.25，重度分化[14]。由表2和圖2可知，本研究的遺傳分化系數(shù)分析結果發(fā)現(xiàn)，多數(shù)群體間都發(fā)生了高度分化（FST mean=0.144），但是個體間遺傳距離卻均<0.05，并且多數(shù)接近0。一般認為遺傳距離超過0.01時，就表明群體遺傳變異較大[15]。由表1可知，遺傳距離與遺傳分化指數(shù)間的矛盾，可用群體間單倍型多樣性與核苷酸多樣性的差異解釋，這是因為遺傳距離是以核苷酸差異為計算基礎，而遺傳分化指數(shù)是以基因型頻率為計算基礎。更進一步，產(chǎn)生這一矛盾的根本原因可能是由于奠基者效應使得核苷酸多樣性迅速丟失，而單倍型多樣性的保留在不同群體間產(chǎn)生了差異。同樣地，在單倍型網(wǎng)絡圖顯示出了和系統(tǒng)進化樹相似的結果，5個群體的單倍型并沒有依照地理位置聚集，反而以3個主要共享單倍型Hap 2、Hap 4、Hap 12為中心，其余單倍型通過數(shù)個堿基的替換演變成群體內(nèi)部獨有單倍型。A-MOVA分析顯示，5個群體間的變異來源主要是群體內(nèi)部（93.93%），少數(shù)來自群體間（6.07%）。

綜上所述，本研究基于能夠反映種群間遺傳多樣性的線粒體D-loop區(qū)為分子標記，分析了5個安徽省翹嘴鱖養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性與群體結構。結果表明，5個群體的遺傳多樣性較低，可能發(fā)生過瓶頸事件;群體結構發(fā)生了中等程度的分化，產(chǎn)生了各個群體內(nèi)部獨有的單倍型，但是群體間遺傳距離較小，不足以認定為群體間有差異。因此，在后續(xù)的繁殖與選育工作中，應當加強對遺傳背景的篩查，避免因遺傳背景的相似，使得育種工作得不到有效實施。

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