秋水仙素誘導(dǎo)人參果“圓果”多倍體的初探

李映樂(lè) 張伊 李茹 王玉英 李枝林 黃興龍 李國(guó)昌

摘要：為建立秋水仙素誘導(dǎo)人參果多倍體的方法，以人參果品種“圓果”組培苗為試驗(yàn)材料，用0.1%、0.2%、0.4%濃度的秋水仙素溶液分別浸泡10、18、26 h，培養(yǎng)30 d觀察和測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果表明，秋水仙素處理濃度、時(shí)間與人參果組培苗成活率成反比。濃度0.1%處理10 h，植株成活率為96.67%;濃度0.2%和0.4%處理26 h死亡率都達(dá)到100%。濃度0.2%處理18 h，變異率最高為53.33%;變異植株出現(xiàn)莖增粗，葉柄增長(zhǎng)增粗，葉形指數(shù)小，根系發(fā)達(dá)，節(jié)間距離增加，顏色加深等特點(diǎn)。處理濃度為0.2%時(shí)，組培苗半致死時(shí)間為16.66 h。綜合表明，秋水仙素濃度為0.2%處理18 h最適于人參果組培苗多倍體的誘導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：人參果;秋水仙素;多倍體;誘導(dǎo)半致死時(shí)間;組培苗

中圖分類(lèi)號(hào)： S641.901 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2021）10-0122-04

人參果（Solanum muricatum Aiton）原名香瓜茄，原產(chǎn)于南美洲，是茄科多年生雙子葉草本植物[1]。人參果具有多種藥理作用，且無(wú)不良反應(yīng)，尤其在食品保健方面，除增強(qiáng)機(jī)體免疫力外，還可以輔助治療阿爾茲海默病、血管疾病等，還可以改善記憶、促進(jìn)睡眠、減肥等[2]。人參果的果實(shí)鮮美多汁，甜而不膩，富含維生素C和蛋白質(zhì)，但糖和脂肪含量低，還含有人體必需的18種微量營(yíng)養(yǎng)素，并且是很好的高鉀低鈉水果，保健效果極其顯著，被譽(yù)為“綠色保健珍品”[3]。因此，研究人參果多倍體育種對(duì)人參果產(chǎn)業(yè)具有重要意義。

植物多倍體是指每個(gè)細(xì)胞中染色體的數(shù)目是3組或3組以上的植物[4]。植物育種研究中，多倍體植物的經(jīng)濟(jì)性狀往往更加優(yōu)良，在生理上較普通植株有更強(qiáng)的適應(yīng)性，在遺傳上有較大的可塑性，其中一些特殊性能可為農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展提供很多幫助。隨著染色體加倍，細(xì)胞核增大導(dǎo)致細(xì)胞也會(huì)變大，根、莖增粗，葉片增厚，顏色加深，所得到的果實(shí)種子也會(huì)增大。在園藝產(chǎn)品中，尤其對(duì)于水果來(lái)說(shuō)，獲得無(wú)籽或少籽果實(shí)是目前人們研究的目標(biāo);多倍體植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性和抗逆性較普通植物更強(qiáng)，能提高植物成活率，進(jìn)而獲得更高的收益;有機(jī)合成率提高，多倍體植物新陳代謝旺盛，酶活性增加，提高了有機(jī)物的合成速率，植物的營(yíng)養(yǎng)元素含量也相應(yīng)增加[5]。

目前，獲得植物多倍體的方式有2種，即自然誘導(dǎo)和人工誘導(dǎo)。因自然誘導(dǎo)存在隨機(jī)性且頻率較低，所以生產(chǎn)上常用人工誘導(dǎo)方式。人工誘導(dǎo)多倍體的方法可分為物理方法和化學(xué)方法。物理方法包括利用溫度突變、機(jī)械創(chuàng)傷和輻射等。物理方法是早期多倍體育種最常用的方法[6]，已獲得咖啡[7]、桑樹(shù)[8]等加倍植株。化學(xué)方法包括使用植物生物堿、植物生長(zhǎng)激素和其他化學(xué)試劑。其中，秋水仙素處理是誘導(dǎo)植物多倍體最高效也是最常用的方法之一。已在雜交蘭[9]、葡萄[10]獲得四倍體植株，但目前尚無(wú)人參果多倍體誘導(dǎo)的研究。因此本試驗(yàn)以人參果“圓果”為研究對(duì)象，采用秋水仙素處理人參果組培苗，觀察植株的生長(zhǎng)和變異情況，以期篩選出人參果多倍體誘導(dǎo)的最佳處理濃度和時(shí)間，為人參果的多倍體育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2019年在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院花卉研究所進(jìn)行，試驗(yàn)材料為人參果“圓果”組培苗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 多倍體誘導(dǎo) 把人參果組培苗切成長(zhǎng)約 1 cm 的莖段，去除葉片，只留1個(gè)葉柄。每個(gè)處理取30個(gè)莖段放于事先配制好的秋水仙素溶液中浸泡，處理時(shí)間為10、18、26 h 。后接種于MS培養(yǎng)基上，每瓶培養(yǎng)基接種6個(gè)莖段，每個(gè)濃度接種5瓶。期間觀察植株的生長(zhǎng)情況，記錄其成活率和死亡率。繼代培養(yǎng)30 d，測(cè)量植株的形態(tài)指標(biāo)。

培養(yǎng)條件：pH值5.8，相對(duì)濕度[RH，（75±5）%]，溫度（22±2） ℃，14 h/d的光照周期，光照度1 800～2 500 lx。不同濃度秋水仙素處理和時(shí)間配比組合如表1所示。

1.2.2 測(cè)量指標(biāo)及方法 （1）形態(tài)指標(biāo)。測(cè)定葉片數(shù)、葉長(zhǎng)、葉寬、根數(shù)、根長(zhǎng)、株高、莖粗和植株鮮質(zhì)量。根據(jù)形態(tài)觀察法，確定變異植株，計(jì)算變異率。變異率=變異株數(shù)/總處理株數(shù)×100%。（2）半致死時(shí)間（LT50）計(jì)算。本試驗(yàn)采用SPSS軟件計(jì)算LT50。導(dǎo)入時(shí)間和死亡率數(shù)據(jù)，點(diǎn)擊圖形→圖表構(gòu)建器創(chuàng)建散點(diǎn)圖。然后點(diǎn)擊分析→回歸→線性按鈕，把死亡率選入因變量，時(shí)間選入自變量，點(diǎn)擊確定按鈕創(chuàng)建時(shí)間-死亡率的線性回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同秋水仙素處理對(duì)人參果組培苗成活率和死亡率的影響

從表2中可以看出，秋水仙素處理對(duì)人參果組培苗成活率影響較大，其中，CK處理下人參果組培苗成活率最高，達(dá)到100%。A1處理與CK處理成活率接近，為96.67%，均比其他處理成活率高，比B1處理高36.67百分點(diǎn)，比C1處理高46.67百分點(diǎn)，比A2處理高16.67百分點(diǎn)，比B2處理高46.67百分點(diǎn)，比C2處理高96.67百分點(diǎn)，比A3處理高36.67百分點(diǎn)，比B3處理高53.34百分點(diǎn)，比C3處理高96.67百分點(diǎn)。而處理濃度相同時(shí)，成活率大小為A1處理>B1處理>C1處理;A2處理>B2處理>C2處理;A3處理>B3處理>C3處理。表明處理時(shí)長(zhǎng)與成活率成反比，即處理時(shí)間越長(zhǎng)，成活率越低。處理時(shí)間相同時(shí)，成活率大小為A1處理>A2處理>處理A3;B1處理>B2處理>B3處理;C1處理>C2處理=C3處理。表明處理濃度與成活率成反比，即處理濃度越高，成活率越低。而當(dāng)處理時(shí)間為26 h，處理濃度分別為0.2%、0.4%時(shí)，幼苗成活率為0。

2.2 不同秋水仙素處理對(duì)人參果組培苗形態(tài)指標(biāo)的影響

由表3、圖1可知，人參果組培苗在不同秋水仙素處理下植株形態(tài)指標(biāo)差異顯著。各個(gè)處理株高大小表現(xiàn)為CK處理>A2處理>B3處理>B2處理>A1處理>B1處理>C1處理=A3處理，其中CK處理株高最高，A2處理、B3處理、A1處理、B1處理與CK處理間差異不顯著，B2處理、C1處理、A3處理與CK處理相比差異顯著。各個(gè)處理葉長(zhǎng)表現(xiàn)為A3處理>B3處理=B1處理>A1處理>CK處理>C1處理>B2處理>A2處理，其中A3處理的葉長(zhǎng)最長(zhǎng)，但B3處理、B1處理、A1處理、CK處理、C1處理與A3處理間差異不顯著，B2處理、A2處理與A3處理間差異顯著，而B(niǎo)2處理、A2處理下葉長(zhǎng)最短，且二者間差異不顯著。A3處理、A1處理下葉寬值最大，具體表現(xiàn)為A3處理=A1處理>CK處理>B3處理>B1處理>C1處理=A2處理>B2處理，但A3處理、A1處理、CK處理、B3處理、B1處理、C1處理、A2處理間差異不顯著，B2處理相較于A3處理、A1處理差異顯著。CK處理下葉片數(shù)最多，具體表現(xiàn)為CK處理>B1處理>C1處理>B3處理>A1處理>A3處理>A2處理>B2處理，但B1處理、C1處理、B3處理與CK處理間差異不顯著，A1處理、A3處理、A2處理、B2處理與CK處理間差異顯著，而A1處理和A3處理間，A2處理和B2處理間差異不顯著。C1處理根長(zhǎng)最長(zhǎng)，具體表現(xiàn)為C1處理>A3處理>CK處理>B2處理>B1處理>A1處理>A2處理>B3處理，但C1處理與A3處理間差異不顯著，CK處理、B2處理、B1處理、A1處理、A2處理、B3處理與C1處理間差異顯著。A2處理下根數(shù)最多，具體變現(xiàn)為A2處理>B3處理=A3處理>B1處理>A1處理>CK處理=C1處理>B2處理，但B3處理、A3處理、B1處理、A1處理、CK處理，C1處理與A2處理差異不顯著，而B(niǎo)2處理與A2處理間差異顯著。各處理間的莖粗和鮮質(zhì)量差異不顯著。

2.3 不同秋水仙素處理對(duì)人參果組培苗變異率的影響

由表4可知，各處理變異率高低為B2處理>B1處理>A3處理>C1處理>A2處理>B3處理>A1處理。B2處理的變異率最高，達(dá)到53.33%，比B1處理高14.44百分點(diǎn)，比A3處理高20百分點(diǎn)，比C1處理高33.33百分點(diǎn)，比A2處理高36.66百分點(diǎn)，比B3處理高37.95百分點(diǎn)，比A1處理高46.43百分點(diǎn)。綜上所述，B2處理下變異率最高，達(dá)到53.33%，其次是B1處理，達(dá)到38.89%。變異植株與CK處理相比，莖段增粗，顏色加深;葉柄增長(zhǎng)，增粗;顏色加深，葉形指數(shù)小;根系發(fā)達(dá)，節(jié)間距離增加。

2.4 秋水仙素處理對(duì)人參果組培苗的半致死時(shí)間

由表4可以看出，B2處理下人參果組培苗變異效果最好，即秋水仙素濃度為0.2%時(shí)，植株的變異率最高。秋水仙素誘導(dǎo)多倍體時(shí)，除濃度劑量外，時(shí)間梯度的設(shè)置也非常重要。因此， 對(duì)秋水仙素濃度為0.2%處理下進(jìn)行半致死時(shí)間方程的擬合。

由圖2可知，其線性回歸方程為y=0.05x-0.333 3，通過(guò)計(jì)算得到此濃度下的半致死時(shí)間為16.66 h，擬合度r2=0.979 6，該回歸直線對(duì)觀測(cè)值的擬合程度很高。

3 討論與結(jié)論

Satina等用秋水仙素處理曼陀羅成功加倍以后，秋水仙素處理誘導(dǎo)染色體加倍就開(kāi)始大范圍應(yīng)用于其他植物[11]。張靜靜以鐵皮石斛為材料，表明處理材料的死亡率與秋水仙素濃度和處理時(shí)間呈正比關(guān)系[12]。本試驗(yàn)表明，同一處理濃度時(shí)，處理時(shí)長(zhǎng)與成活率成反比，即處理時(shí)間越長(zhǎng)，成活率越低。同一處理時(shí)間時(shí)，處理濃度與成活率成反比，即處理濃度越大，成活率越低，與前人試驗(yàn)結(jié)果一致。

趙陽(yáng)等在秋水仙素對(duì)園藝植物育種研究中提到果樹(shù)和觀賞樹(shù)木往往使用較高濃度（1.0%～1.5%）處理，而草本植物則應(yīng)設(shè)置較低濃度（0.01%～0.2%）[13]。本試驗(yàn)使用的人參果組培苗是多年生草本植物，對(duì)秋水仙素的耐受能力弱。高濃度長(zhǎng)時(shí)間處理下易造成生理死亡，所以本試驗(yàn)C2處理、C3處理下組培苗全部死亡。半致死時(shí)間表示在一定條件下，秋水仙素能引起人參果組培苗植株半數(shù)死亡的浸泡時(shí)間，用LT50表示，是用來(lái)衡量秋水仙素溶液對(duì)人參果毒性大小的重要參數(shù)。在閆炯利用甲基磺酸乙酯（EMS）誘導(dǎo)小麥突變的試驗(yàn)中，前人認(rèn)為L(zhǎng)T50對(duì)篩選試劑適宜的處理?xiàng)l件有指導(dǎo)作用[14]。本研究結(jié)果表明，秋水仙素濃度為0.2%時(shí)，人參果組培苗半致死的處理時(shí)間為16.66 h。

魏卓等利用秋水仙素誘導(dǎo)黃心中華獼猴桃多倍體，出現(xiàn)葉片變厚、葉色變深的現(xiàn)象[15]，武婭歌等誘導(dǎo)歐洲溫室型黃瓜獲得的同源四倍體植株主莖明顯更為粗壯[16];王宇婷等發(fā)現(xiàn)渥丹百合種子誘導(dǎo)獲得的四倍體植株根系顯著增粗[17];張艷萍等用秋水仙素處理馬鈴薯野生種誘導(dǎo)多倍體中發(fā)現(xiàn)處理后植株矮小[18];邵冰潔等對(duì)枸杞多倍體進(jìn)行誘導(dǎo)后，枸杞植株節(jié)間距離縮短[19]。在本試驗(yàn)出現(xiàn)了秋水仙素處理抑制植株株高生長(zhǎng)，處理后植株表現(xiàn)為矮小，葉形指數(shù)小，莖粗，根短和人參果組培苗節(jié)間距離增加等現(xiàn)象，與前人研究結(jié)果不一致?？赡芘c植物品種有關(guān)，原因有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]羅文楊 . 蔬菜、水果兼觀賞型植物——人參果[J]. 農(nóng)村百事通，2007，26 （19）：31，85.

[2]趙 婧，黨夢(mèng)瑤，王鉑錚，等. 香瓜茄的養(yǎng)生保健價(jià)值分析[J]. 寧夏農(nóng)林科技，2013，54（3）：123-124.

[3]許倩倩，岳 恒，蘇攀峰，等. 香瓜茄的化學(xué)成分分析[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（19）：100-104.

[4]裴新澍. 植物多倍體育種[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1962，3（12）：6-12.

[5]劉 靜. 植物多倍體的形成及應(yīng)用研究綜述[J]. 安康學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，23（4）：99-102.

[6]馬海淵，張金鳳，李志丹. 植物多倍體育種技術(shù)方法研究進(jìn)展[J]. 防護(hù)林科技，2008，26（1）：43-46.

[7]余鳳英，凌緒柏，劉偉青，等. 中粒種咖啡小孢子染色體加倍方法的研究[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，1990，11（1）：45-54.

[8]楊今后，楊新華. 桑樹(shù)人工三倍體育種的研究[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，1989，15（2）：65-70，119.

[9]尹翠翠，張 燕，張景華，等. 秋水仙素誘導(dǎo)雜交蘭四倍體及倍性鑒定[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2010，24（3）：518-521.

[10]羅耀武，喬子靖，朱子英，等. 秋水仙素誘變葡萄玫瑰香品種為四倍體的研究[J]. 中國(guó)果樹(shù)，1995，37（2）：5-7.

[11]Satina S，Blakeslee A F，Avery A G. Chromosome behavior in triploid Datura strmonium. Ⅲ. The seed （Abstract）[J]. American Journal of Botany，1938，25（8）：595-602.

[12]張靜靜. 鐵皮石斛多倍體的誘導(dǎo)及其鑒定[D]. 杭州：浙江農(nóng)林大學(xué)，2013.

[13]趙 陽(yáng)，黃 韜. 秋水仙素在園藝植物多倍體育種中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 上海蔬菜，2010，24（2）：29-31.

[14]閆 炯. EMS誘導(dǎo)小麥突變及突變的鑒定和篩選[D]. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[15]魏 卓，張先昂，張 越，等. 黃心中華獼猴桃多倍體誘導(dǎo)及鑒定[J]. 分子植物育種，2020，18（12）：4036-4040.

[16]武婭歌，趙建華，宋曉飛，等. 歐洲溫室型黃瓜同源四倍體新種質(zhì)的創(chuàng)制與鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（18）：141-145.

[17]王宇婷，張雅倩，楊青杰. 秋水仙素對(duì)渥丹百合種子多倍體誘導(dǎo)的影響[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（7）：5-9.

[18]張艷萍，蒲秀琴. 秋水仙素誘導(dǎo)馬鈴薯野生種S. acaule多倍體的初步研究[J]. 中國(guó)種業(yè)，2018，37（6）：66-68.

[19]邵冰潔，萬(wàn)思琦，劉江淼，等. 黑果枸杞和寧夏枸杞的多倍體誘導(dǎo)和鑒定[J]. 分子植物育種，2018，16（8）：2593-2599.