王寶屯， 顏遠(yuǎn)義， 毛 燦， 馮 娟， 鄧益琴， 蘇友祿,3*

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心， 上海 201306； 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所∥農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510300； 3. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院健康養(yǎng)殖創(chuàng)新研究院， 廣州 510225； 4. 廣東省畜牧技術(shù)推廣總站， 廣州 510500)

維氏氣單胞菌(Aeromonasvernoii)在水環(huán)境中普遍存在，是一種人、獸、水生動(dòng)物共患病菌，夏秋季節(jié)繁殖速度快，會(huì)引起宿主胃腸道、傷口及軟組織感染，導(dǎo)致敗血癥[1].維氏氣單胞菌能夠感染包括草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)[2]和大黃魚(yú)(Pseudosciaenacrocea)[3]等多種養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，給水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)較大危害.魚(yú)用疫苗包括滅活疫苗和減毒疫苗等.近年來(lái)，有關(guān)維氏氣單胞菌疫苗在鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)[4]中已有報(bào)道，具有較好的保護(hù)作用，但目前魚(yú)用疫苗從研發(fā)到成功獲得生產(chǎn)批文難度較大.使用抗生素仍是目前對(duì)抗養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)維氏氣單胞菌感染的有效方式，然而使用抗生素會(huì)帶來(lái)一系列的負(fù)面問(wèn)題：(1)病原菌會(huì)對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療效果變差[5]；(2)抑制水體益生菌生長(zhǎng)，進(jìn)而影響整個(gè)水環(huán)境的生態(tài)平衡；(3)抗生素被水產(chǎn)動(dòng)物吸收后，部分抗生素會(huì)殘留體內(nèi)，造成潛在食品安全和公共衛(wèi)生安全[6].

花鱸(Lateolabraxmaculatus)，也指中國(guó)花鱸，俗稱(chēng)海鱸，是我國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的海產(chǎn)魚(yú)之一，年產(chǎn)量超過(guò)15萬(wàn)t. 目前，廣東、山東、浙江和福建等省份已形成規(guī)?；B(yǎng)殖[7]. 廣東省珠海市花鱸養(yǎng)殖面積約20.7 km2，年產(chǎn)量超過(guò)12萬(wàn)t，占全省80%以及全國(guó)50%左右[8]. 而水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的發(fā)生會(huì)影響其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，哈維弧菌(Vibrioharveyi)[9]和殺魚(yú)愛(ài)德華菌(Edwardsiellapiscicidas)[10]等是花鱸的重要病原，對(duì)花鱸造成一定的危害.

水產(chǎn)動(dòng)物病害綠色防控是漁業(yè)產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必然趨勢(shì). 中草藥作為天然藥物，在我國(guó)歷史悠久，具有副作用小、殘留少等優(yōu)點(diǎn)，不僅能防治水產(chǎn)細(xì)菌病害，對(duì)病毒和寄生蟲(chóng)也具有良好的抑菌作用，還能促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育并增強(qiáng)自身免疫力，提高成活率[11-12]. 農(nóng)業(yè)上中草藥可作為殺菌劑防治植物病害[13]，而水產(chǎn)上以中藥為主的動(dòng)物體外殺菌劑開(kāi)發(fā)較少. 目前，已有研究[14]結(jié)果顯示，部分中草藥對(duì)羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)源維氏氣單胞菌具有體外抑菌作用，但仍需評(píng)價(jià)更多的單方及復(fù)方中草藥對(duì)維氏氣單胞菌體外抑菌效果.

本課題組對(duì)花鱸進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，維氏氣單胞菌是花鱸養(yǎng)殖過(guò)程中的重要病原菌，能夠引起花鱸內(nèi)臟腫大、腹腔出血等臨床癥狀[15]. 本研究選取成本低廉的常見(jiàn)綠色中草藥，測(cè)定82種單方中草藥對(duì)花鱸源維氏氣單胞菌體外抑菌作用并設(shè)計(jì)7種復(fù)方組合，初步探究單方及復(fù)方中草藥對(duì)維氏氣單胞菌的體外抑菌效果，旨為后續(xù)篩選抗花鱸維氏氣單胞菌中草藥提供數(shù)據(jù)支撐.

1 材料與方法

1.1 供試中藥、菌株來(lái)源、實(shí)驗(yàn)耗材

維氏氣單胞菌18BJ181分離自廣東省珠海市花鱸養(yǎng)殖場(chǎng). 營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃滅菌后保存. 供試中草藥購(gòu)自廣東省珠海市斗門(mén)區(qū)佰信醫(yī)藥(表1).

1.2 中草藥原液制備

選取成本低廉的常見(jiàn)綠色中草藥，置于60 ℃烘干后粉碎處理，稱(chēng)取100 g單方中草藥，用紗布包裹，置于燒杯中，加入500 mL蒸餾水，室溫浸泡2 h，武火煮沸后轉(zhuǎn)文火煎煮30 min，重復(fù)2次后，將所得藥液合并濃縮至100 mL，即濃縮后中草藥質(zhì)量為1 000 mg/mL，121 ℃高溫滅菌后，置于4 ℃保存?zhèn)溆肹16].

復(fù)方中草藥按照質(zhì)量比1∶1進(jìn)行配比，分別稱(chēng)取中草藥50 g，紗布包裹煮沸2次，合并濃縮濾液至復(fù)方中草藥質(zhì)量為1 000 mg/mL，121 ℃高溫滅菌后，置于4 ℃保存?zhèn)溆?

1.3 維氏氣單胞菌懸液制備

維氏氣單胞菌18BJ181在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)24 h，挑取單菌落于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，28 ℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，用麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)節(jié)菌濃度為1×108cfu/mL，作為實(shí)驗(yàn)菌液.

1.4 藥物敏感性測(cè)定

參照潘吉脈等[17]的方法測(cè)定藥物敏感性，取維氏氣單胞菌懸液0.1 mL，均勻涂板于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，用提前高溫滅菌并冷卻的孔徑為7 mm打孔器打孔，每個(gè)培養(yǎng)基均勻打4個(gè)孔，設(shè)置3組生物學(xué)重復(fù)及1組陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)孔加入0.1 mL中藥原液；28 ℃正置培養(yǎng)24 h，以3個(gè)不同角度測(cè)定抑菌圈直徑. 判斷標(biāo)準(zhǔn)[18]：抑菌圈直徑<10 mm，為低度敏感(+)；抑菌圈直徑10～15 mm，為中度敏感(++)；抑菌圈直徑15～20 mm,為高度敏感(+++)；抑菌圈直徑 >20 mm，為極度敏感(++++)，無(wú)抑菌圈為不敏感(-).

表1 供試中草藥清單Table 1 The list of Chinese herbal medicines in the experiment

1.5 單方中草藥最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)和最小殺菌質(zhì)量濃度(MBC)測(cè)定

參照夏與晴等[16]的方法測(cè)定中草藥對(duì)維氏氣單胞菌的最小抑菌質(zhì)量濃度(Minimum Inhibitory Concentration, MIC). 每種藥物準(zhǔn)備10支12 mL試管，依次編號(hào). 無(wú)菌條件下將藥物在1～8號(hào)管依次2倍稀釋8個(gè)質(zhì)量濃度梯度，1～9管分別加入10 μL菌懸液，即第9管為不加藥只加菌的陽(yáng)性對(duì)照，第10管為不加藥不加菌的陰性對(duì)照，設(shè)置3組生物學(xué)重復(fù)，為了便于觀察，同時(shí)設(shè)置1組不加菌的藥物稀釋組. 28 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，肉眼觀察結(jié)果. 無(wú)菌生長(zhǎng)管澄清透明，藥物最低質(zhì)量濃度管為MIC.

選取MIC左右適宜質(zhì)量濃度涂板，28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察是否長(zhǎng)菌，無(wú)菌生長(zhǎng)的質(zhì)量濃度即為該種藥最小殺菌質(zhì)量濃度(Minimum Bactericidal Concentration, MBC).

1.6 復(fù)方中草藥MIC和MBC的測(cè)定

根據(jù)單方中草藥對(duì)維氏氣單胞菌的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果較好的中藥進(jìn)行復(fù)方試驗(yàn)，測(cè)定不同復(fù)方中草藥對(duì)維氏氣單胞菌的MIC和MBC，具體步驟參照1.5. 根據(jù)彭練慈等[19]方法測(cè)定復(fù)方中草藥聯(lián)合抑菌指數(shù)(Fraction Inhibitory Concentration Index，F(xiàn)ICI)=甲藥聯(lián)合時(shí)MIC/甲藥單獨(dú)時(shí)MIC+乙藥聯(lián)合時(shí)MIC/乙藥單獨(dú)時(shí)MIC. 判定標(biāo)準(zhǔn)：FICI≤0.5，判為協(xié)同作用；0.52，判為拮抗作用.

2 結(jié)果與分析

2.1 82種單方中草藥對(duì)維氏氣單胞菌的體外抑菌效果

維氏氣單胞菌對(duì)36種單方中草藥具有敏感作用，其中維氏氣單胞菌對(duì)烏梅極度敏感(++++)，抑菌圈直徑為21.44 mm；對(duì)蘇木、五倍子、丁香和艾葉高度敏感(+++)，抑菌圈直徑在15～20 mm；對(duì)黃岑等18種中草藥中度敏感(++)，抑菌圈直徑在10～15 mm；對(duì)大黃等13種中草藥低度敏感(+)，抑菌圈直徑小于10 mm(表2). 對(duì)柏子仁(Platycladusorientalis)等46種中草藥不敏感.

表2 單方中草藥對(duì)維氏氣單胞菌體外抑菌效果Table 2 The bacteriostatic effect of single Chinese herbal medicine on A. vernoii in vitro

續(xù)表2

2.2 復(fù)方中草藥對(duì)維氏氣單胞菌的體外抑菌效果

復(fù)方中藥中，維氏氣單胞菌對(duì)烏梅+丁香復(fù)方極度敏感(++++)，其抑菌圈直徑為22.50 mm；對(duì)烏梅+五倍子、五倍子+丁香、蘇木+五倍子、蘇木+丁香和烏梅+蘇木復(fù)方高度敏感(+++)，抑菌圈直徑在15～20 mm；對(duì)艾葉+丁香復(fù)方中度敏感(++)，抑菌圈直徑為14.63 mm(表3).

表3 7種復(fù)方中藥對(duì)維氏氣單胞菌體外抑菌效果Table 3 The bacteriostatic effect of 7 kinds of compound Chinese herbal medicines on A. vernoii in vitro

2.3 單方中草藥對(duì)維氏氣單胞菌MIC和MBC

烏梅、蘇木、黃岑的MIC為15.60 mg/mL，MBC在31.25～62.50 mg/mL；五倍子、分心木、綿茵陳的MIC為31.25 mg/mL，MBC在31.25～62.50 mg/mL；丁香等6種中草藥的MIC為62.50 mg/mL，MBC在62.50～125.00 mg/mL；艾葉等7種中草藥的MIC為125.00 mg/mL，MBC在125.00～500.00 mg/mL；防風(fēng)等4種中草藥的MIC和MBC在250.00～500.00 mg/mL(表4).

2.4 7種復(fù)方中草藥對(duì)維氏氣單胞菌MIC和MBC

不同復(fù)方中草藥對(duì)維氏氣單胞菌的MIC和MBC不盡相同. 烏梅+五倍子和烏梅+丁香復(fù)方抑菌效果較好，MIC為15.60 mg/mL，MBC在32.25～62.50 mg/mL，2種復(fù)方組合的聯(lián)合抑菌指數(shù)(FICI)在1～2之間，二者相互作用為無(wú)關(guān)效應(yīng)；烏梅+蘇木、蘇木+五倍子、五倍子+丁香和艾葉+丁香復(fù)方MIC為31.25 mg/mL，MBC在62.50～125.00 mg/mL；前2種復(fù)方組合相互之間為拮抗效應(yīng)，五倍子+丁香復(fù)方組合為無(wú)關(guān)效應(yīng)，艾葉+丁香復(fù)方為相加效應(yīng)；蘇木+丁香復(fù)方的MIC為62.50 mg/mL，MBC為125.00 mg/mL，二者之間為拮抗效應(yīng)(表5).

表4 單方中藥對(duì)維氏氣單胞菌最小抑菌濃度和最小殺菌濃度Table 4 The minimum bacteriostatic concentration and minimum bactericidal concentration of single Chinese medicines on A. vernoii

表5 復(fù)方中草藥對(duì)維氏氣單胞菌最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度

3 討論

中草藥在水產(chǎn)病害防控領(lǐng)域應(yīng)用范圍越來(lái)越廣，具有“綠色防控”水產(chǎn)病害的作用. 目前，中草藥對(duì)不同來(lái)源維氏氣單胞菌的體外抑菌實(shí)驗(yàn)已有研究. 細(xì)菌對(duì)藥物的敏感程度和藥物抑菌和殺菌效果可能與藥物中活性成分有關(guān). 細(xì)胞膜是細(xì)菌的屏障，對(duì)細(xì)菌具有保護(hù)作用，當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜被破壞時(shí)，細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)菌內(nèi)部電解質(zhì)外漏，培養(yǎng)液的電導(dǎo)率增強(qiáng).

烏梅提取物能夠增強(qiáng)細(xì)菌電導(dǎo)率，可能是烏梅提取物能破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，增強(qiáng)其通透性，電解質(zhì)溶液外泄，電導(dǎo)率升高，胞外蛋白濃度增強(qiáng)，細(xì)菌失去其本身代謝和增殖活性[20]. 烏梅水提液對(duì)嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophilia)、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)抑菌效果較好，乙醇提取物對(duì)假單胞菌(Pseudomonas)和蠟樣芽孢桿菌最小抑菌濃度為2.5～5.5 mg/mL[16,21]，推測(cè)烏梅中總酸度可能是影響抑菌作用方面之一. 在60 min, 超聲頻率100 kHz，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇：料液比為1(g)∶25(mL)的條件下，有機(jī)酸產(chǎn)出比率較高，為12.17%，對(duì)金黃色葡萄球菌(StaphylococcusAureus)和四鏈球菌(Micrococcustetragenus)等具有明顯的抑菌作用[22].

蘇木是傳統(tǒng)活血化瘀中藥，其活性成分蘇木酮A(sappanone A)作用神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞靶蛋白IMPDH2的140位半胱氨酸位點(diǎn)，誘導(dǎo)其失活，進(jìn)而抑制下游NF-kB等炎性信號(hào)通路，起到抗炎作用[23]. 蘇木中分離的化合物蘇木精(Brazilin)、3-去氧蘇木酮(3-Deoxysappanone B)等對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)具有較強(qiáng)抑菌作用，蘇木精與氨基糖苷類(lèi)抗生素聯(lián)合時(shí)對(duì)MRSA有協(xié)同作用，3-去氧蘇木酮與慶大霉素聯(lián)用呈現(xiàn)協(xié)同作用[24]. 五倍子對(duì)黃顙魚(yú)維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌具有良好的體外抑菌效果[25]，富含五倍子單寧、酚類(lèi)、鞣質(zhì)、沒(méi)食子酸等多種化合物，其甲醇提取物對(duì)大腸桿菌具有抑制作用，鞣質(zhì)使細(xì)菌體內(nèi)多種酶凝固，進(jìn)而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)[26-27]. 與上述研究結(jié)果類(lèi)似，本研究中烏梅、蘇木、五倍子水提液對(duì)花鱸維氏氣單胞菌具有較好的體外抑菌作用，推測(cè)可能是烏梅中的有機(jī)酸破壞細(xì)菌細(xì)胞膜進(jìn)而影響細(xì)菌的代謝和增殖，蘇木中某些化合物和五倍子中鞣質(zhì)、沒(méi)食子酸類(lèi)等物質(zhì)對(duì)體外抑菌效果發(fā)揮主要作用.

2種單方藥組成的復(fù)方中藥成分相對(duì)單一，可以通過(guò)藥材均勻配比制備成供試樣品[28]. 合理的設(shè)計(jì)復(fù)方中草藥配伍可起到“協(xié)同”作用，增強(qiáng)中草藥體外抑菌及殺菌效果. 在復(fù)方設(shè)計(jì)時(shí)，其種類(lèi)及配比的不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能會(huì)造成一定的差異. 地榆+鹿銜草和地榆+姜厚樸(Magnoliaofficinalis)的復(fù)方組合對(duì)黃顙魚(yú)維氏氣單胞菌抑菌及殺菌不如地榆單方效果，2種復(fù)方組合MIC分別為15.60 mg/mL和31.25 mg/mL，MBC為125.00 mg/mL[29]. 本研究中烏梅+五倍子、烏梅+丁香復(fù)方組合對(duì)維氏氣單胞菌體外抑菌和殺菌效果較好，MIC為15.60 mg/mL，MBC在15.60～31.25 mg/mL之間，除藥物中的有效成分，中草藥的煎煮方法，貯藏方式、產(chǎn)地等因素也會(huì)影響中草藥藥效的發(fā)揮.

中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用較為廣泛，具有天然、無(wú)毒、廉價(jià)、對(duì)魚(yú)類(lèi)和環(huán)境副作用小等優(yōu)勢(shì)，其可以添加到水環(huán)境中改善水質(zhì)，也可以飼料添加劑提高水產(chǎn)動(dòng)物免疫及抗病能力，激發(fā)魚(yú)體非特異性的溶菌素等產(chǎn)生，從而增強(qiáng)魚(yú)體非特異性免疫，對(duì)魚(yú)體生長(zhǎng)、免疫及抗病具有積極作用[30]. 水產(chǎn)養(yǎng)殖常見(jiàn)的飼料添加劑有大蒜(Alliumsativum)、蘆薈(Aloevera)和黃芪(Astragalusmembranaceus)等，在分子水平上研究中草藥的免疫激活作用已備受關(guān)注[31].有研究[32]發(fā)現(xiàn)，蘇木提取物對(duì)金魚(yú)(Carassiusauratus)具有較強(qiáng)的驅(qū)蟲(chóng)作用，且安全性好.石榴皮(Punicagranatum)和分心木(Juglansregia)中草藥提取物能提高羅非魚(yú)和鯉魚(yú)的生長(zhǎng)能力，同時(shí)增強(qiáng)對(duì)嗜水氣單胞菌的抗菌作用[33-34].《中華人民共和國(guó)獸藥典》頒布允許使用大黃五倍子散、清熱散等多種中藥應(yīng)用于臨床領(lǐng)域，對(duì)于烏梅等體外抑菌效果較好的中草藥是否可以開(kāi)發(fā)為臨床獸藥，仍需要系列的深入探究.

4 結(jié)論

在所測(cè)定的82種中草藥中，僅38種對(duì)維氏氣單胞菌呈現(xiàn)出一定的體外抑菌作用，烏梅、蘇木、五倍子、丁香和艾葉的抑菌作用較強(qiáng). 雖然復(fù)方組合中烏梅+五倍子和烏梅+丁香對(duì)維氏氣單胞菌抑菌和殺菌效果較好，但聯(lián)合抑菌指數(shù)分析顯示它們呈現(xiàn)無(wú)關(guān)作用. 本研究結(jié)果表明：?jiǎn)畏街胁菟帪趺泛吞K木水提液對(duì)花鱸源維氏氣單胞菌均具有較好的體外抑菌和殺菌效果，可為后續(xù)的水產(chǎn)中藥開(kāi)發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支撐.