擇時針刺對炎性疼痛模型P2X7-/-小鼠穴區(qū)成纖維細胞p38MAPK表達的影響＊

劉 祎，景明夷，白艾靈，韋 婷，蔡定均

(成都中醫(yī)藥大學針灸推拿學院 成都 610036)

擇時針刺是廣受關(guān)注的一種針刺療法，其效應(yīng)與穴位局部結(jié)構(gòu)及功能狀態(tài)變化密切相關(guān)[1]。穴位區(qū)域成纖維細胞可感知針刺等機械刺激并將其轉(zhuǎn)換為機體可識別的生物信號，繼而引發(fā)多種生物學效應(yīng)[2-4]。不同時間針刺穴區(qū)成纖維細胞出現(xiàn)的變化不一。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在ZT0(7：00)、ZT4(11：00)、ZT8(15：00)、ZT12(19：00)、ZT16(23：00)、ZT20(3：00)時間點針刺足三里穴，穴區(qū)成纖維細胞橫截面積增大，呈圓梭形排列，骨架重構(gòu)不同，其中以ZT8最明顯[5]。ZT8時間點針刺穴區(qū)成纖維細胞發(fā)生改變的同時，其細胞膜上P2X7受體也發(fā)生明顯變化[6]。MAPK相關(guān)信號通路被證明在細胞骨架中的微管、微絲和中間纖維等結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[7-10]，p38MAPK及其磷酸化改變是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。在經(jīng)典炎性疼痛模型下，我們已證明ZT8時間點針刺可調(diào)節(jié)野生型小鼠穴區(qū)p38MAPK表達量[6]，故本實驗選用P2X7-/-小鼠建立炎性疼痛模型，觀察ZT8針刺足三里對穴區(qū)p38MAPK表達的影響，以明確P2X7受體是否通過p38MAPK信號通路介導(dǎo)擇時針刺對成纖維細胞骨架的重構(gòu)。

1 材料

1.1 動物

P2X7-/-小鼠18只，雌雄皆可，體質(zhì)量20±2 g，10-14周齡，自JAX實驗室引進，購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)服務(wù)公司。實驗在成都醫(yī)學院SPF級實驗室進行，每Optimice 100 EVC籠具內(nèi)飼養(yǎng)5-7只動物。自動光－暗控制[L:D為12:12，即07:00-19:00光照(light，L)，19:00-07:00暗置(dark，D)]，籠具內(nèi)隔音、通風、恒溫(22-24℃)，相對濕度50%-60%。所有動物均飼以SPF級顆粒飼料與滅菌水，并由成都醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2 試劑

ECL發(fā)光試劑盒(批號：BL520A，美國Thermo公司)，預(yù)染蛋白Marker(批號：00215343，美國NEB公司)，PVDF膜(美國Hybond公司)。P38抗體、兔單克隆抗體(批號：ab32142)，β-actin抗體、鼠單克隆抗體(批號：ab8226)，生物素化山羊抗鼠IgG(H+L)(批號：ab6789)，生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(批號：ab6721)，以上抗體皆購買于Abcam艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

2 方法

2.1 動物篩選

所有動物經(jīng)過7天光-暗周期同步馴化后，選用與光-暗周期同步的動物，采用輻射熱甩尾法在上午8點到12點間測定痛閾。具體方法：先安撫動物，待其情緒平穩(wěn)后將其放入自制的圓桶型小鼠固定器中，頭部向前，使尾巴充分暴露并自然放松。待動物完全安靜后，將尾巴的中下三分之一處平放在疼痛甩尾測試儀(7360型，意大利Ugo Basile)的光熱輻射孔上，然后點擊測試鍵，記錄該孔中開始發(fā)出熱刺激直接照射到動物尾部皮膚到動物尾巴主動甩開的這段時間，即為甩尾反應(yīng)潛伏期。同一只動物測定時間間隔在5 min以上，以防動物被燙傷或者被激怒。操作過程由固定人員在同一室內(nèi)環(huán)境(室內(nèi)溫度保持在22-24℃，相對濕度為50%至60%之間)下進行，最終痛閾值以3次測定值的平均數(shù)為準。

痛閾篩選標準：在3-10 s內(nèi)動物能產(chǎn)生甩尾反應(yīng)即納入實驗；甩尾時間低于3 s或高于10 s的動物剔除實驗，表明此類動物出現(xiàn)痛覺過敏或反應(yīng)遲鈍。

2.2 實驗分組

動物篩選完成后，運用SPSS21.0統(tǒng)計軟件根據(jù)痛閾值完全隨機分組，分為空白組6只、造模組12只。造模組模型復(fù)制完成后，使用相同統(tǒng)計軟件據(jù)痛閾值將12只動物隨機分為模型組6只、模型+針刺組6只。

2.3 模型復(fù)制

分組完成以后，在造模組動物的右足足墊部皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑20μL?？瞻捉M動物于相同部位注射劑量相當?shù)纳睇}水。處理結(jié)束24 h后，能夠看到造模動物注射的右足區(qū)域出現(xiàn)明顯的紅腫(圖1)，造模組動物通過疼痛甩尾儀檢測到的痛閾潛伏期相對造模前顯著縮短，說明造模組右足部進入急性炎癥疼痛階段，提示造模成功。

圖1 造模成功圖

2.4 時間點選擇

ZT表示授時因子(Zeitgeber)，本次實驗中ZT0為開燈時間(7：00)，ZT12即關(guān)燈時間(19：00)。依據(jù)前期相關(guān)實驗研究結(jié)果[5]，本次實驗選用ZT8(15:00)特定時間點進行動物處理。

2.5 動物處理

各組動物在相同時間點進行處理，處理方法如下：

2.5.1 模型+針刺組(下文簡寫作模針組)

操作前先以自制圓桶型固定器固定好動物，然后選用13 mm毫針針刺右側(cè)足三里穴，針刺深度約3 mm，每5 min采用捻轉(zhuǎn)法行針1次，每次行針1 min，頻率為120次/min，共留針30 min。每天1次，連續(xù)處理7天。足三里定位參照《實驗針灸學》[11]，位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨頭下約0.3 cm處的肌溝中。

2.5.2 模型組

在模針組動物接受針刺處理的同一時間內(nèi)，模型組使用同一固定器及同樣的固定方式固定動物30 min，不進行其他處理。

2.5.3 空白組

在模針組動物接受針刺處理的同一時間內(nèi)，空白組使用同一固定器及同樣的固定方式固定動物30 min，不進行其他操作處理。

2.6 取材

在第7天針刺結(jié)束后，采取頸椎脫臼法處死動物，立即取足三里穴區(qū)皮膚及皮下組織(面積約2 mm*2 mm，深度為2-3 mm)，用5 cm*5 cm的錫箔紙包裝好后立即置于-80℃液氮瓶中冰凍儲存。

2.7 指標檢測

P2X7-/-小鼠穴區(qū)成纖維細胞p38MAPK基因的表達：提取樣本總RNA后，進行除去反應(yīng)(表1)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(表2)。本研究所用引物及堿基序列如下所示(表3)：

表1 DNA去除反應(yīng)體系

表2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

表3 本次檢測所用引物及堿基序列

實時熒光定量PCR反應(yīng)(表4、表5)結(jié)束后進行計算分析，使用Thermo Scientific PikoReal軟件(Thermo公司)分析PCR過程各檢測樣本的Ct(Threshold cycle)值。本實驗通過2-ΔΔCT計算X相對mRNA表達水平 ：ΔCTintervention= CTintervention 目 的 -CTintervention內(nèi)參，ΔCTblank=CTblank目的-CT blank-內(nèi)參，ΔΔCT=ΔCT intervention-ΔCT blank，XmRNA表達差別倍數(shù)以2-ΔΔCT表示。

表4 PCR反應(yīng)體系

表5 PCR反應(yīng)程序

P2X7-/-小鼠穴區(qū)成纖維細胞p38MAPK蛋白的表達：提取穴區(qū)皮膚組織樣本后，采用BCA法測定樣本蛋白濃度，將完成轉(zhuǎn)膜、封閉后的PVDF膜放入一抗中，(一抗?jié)舛龋篜38 1:2000；β-actin 1:5000)，4℃孵育過夜，用TBST將PVDF膜洗3次，每次5 min；然后放入二抗(稀釋濃度：1∶5000)中，室溫孵育2-3 h；用TBST將PVDF膜洗3次，每次10 min。而后使用ECL發(fā)光試劑盒將A、B兩種發(fā)光液進行等體積混合，然后均勻的滴至膜上，反應(yīng)1 min后去殘液，進行曝光。最后進行圖像解析，結(jié)果表示為目標蛋白的相對表達量。

2.8 統(tǒng)計方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以±s表示，多樣本均數(shù)間比較采用One-Way ANOVA檢驗，方差齊則采用LSD檢驗，方差不齊則采用Tamhane’s T2檢驗，檢驗結(jié)果以P＜0.05時認為其組間差異有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 擇時針刺后P2X7-/-小鼠穴區(qū)成纖維細胞p38MAPK基因的表達

模型組小鼠穴位皮膚及皮下組織中p38MAPK基因與空白組相比，其表達升高，有統(tǒng)計學意義，P＜0.05；與模型組相比，模針組小鼠穴位皮膚及皮下組織中p38MAPK基因表達降低，有統(tǒng)計學意義，P＜0.05(表6、圖2)。

圖2 A：p38MAPK擴增曲線圖；B：p38MAPK溶解曲線圖

表6 P2X7-/-小鼠穴位皮膚及皮下組織中p38MAPK mRNA的表達變化(±s)

表6 P2X7-/-小鼠穴位皮膚及皮下組織中p38MAPK mRNA的表達變化(±s)

注：模型組對比空白組，#P＜0.05，模針組對比模型組，*P＜0.05。

組別空白組模型組模針組樣本數(shù)量(例)6 6 6 2-ΔΔCT(基因表達值)1.043±0.357 3.497±1.497#1.290±0.846*

3.2 擇時針刺后P2X7-/-小鼠穴區(qū)成纖維細胞p38MAPK蛋白的表達

模型組小鼠皮膚組織中P38蛋白較空白組，表達明顯升高，存在顯著統(tǒng)計學差異，P＜0.01；與模型組相比，模針組小鼠皮膚組織中P38蛋白表達量降低，有顯著統(tǒng)計學意義，P＜0.05(表7、圖3)。

表7 各實驗組小鼠皮膚組織中P38MAPK蛋白表達量(±s)

表7 各實驗組小鼠皮膚組織中P38MAPK蛋白表達量(±s)

注：模型組與空白組相比，**P＜0.01；模針組與模型組相比，△P＜0.05。

組別空白組模型組模針組送檢標本(例)6 6 6蛋白相對表達量1.0010±0.0510 1.4153±0.3144**1.1151±0.1823△

圖3 足三里穴區(qū)皮膚組織中p38MAPK蛋白表達量

4 討論

針刺效應(yīng)具有時間特異性，不同時間點針刺所產(chǎn)生的臨床療效不同。在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就已經(jīng)提出了針刺須“逢時候氣”，《靈樞·四時氣》篇指出“四時之氣，各有所在”，即季節(jié)有異，“灸刺之道，得氣穴為定”，故而針刺方法也應(yīng)有所不同。在現(xiàn)代臨床研究中，也運用了許多擇時針刺的治療方法，并取得良好的療效。在治療經(jīng)前期綜合征中，梁潔莎等[12]將子午流注開穴法與中藥結(jié)合，取得顯著療效；在治療IBS-D中，研究者[13]采用飛騰八法定時取穴，與常規(guī)取穴針刺組比較，發(fā)現(xiàn)其療效更優(yōu)，并更大程度上改善了患者生活質(zhì)量；在觀察腦卒中后晝間嗜睡的遠期療效中，研究人員[14]發(fā)現(xiàn)醒腦開竅法聯(lián)合靈龜八法針刺治療，結(jié)果與對照組相比更具優(yōu)勢。同時，我們也觀察到針刺鎮(zhèn)痛具有一定的時相特征，沈曉煒[15]在ZT0(07：00)到ZT20(03：00)時間段內(nèi)等分的6個時間點中，分別針刺炎性疼痛模型大鼠足三里穴，實驗發(fā)現(xiàn)針刺后大鼠痛閾值皆出現(xiàn)上升，但反應(yīng)強弱存在時間差異，其反應(yīng)曲線呈現(xiàn)單峰一谷結(jié)構(gòu)，在ZT8(15：00)時間點所表現(xiàn)的經(jīng)穴反應(yīng)性最佳，而ZT16(23：00)時間點反應(yīng)最差。

在前期研究中，我們通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，ZT8時間點針刺炎性疼痛模型下的野生型小鼠，其穴區(qū)成纖維細胞排列的形態(tài)更加規(guī)整[6]，細胞骨架重構(gòu)明顯，橫截面積增大，均勻分布在細胞核四周，細胞間骨架交織成網(wǎng)狀，穴區(qū)維持細胞形態(tài)的骨架蛋白F-actin及微管蛋白β-tubulin的表達明顯高于空白組和模型組；而P2X7-/-小鼠各組成纖維細胞排列變化不大，細胞骨架重構(gòu)不明顯，F(xiàn)-actin、β-tubulin的表達遠遠不及野生型小鼠，成纖維細胞分布的數(shù)量也更少，這可能與P2X7受體的缺失有關(guān)。因此，擇時針刺對穴區(qū)成纖維細胞骨架的重構(gòu)可能與細胞膜上P2X7受體密切相關(guān)。

為了進一步觀察該受體是如何發(fā)揮作用的，我們聚焦于MAPK相關(guān)信號通路。MAPK是一組廣泛分布的絲/蘇氨酸蛋白激酶，p38MAPK被認為是細胞骨架穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)因子［16,17]。倪永梁[18]研究證實調(diào)亡蛋白Bax和cleaved-caspase 3誘導(dǎo)足細胞的凋亡與P38蛋白磷酸化的上調(diào)有關(guān)，并且P38蛋白磷酸化參與下調(diào)骨架調(diào)節(jié)蛋白synaptopodin表達來引起F-actin細胞骨架改變。P38MAPK還與口腔內(nèi)成纖維細胞機械力的跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其內(nèi)部壓力值變化有關(guān)[19]。細胞形態(tài)變化和骨架重構(gòu)是局部組織響應(yīng)外界作用力的重要環(huán)節(jié)，也是穴區(qū)響應(yīng)針刺信號的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，p38MAPK在其中扮演重要角色。我們前期研究亦發(fā)現(xiàn)，針刺對穴區(qū)p38MAPK表達量有明顯的調(diào)節(jié)作用[6]。因此，本實驗提出假設(shè)，P2X7受體可能是通過p38MAPK信號通路介導(dǎo)擇時針刺對成纖維細胞骨架的重構(gòu)。實驗結(jié)果顯示，在P2X7-/-小鼠上建立炎性疼痛模型，選擇ZT8(15：00)針刺后測定穴區(qū)p38MAPK的mRNA和蛋白表達量，模型組小鼠p38MAPK蛋白表達量相對空白組升高，模針組小鼠皮膚組織中p38MAPK蛋白表達量相對于模型組降低。P38MAPK信號通路是介導(dǎo)細胞力信號傳導(dǎo)的重要途徑，可因一些炎性細胞因子及局部滲透壓改變等激活，故模型組p38MAPK表達明顯上升。已有研究表明[20]，針刺可通過抑制皮膚組織p38MAPK的表達來阻止膠原裂變及細胞外基質(zhì)成分降解而起到抗皮膚衰老的作用，p38MAPK又是細胞骨架穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)因子，因此模針組p38MAPK表達的降低可能與針刺后穴區(qū)成纖維細胞骨架的重構(gòu)密切相關(guān)。結(jié)合前期野生型小鼠針刺后p38MAPK的mRNA和蛋白表達量變化[6]來看，本次敲除P2X7受體基因后，擇時針刺信號對p38MAPK表達的影響仍然存在，與針刺野生型小鼠產(chǎn)生的變化一致。由此可知，在擇時針刺影響成纖維細胞骨架重構(gòu)的效應(yīng)中，P2X7受體并非通過對p38MAPK的調(diào)整以發(fā)揮作用，或者說不單純由此通路介導(dǎo)產(chǎn)生，可能還與局部骨架蛋白表達相關(guān)信號分子HSP27、P-Op18/stathmin等含量變化有關(guān)[21]。

本次研究選擇將基因敲除小鼠作為研究對象，觀察擇時針刺時，穴區(qū)成纖維細胞形態(tài)改變與P2X7受體對p38MAPK表達影響的關(guān)系，研究結(jié)果有助于闡釋擇時針刺的穴位局部啟動效應(yīng)及機制。今后我們將繼續(xù)關(guān)注擇時針刺后穴區(qū)成纖維細胞形變的下游信號并開展深入，以期更好的揭示擇時針刺的穴位局部啟動機制。