SNAP94847經(jīng)腹側(cè)被蓋區(qū)至迷走神經(jīng)背側(cè)運(yùn)動(dòng)核對(duì)焦慮大鼠胃黏膜損傷作用研究*

李顏君，郭菲菲，張娜娜，李俊姝，姚守恒，任 翔，王怡茹，馬鑫奇，尚高昊，劉 華

（1青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，山東青島266071；2菏澤醫(yī)學(xué)專(zhuān)科學(xué)校護(hù)理系，山東菏澤274000；3青島大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，山東青島266003；4青島大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東青島266003；5青島大學(xué)青島醫(yī)學(xué)院，山東青島266000）

應(yīng)激所致的焦慮可引起機(jī)體自主神經(jīng)功能紊亂，并伴有驚厥、不自主震顫及肌肉緊張等現(xiàn)象［1］，其中胃腸道不良反應(yīng)尤為常見(jiàn)［2］。通過(guò)構(gòu)建多種焦慮疾病動(dòng)物模型，可進(jìn)一步探究該癥狀背后涉及的各種調(diào)控機(jī)制，例如，慢性輕度應(yīng)激［3］和高架十字迷宮（elevated plus maze，EPM）［4］誘導(dǎo)型焦慮、強(qiáng)迫游泳［5］誘導(dǎo)型焦慮及慢性束縛應(yīng)激［6］等。本研究采用慢性束縛應(yīng)激構(gòu)建大鼠焦慮模型，進(jìn)而探究大鼠焦慮潛在生理調(diào)控途徑。

腹側(cè)被蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTA）與焦慮等情緒反應(yīng)行為及其調(diào)控密切相關(guān)［7］，而多巴胺（dopamine，DA）也是一種壓力或應(yīng)激調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)［8］。有研究證實(shí)，首次面對(duì)外界壓力，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物VTA內(nèi)DA神經(jīng)元的興奮性表現(xiàn)為顯著增強(qiáng)，且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物若反復(fù)暴露于各種壓力源，即面對(duì)外界慢性持續(xù)性應(yīng)激刺激，可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物局部小膠質(zhì)細(xì)胞活化［9-10］，表明VTA內(nèi)DA神經(jīng)元與焦慮情緒及其影響密切相關(guān)，但目前對(duì)焦慮樣行為產(chǎn)生的具體機(jī)制尚未明確。

解剖學(xué)及神經(jīng)化學(xué)研究表明，黑色素濃集激素（melanin-concentrating hormone，MCH）系統(tǒng)參與情緒和應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)［11］。現(xiàn)已證實(shí)VTA內(nèi)廣泛分布MCH受體（MCH receptor，MCHR）［12］。迷走神經(jīng)背側(cè)運(yùn)動(dòng)核（dorsal motor nucleus of vagus nerve，DMV）是中樞與胃部等內(nèi)臟建立神經(jīng)聯(lián)系的重要核團(tuán)，進(jìn)而通過(guò)神經(jīng)-體液調(diào)控系統(tǒng)，參與胃腸道、心血管及內(nèi)分泌等生理功能［13］。本研究將進(jìn)一步探討VTA與DMV間是否存在MCHR神經(jīng)聯(lián)系，以及該通路是否涉及應(yīng)激損傷及抗應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控。

焦慮及應(yīng)激程度與炎癥標(biāo)志物，如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）等呈正相關(guān)關(guān)系［14-15］。此外，有研究證實(shí)MCHR1拮抗劑SNAP94847可減弱強(qiáng)迫游泳或EPM所致的應(yīng)激反應(yīng)［16-17］。目前尚不清楚外源性MCH及MCHR1拮抗劑SNAP94847對(duì)VTA內(nèi)DA神經(jīng)元的調(diào)控是否參與應(yīng)激相關(guān)過(guò)程調(diào)控及其潛在機(jī)制，以及VTA-DMV神經(jīng)通路是否參與其中。本實(shí)驗(yàn)旨在觀(guān)察VTA內(nèi)SNAP94847對(duì)大鼠DA神經(jīng)元放電活動(dòng)、胃黏膜損傷和炎癥標(biāo)志物水平變化及焦慮樣行為的影響，同時(shí)探究VTA-DMV神經(jīng)通路對(duì)其是否具有調(diào)控作用，以期為應(yīng)激所致焦慮反應(yīng)的中樞神經(jīng)調(diào)控機(jī)制提供參考資料。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠130只，5～7周齡，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（編號(hào)0013398）。大鼠分別安置于獨(dú)立籠中，動(dòng)物房?jī)?nèi)保持（25±2）℃恒溫，相對(duì)濕度為60%±5%，晝夜循環(huán)光照（12 h∶12 h），大鼠不限飲水進(jìn)食。每次實(shí)驗(yàn)前期24 h大鼠禁食，但自由飲水，實(shí)驗(yàn)前2 h禁水。大鼠所有飼養(yǎng)程序及實(shí)驗(yàn)方法均遵循《青島大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和和使用管理方法》，且經(jīng)青島大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

SN-3腦立體定位儀（Narashige）；電生理記錄儀（中國(guó)成都儀器廠(chǎng)）；MEZ8201型微電極放大器（Ni‐hon Kohden）；VC-11雙道示波器（Nihon Kohden）。

抗MCHR1抗體（Jackson ImmunoResearch）；Cy3-標(biāo)記IgG抗體（Abcam）；防淬滅油（Citifluor）；熒光金（fluorescent gold，F(xiàn)G）、MCH、SNAP94847、滂胺天藍(lán)及乙酸鈉均購(gòu)于Sigma-Aldrich；水合氯醛和硫代巴比妥鈉均購(gòu)于中國(guó)北京化學(xué)試劑公司。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 實(shí)驗(yàn)分組（1）采用熒光金逆行追蹤結(jié)合免疫熒光組織化學(xué)染色法，隨機(jī)選取10只大鼠，DMV注射熒光金，觀(guān)察VTA-DMV之間是否存在神經(jīng)纖維投射及VTA中熒光金及MCHR1免疫陽(yáng)性神經(jīng)元的分布。（2）采用單細(xì)胞外放電記錄法，隨機(jī)各選取30只正常大鼠和30只焦慮模型大鼠，VTA微量注射N(xiāo)S、MCH或SNAP94847，觀(guān)察對(duì)VTA中DA神經(jīng)元放電活動(dòng)的影響。（4）采用EPM實(shí)驗(yàn)，觀(guān)察大鼠VTA微量注射N(xiāo)S或SNAP94847后，大鼠焦慮樣行為的變化。隨機(jī)選取6只正常大鼠和12只焦慮模型大鼠，分為3組（n=6）：正常大鼠+0.5μL生理鹽水（normal saline，NS）組、焦慮大鼠+0.5μL NS組和焦慮大鼠+6μg SNAP94847組。（4）通過(guò)向大鼠VTA微量注射N(xiāo)S或SNAP94847，觀(guān)察大鼠胃黏膜炎癥損傷及相關(guān)炎癥指標(biāo)水平變化。隨機(jī)選取6只正常大鼠和12只焦慮模型大鼠，分為3組（n=6）：正常大鼠+0.5μL NS組、焦慮大鼠+0.5μL NS組和焦慮大鼠+6μg SNAP94847組。（5）電損毀DMV后，向焦慮大鼠VTA微量注射N(xiāo)S或SNAP94847，觀(guān)察大鼠胃黏膜相關(guān)炎癥指標(biāo)水平變化。取24只焦慮模型大鼠，預(yù)先在VTA微量注射SNAP94847，隨機(jī)分為4組（n=6）：假損毀+NS組、假損毀+SNAP94847組、電損毀+NS組和電損毀+SNAP94847組。

3.2 熒光金逆行追蹤及免疫熒光組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

采用腹腔注射硫代巴比妥醇（100 mg/kg）方法麻醉大鼠，固定在立體定位儀上。將0.2μL 3%（W/V）的熒光金注射至DMV中。7 d后，用硫代巴比妥醇（100 mg/kg）令大鼠麻醉并斷頭。經(jīng)心臟200 mL NS快速灌注，后以200 mL 4%多聚甲醛灌注固定。取腦在4%多聚甲醛中后固定2 h，然后在30%蔗糖溶液中保存2～3 d（4℃）。大鼠腦組織連以冰凍切片機(jī)冠狀切片，片厚15μm。放于?20℃冰箱避光凍存所有切片。選取VTA部位的切片于室溫，顯微鏡下觀(guān)察注射位置，位置不準(zhǔn)確者棄去不用。PBS溶液洗滌3次，加入正常羊血清（10%）封閉非特異性抗原，加入兔抗MCHR1抗體（1∶300），4℃避光孵育過(guò)夜；加入Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶500），室溫下避光孵育2 h。省略Ⅰ抗作為陰性對(duì)照確保免疫組織化學(xué)染色準(zhǔn)確及特異性。最后，用PBS洗去未結(jié)合的Ⅱ抗，并用防淬滅油封固切片。通過(guò)BX50顯微鏡和DP50數(shù)碼相機(jī)觀(guān)察VTA熒光金分布及MCHR1表達(dá)。

3.3 腦部置管手術(shù) 術(shù)前24 h大鼠禁食，以腹腔注射硫代巴比妥醇（100 mg/kg）麻醉，并以腦立體定位儀固定。頭部行正中切口，參照大鼠腦圖譜［17］，將帶有內(nèi)芯的不銹鋼套管（26號(hào)，15μm）植入VTA（前囟后5.2 mm，旁開(kāi)1.0 mm，顱骨下8.0 mm），并通過(guò)10 cm長(zhǎng)的聚乙烯管連接到注射器。術(shù)后連續(xù)3 d腹腔注射8×104U青霉素防止感染，使大鼠恢復(fù)至少7 d再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后注射0.5μL滂胺天藍(lán)以驗(yàn)證置管位置準(zhǔn)確性。

3.4 電生理實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食24 h，腹腔注射硫代巴比妥醇（100 mg/kg）麻醉，后置于腦立體定位儀上。根據(jù)大鼠腦圖譜定位VTA（前囟后5.2 mm，旁開(kāi)1.0 mm，顱骨下8.0 mm）。牙科鉆鉆透顱骨并挑破硬腦膜。將四管玻璃微電極（尖端總直徑3～10μm，電阻5～20 MΩ）液壓推置VTA內(nèi)記錄單個(gè)神經(jīng)元放電：其中，一管充有2%滂胺天藍(lán)和0.5 mol/L乙酸鈉，為記錄電極。另外三管連接到三通道壓力注射器，分別充以NS、MCH（200 nmol/L）和MCHR1拮抗劑SNAP94847（800 nmol/L）。通過(guò)短脈沖氣體壓力（1 500 ms，5.0～15.0 psi）將藥物噴灑到細(xì)胞表面。將微電極送至VTA后，經(jīng)MEZ8201型微電極放大器將記錄的電信號(hào)輸入VC-11雙道示波器，放電頻率的處理與分析以SUMP-PC生物信號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行。

本研究所記錄的VTA內(nèi)DA神經(jīng)元，具顯著負(fù)相雙相動(dòng)作電位，且激發(fā)率相對(duì)緩慢（1～9 Hz），特點(diǎn)為具有不規(guī)則的單一尖峰或爆發(fā)模式中出現(xiàn)尖峰［18-19］。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠經(jīng)心灌注固定、取腦，做冠狀腦切片，實(shí)驗(yàn)后觀(guān)察記錄電極標(biāo)記的位置，棄去位置不準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

3.5 焦慮大鼠模型制備及EPM實(shí)驗(yàn) 本研究采用慢性束縛應(yīng)激構(gòu)建大鼠焦慮模型，進(jìn)而探究大鼠焦慮潛在生理調(diào)控途徑。根據(jù)Tang等［20］研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道，對(duì)焦慮模型大鼠給予14 d慢性束縛應(yīng)激，在每天9：00～11：00之間進(jìn)行束縛2 h。14 d后使用由十字交叉的開(kāi)放臂與閉合臂構(gòu)成的EPM，實(shí)驗(yàn)室保持恒定熒光燈照射，保持安靜且室溫恒定15℃。測(cè)試前30 min大鼠腦部注射藥物，將其置于60 cm×60 cm×35 cm開(kāi)放箱體內(nèi)自由活動(dòng)5 min，后迅速置于中央平臺(tái)且使之頭部正對(duì)同一閉合臂，記錄5 min內(nèi)大鼠活動(dòng)指標(biāo)：進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)（open entry，OE；以4爪均入臂內(nèi)為準(zhǔn)）、進(jìn)入開(kāi)放臂時(shí)間（open time，OT）、進(jìn)入閉合臂次數(shù)（closed entry，CE；以4爪均入臂內(nèi)為準(zhǔn)）和進(jìn)入閉合臂時(shí)間（closed time，CT）。開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)百分比（OE%）=OE/（OE+CE）×100%，開(kāi)臂滯留時(shí)間百分比（OT%）=OT/（OT+CT）×100%。

3.6 胃黏膜炎癥損傷實(shí)驗(yàn)

3.6.1 VTA藥物注射 焦慮模型大鼠均給予14 d慢性束縛應(yīng)激，在每天9：00～11：00之間進(jìn)行束縛2 h，焦慮+給藥組大鼠在束縛開(kāi)始前30 min通過(guò)腦核團(tuán)置管注射0.5μL NS或6μg SNAP94847，正常對(duì)照組大鼠通過(guò)腦核團(tuán)置管注射0.5μL NS。14 d后，大鼠腹腔注射硫代巴比妥醇（100 mg/kg）麻醉，通過(guò)左心室灌注固定。用細(xì)線(xiàn)分別結(jié)扎胃的賁門(mén)和幽門(mén)，然后立即取出，并以1%甲醛溶液固定30 min。沿胃大彎將胃剪開(kāi)并用生理鹽水洗滌，觀(guān)察胃黏膜炎癥損傷程度。胃組織以卡諾氏液固定后，用石蠟滲透組織，并切成5μm厚切片，下一步以阿爾新藍(lán)（Alcian blue，AB）-高碘酸-希夫（periodic acid-Schiff，PAS）染色（pH 2.5）。肉眼觀(guān)察胃黏膜損傷程度，并在光學(xué)顯微鏡（×200）下觀(guān)察中性黏液物質(zhì)分泌水平，以XTFenXi 4.0圖像分析儀統(tǒng)計(jì)測(cè)定胃黏膜PAS染色黏膜物質(zhì)的面積百分比［21］。在對(duì)大鼠胃部潰瘍進(jìn)行評(píng)估的同時(shí)，刮取胃黏膜組織，制備10%組織勻漿，離心（4℃，1 000×g）10 min，吸取上清液，用于檢測(cè)過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）和髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性，以及谷胱甘肽過(guò)氧化物 酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和 丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）含量變化，其中采用碘量法測(cè)定CAT活性，采用氧化還原反應(yīng)法測(cè)定MPO活性，采用二硫代雙硝基苯甲酸比色法測(cè)定GSH-Px的含量，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定胃黏膜組織MDA的含量；取大鼠尾靜脈血，采用酶聯(lián)免疫吸附法，檢測(cè)血漿中TNF-α及IL-6含量變化。

3.6.2 電損毀DMV實(shí)驗(yàn) 大鼠禁食24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，麻醉采用腹腔注射硫代巴比妥醇（100 mg/kg）的方式，腦立體定位儀上固定，根據(jù)大鼠腦圖譜定位DMV（前囟后13.6 mm，旁開(kāi)0.7 mm，深8.3 mm）。雙側(cè)DMV均電損毀，電流強(qiáng)度2.4 mA，頻率50 Hz，持續(xù)時(shí)長(zhǎng)6 s，且重復(fù)3次。假損毀組（sham lesion）作為對(duì)照組只置入電極不通電。術(shù)后將大鼠單獨(dú)籠養(yǎng)，使其恢復(fù)至少3 d再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將大鼠進(jìn)行14 d慢性束縛應(yīng)激，14 d后大鼠腹腔注射硫代巴比妥醇（100 mg/kg）麻醉，大鼠VTA腦核團(tuán)置管注射6μg SNAP94847，對(duì)照組及焦慮組大鼠通過(guò)腦核團(tuán)置管注射0.5μL NS。30 min后，刮取胃黏膜組織，制備10%組織勻漿，4℃、1 000×g離心10 min，吸取上清液，用于檢測(cè)CAT和MPO活性及GSH-Px和MDA含量的變化；取大鼠尾靜脈血，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血漿中TNF-α及IL-6含量變化。

3.7 組織學(xué)檢驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠腹腔注射硫代巴比妥醇（100 mg/kg）麻醉，經(jīng)心臟以4%甲醛溶液灌注規(guī)定。取大鼠腦于4%甲醛后固定2 d。腦組織以50μm冠狀切片，光學(xué)顯微鏡下驗(yàn)證電極記錄及電損毀位置是否準(zhǔn)確，排除定位不準(zhǔn)確的相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS18.0和Prism 6.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）。兩個(gè)獨(dú)立樣本組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；多組間均數(shù)差異采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差分析后各組均數(shù)間兩兩比較采用q檢驗(yàn)（SNK法）。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 VTA-DMV內(nèi)MCHR1免疫陽(yáng)性神經(jīng)纖維投射

大鼠一側(cè)DMV微量注射熒光金，7 d后鏡下可見(jiàn)同側(cè)VTA內(nèi)有熒光金標(biāo)記的神經(jīng)元（圖1A）。同一切片行抗MCHR1熒光免疫組化染色，鏡下可見(jiàn)VTA內(nèi)有MCHR1免疫陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞（圖1B），且部分熒光金標(biāo)記的神經(jīng)元也呈現(xiàn)MCHR1免疫陽(yáng)性表達(dá)（圖1C）。

2 SNAP94847對(duì)正常及焦慮大鼠VTA內(nèi)DA神經(jīng)元放電活動(dòng)的影響

Figure 1.The MCHR1 nerve fiber projection of ventral tegmental area（VTA）-dorsal motor nucleus of vagus nerve（DMV）.A：there were fluorescent gold（FG）-labeled neurons in VTA；B：MCHR1 immunoreactive neurons in VTA；C：some FG-labeled and MCHR1 immunoreactive neurons in VTA；D：the red part indicated the location of VTA in rat brain atlas.The scale bars in the upper and lower images of A to Care 200μmand 50μm，respectively.圖1 VTA-DMV的MCHR1神經(jīng)纖維投射

30只正常大鼠VTA共鑒定出42個(gè)DA神經(jīng)元，微量注射MCH后，其中17個(gè)DA神經(jīng)元放電頻率顯著增加，增幅為（62.5±4.3）%（P<0.01，圖2A、E）；25個(gè)DA神經(jīng)元放電頻率顯著減低，減幅為（51.9±4.1）%（P<0.01，圖2C、E）。30只焦慮大鼠VTA共鑒定出40個(gè)DA神經(jīng)元，微量注射MCH后，其中18個(gè)DA神經(jīng)元放電頻率顯著增加（MCH-E），增幅為（92.4±20.8）%（P<0.01，圖2B、E）；22個(gè)DA神經(jīng)元放電頻率顯著減低（MCH-I），減幅為（66.1±13.9）%（P<0.01，圖2D、E）。而VTA內(nèi)預(yù)先注射MCHR1拮抗劑SNAP94847，MCH對(duì)DA神經(jīng)元的興奮或抑制效應(yīng)可被顯著抑制（P<0.01，圖2A～E）。此外，與正常大鼠1MCH組相比，焦慮大鼠1MCH組VTA內(nèi)DA神經(jīng)元受MCH激活或抑制程度更顯著（P<0.05，圖2E）。

3 SNAP94847對(duì)大鼠焦慮行為的影響

與正常+NS組大鼠相比，焦慮+NS組大鼠進(jìn)入閉合臂的次數(shù)和時(shí)間百分比顯著減少（P<0.05），而與焦慮+NS組大鼠相比，焦慮+SNAP94847組大鼠進(jìn)入閉合臂的次數(shù)和時(shí)間百分比顯著增高（P<0.05），見(jiàn)圖3。

4 SNAP94847對(duì)正常及焦慮大鼠胃黏膜炎癥及中性粘液物含量的影響

觀(guān)察MCHR1信號(hào)通路對(duì)正常及焦慮大鼠胃部炎癥影響，結(jié)果顯示，與正常+NS大鼠相比，焦慮+NS組大鼠胃黏膜可見(jiàn)出血性病變，且胃黏膜中中性黏液物質(zhì)分泌水平顯著降低（P<0.05）；與焦慮+NS大鼠相比，焦慮+SNAP94847組大鼠出血潰瘍病變減輕，且胃黏膜中中性黏液物質(zhì)分泌水平顯著升高（P<0.05），見(jiàn)圖4。

5 SNAP94847對(duì)正常及焦慮大鼠胃黏膜炎癥標(biāo)志物水平的影響

進(jìn)一步觀(guān)察MCHR1信號(hào)通路對(duì)正常及焦慮大鼠胃部炎癥影響，與對(duì)照組相比，焦慮大鼠炎癥標(biāo)志物CAT活性顯著降低（P<0.05，圖5A），而MPO活性顯著升高（P<0.05，圖5C），GSH-Px含量顯著降低（P<0.05，圖5B），MDA、TNF-α和IL-6含量顯著升高（P<0.05，圖5D、E和F）；與焦慮+NS大鼠相比，焦慮+SNAP94847組大鼠CAT活性顯著升高（P<0.05，圖5A），而MPO活性顯著降低（P<0.05，圖5C），GSHPx含量顯著升高（P<0.05，圖5B），MDA、TNF-α和IL-6含量顯著降低（P<0.05，圖5D、E和F）。

6 電損毀DMV對(duì)焦慮大鼠胃黏膜炎癥損傷的影響

與假損毀+NS組相比，假損毀+SNAP94847組大鼠CAT活性顯著升高（P<0.05，圖6A），GSH-Px含量顯著升高（P<0.05，圖6B），而MPO活性顯著降低（P<0.05，圖6C），MDA、TNF-α和IL-6含量顯著降低（P<0.05，圖6D、E和F）；與假損毀+SNAP94847組相比，電損毀+SNAP94847組大鼠CAT活性顯著降低（P<0.05，圖6A），GSH-Px含量顯著降低（P<0.05，圖6B），而MPO活性顯著升高（P<0.05，圖6C），MDA、TNF-α和IL-6含量亦顯著升高（P<0.05，圖6D、E和F）。

討 論

本項(xiàng)工作采用熒光金逆行追蹤結(jié)合免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)，探究了VTA至DMV之間的神經(jīng)投射，以及VTA內(nèi)熒光金與MCHR共存的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠中樞存在VTA-DMV的MCHR神經(jīng)通路，而VTA對(duì)情緒相關(guān)的焦慮及應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控，是否通過(guò)DMV而實(shí)現(xiàn)，目前還不明確。根據(jù)本研究結(jié)果顯示，DMV作為中樞參與內(nèi)臟感覺(jué)及內(nèi)臟運(yùn)動(dòng)的重要神經(jīng)核團(tuán)，很有可能是VTA參與焦慮及應(yīng)激反應(yīng)的下游核團(tuán)之一。

Figure 2.The changes of dopamine（DA）neurons in the VTA of normal and anxiety rats.A：the normal rat MCH-excitatory（MCHE）neurons；B：the normal rat MCH-inhibitory（MCH-I）neurons；C：the anxiety rat MCH-E neurons；D：the anxiety rat MCH-Ineurons；E：the discharge frequency change rate of the DA neurons.The activation of DA neurons in the VTA was significantly inhibited by pretreatment with SNAP94847，an MCHR1 antagonist.The activation or inhibition of DA neurons in the VTA of anxiety rats was more significant than that of normal rats.Mean±SD.n=30.**P<0.01 vs NSgroup of the nor‐mal rats；#P<0.05，##P<0.01 vs 1MCH group of the normal rats；▲▲P<0.01 vs NSgroup of the anxiety rats；△△P<0.01 vs 1MCH group of the anxiety rats.圖2 正常及焦慮大鼠VTA內(nèi)DA神經(jīng)元放電活動(dòng)變化

Figure 3.Effects of SNAP94847 on elevated plus maze（EPM）experiments in normal and anxiety rats.The percentage changes of times（A）and time（B）of open arm entries in the EPM experiment were determined.Mean±SD.n=30.*P<0.05 vs nor‐mal+NSgroup；#P<0.05 vs anxiety+NSgroup.圖3 SNAP94847對(duì)正常及焦慮大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)的影響

Figure 4.Effect of SNAP94847 on the gastric mucositis and injury in normal and anxiety rats.The pictures of gastric mucosa（nakedeye view）and the images of Alcian blue（AB）-periodic acid-Schiff（PAS）staining were shown，and the percentage of neu‐tral mucus with AB-PASstaining was determined.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs normal rats+NSgroup；#P<0.05 vs anxiety rats+NSgroup.圖4 SNAP94847對(duì)正常及焦慮大鼠胃黏膜炎癥及損傷影響

VTA內(nèi)DA神經(jīng)元已被證實(shí)為針對(duì)應(yīng)激刺激最為活躍的神經(jīng)元之一［22］，本研究采用電生理實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究VTA內(nèi)DA神經(jīng)元的興奮性變化及放電活動(dòng)。小鼠在壓力刺激環(huán)境中DA神經(jīng)元放電活動(dòng)可明顯增強(qiáng)，且該效應(yīng)隨著小鼠對(duì)應(yīng)激刺激的適應(yīng)而逐漸減弱［23］。但是，VTA內(nèi)DA神經(jīng)元具體實(shí)現(xiàn)其參與應(yīng)激反應(yīng)作用的潛在機(jī)制尚未明確。MCH是一種促進(jìn)焦慮所致應(yīng)激反應(yīng)的神經(jīng)遞質(zhì)［24］。本研究的電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VTA微量注射MCH可顯著改變DA神經(jīng)元放電活動(dòng)，且與正常大鼠1MCH組相比，焦慮大鼠1MCH組VTA內(nèi)DA神經(jīng)元受MCH激活或抑制程度更顯著；此外，MCHR1拮抗劑SNAP94847可顯著抑制MCH對(duì)DA神經(jīng)元的影響，因此可推測(cè)MCHR信號(hào)可影響DA神經(jīng)元放電活動(dòng)，并且可能參與大鼠應(yīng)激性焦慮的調(diào)控。

Figure 5.Efects of SNAP94847 on the indexes of gastric mucositis in normal and anxiety rats.A：CAT activity；B：GSH-Px content；C：MPOactivity；D：MDA content；E：TNF-αcontent；F：IL-6 content.The level of the inflammatory markers in anxiety rats changed significantly compared with the normal rats，while it could be inhibited by pretreatment with SNAP94847 in the VTA.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs normal+NSgroup；#P<0.05 vs anxiety+NSgroup.圖5 SNAP94847對(duì)正常及焦慮大鼠胃黏膜炎癥指標(biāo)的影響

Figure 6.Effects of electrical lesion of DMV on gastric mucositis in anxiety rats.A：CAT activity；B：GSH-Px content；C：MPOac‐tivity；D：MDA content；E：TNF-αcontent；F：IL-6 content.The CATactivity and GSH-Px content were significantly de‐creased，but MPO，MDA，TNF-αand IL-6 levels were significantly increased in electrical lesion+SNAP94847 group.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs sham lesion+NSgroup；#P<0.05 vs sham lesion+SNAP94847 group.圖6 電損毀DMV對(duì)焦慮大鼠胃膜炎癥損傷影響

EPM實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀(guān)察VTA微量注射SNAP94847對(duì)大鼠的行為學(xué)變化影響。根據(jù)EPM實(shí)驗(yàn)原理，大鼠進(jìn)入閉合臂的次數(shù)和時(shí)長(zhǎng)與焦慮程度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系［25］，焦慮+NS組大鼠進(jìn)入閉合臂的次數(shù)和時(shí)間百分比顯著減少，而在VTA微量注射SNAP94847可減弱上述焦慮樣行為，但其潛在機(jī)制尚未明確，是否涉及VTA-DMV神經(jīng)通路，還需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

應(yīng)激性潰瘍的發(fā)生主要是由于胃腸血供不足，胃腸黏膜分泌碳酸氫鹽黏液減少，胃黏膜屏障受損引起H+反向彌散至胃黏膜，導(dǎo)致大量H+聚集自我消化，進(jìn)而誘發(fā)潰瘍發(fā)生［26］，且有報(bào)道證明慢性應(yīng)激可使大鼠血管活性物質(zhì)一氧化氮和炎癥因子表達(dá)增多［27］，應(yīng)激所致焦慮可誘導(dǎo)小鼠血液中炎癥因子IL-6水平升高［28］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，焦慮組大鼠胃黏膜損傷嚴(yán)重，抗氧化酶活性下降，炎癥因子水平升高。而在VTA注射MCH受體拮抗劑SNAP94847則增強(qiáng)抗氧化酶活性，抑制炎癥因子水平，顯著緩解胃黏膜損傷。據(jù)此推測(cè)SNAP94847對(duì)大鼠胃黏膜可能存在某種保護(hù)作用，其作用位點(diǎn)可能位于中樞VTA并涉及MCHR信號(hào)通路。VTA微量注射SNAP94847可能改變了MCH反應(yīng)性多巴胺神經(jīng)元的放電活動(dòng)，從而使DA電沖動(dòng)信號(hào)傳遞至DMV核團(tuán)，進(jìn)而調(diào)控胃腸功能。此外，不能排除SNAP94847與其他神經(jīng)核團(tuán)或其他神經(jīng)遞質(zhì)存在間接聯(lián)系的可能性，因此需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究。

目前已證實(shí)DMV為腦干-胃腸道調(diào)控初級(jí)中樞［29］。在大鼠束縛實(shí)驗(yàn)中，DMV內(nèi)c-Fos表達(dá)明顯增多，同時(shí)，大鼠胃部運(yùn)動(dòng)的生理功能顯著降低，胃分泌功能明顯減弱［30］，提示DMV可能參與調(diào)控大鼠胃部機(jī)能的正?；顒?dòng)。與假損毀+SNAP94847組相比，電損毀DMV且預(yù)先在VTA注射SNAP94847大鼠的胃黏膜損傷程度顯著升高，因此可推測(cè)，VTA-DMV神經(jīng)通路可參與調(diào)控大鼠焦慮所致的胃黏膜炎癥損傷，且MCHR信號(hào)通路參與其中。

綜上所述，MCH受體1拮抗劑SNAP94847可能通過(guò)VTA-DMV神經(jīng)通路改變MCH反應(yīng)性DA神經(jīng)元活性，直接或間接參與調(diào)控焦慮模型大鼠焦慮樣行為，并對(duì)胃黏膜應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)，其潛在機(jī)制還需進(jìn)一步研究探索。