徐培聲,林嘉偉,俞美聲,譚秋嬋,朱林燕,彭 爽,陳麗新,王 亮 王立偉△
(暨南大學(xué)基礎(chǔ)與公共衛(wèi)生學(xué)院1生理學(xué)系,3藥理學(xué)系,4病理生理學(xué)系,廣東廣州510632;2佛山市第一人民醫(yī)院,廣東佛山528000;5暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科,廣東廣州510632;6廣州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院生理學(xué)系,廣東廣州510180)
鼻咽癌是一種發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的上皮癌,集中發(fā)病于我國(guó)廣東、廣西等南部地區(qū)。使用順鉑(cisplatin,Cisp)化療的同時(shí)進(jìn)行放療是常用的治療晚期鼻咽癌手段之一[1]。然而順鉑的作用機(jī)制尚不十分明確。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),順鉑可激活低分化鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞氯電流[2],ClC-3氯通道參與了雙氫青蒿素和唑來膦酸所誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞凋亡[3-4]。文獻(xiàn)報(bào)道,活性氧(reactive oxygen species,ROS)對(duì)氯通道發(fā)揮其生物學(xué)功能特性具有一定作用[5]。而ClC-3氯通道和ROS在順鉑誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制,目前還不清楚。本文主要探討ClC-3氯通道是否參與順鉑誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞凋亡,以及ROS在其中所發(fā)揮的作用,為探討氯離子通道在抗腫瘤中的作用提供更多的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
本實(shí)驗(yàn)所用的人低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z由廣東醫(yī)科大學(xué)唐慰萍教授惠贈(zèng)。
5-二苯基溴化四氮唑噻唑藍(lán)[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromide,MTT]、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、4,4'-二異硫氰酸基-2,2'-二苯乙烯磺酸二鈉(4,4'-Diisothiothiocy‐anatostilbene-2,2'-disulfonic acid disodium salt hy‐drate,DIDS)與N-乙酰-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cys‐teine,L-NAC)購(gòu)于Sigma;順鉑購(gòu)自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司,使用前用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至所需濃度;RPMI-1640培養(yǎng)基與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染專用培養(yǎng)液購(gòu)于Gib‐co;胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)購(gòu)于Biologi‐cal Industries;活性氧檢測(cè)試劑盒與RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)于碧云天公司;ClC-3抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology;GAPDH抗體購(gòu)于Proteintech;山羊抗兔辣根過氧化物酶IgG(H+L)購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;siRNA購(gòu)于吉瑪;Annexin VFITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)于凱基生物。DIDS溶解于DMSO中,配制成50 mmol/L的儲(chǔ)存液,實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋成100μmol/L的工作溶液。L-NAC用PBS溶解,配制成100 mmol/L的儲(chǔ)存液,實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋成1 mmol/L的工作溶液。
3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用于CNE-2Z細(xì)胞培養(yǎng)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基內(nèi)含有10%FBS、1×105U/L的青霉素以及100 mg/L的鏈霉素。細(xì)胞在37℃、濕度飽和的5%CO2細(xì)胞孵育箱內(nèi)培養(yǎng)生長(zhǎng)。每48 h進(jìn)行傳代。
3.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 把處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的CNE-2Z細(xì)胞以每孔約7×103接種于96孔板,設(shè)6個(gè)復(fù)孔。待其貼壁,更換含有不同濃度順鉑(0.625~160μmol/L)的完全培養(yǎng)基,37℃下分別培養(yǎng)24 h和48 h后,每孔加入15μL的MTT,37℃培育4 h。棄除培養(yǎng)基,每孔加入150μL的DMSO,振蕩孔板,37℃孵育10 min,以充分溶解結(jié)晶。在酶標(biāo)儀上測(cè)定480 nm波長(zhǎng)處吸光度(A)值,以空白組調(diào)零,對(duì)比對(duì)照組,得到實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的存活率,用GraphPad Prism 8軟件計(jì)算順鉑24 h和48 h的IC50值。
3.3 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率CNE-2Z細(xì)胞以每孔約1.5×105接種于6孔板,待其貼壁,更換為含5μmol/L和10μmol/L順鉑的完全培養(yǎng)基,37℃下分別培養(yǎng)24 h和48 h。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化收集處理后,PBS洗滌細(xì)胞2次,用低速冷凍離心機(jī)以2 000 r/min離心5 min,收集細(xì)胞。去除PBS,先加入200μL的Binding Buffer重新懸浮細(xì)胞,再分別加入2μL的Annexin V-FITC和PI混勻。室溫避光,讓其反應(yīng)5~15 min后,在流式細(xì)胞儀上樣檢測(cè)凋亡。
3.4 細(xì)胞ROS檢測(cè) 消化收集細(xì)胞,用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基沖洗后,加入以1∶1 000稀釋熒光探針DCFH-DA的無血清培養(yǎng)基,37℃避光孵育30 min,重復(fù)清洗。用多功能微孔板檢測(cè)儀設(shè)置488 nm的激發(fā)波長(zhǎng),525 nm的發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行DCF連續(xù)實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度檢測(cè),每分鐘收集一個(gè)數(shù)據(jù)。另外,用ROS檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ROS含量,各步驟按照生產(chǎn)廠家說明進(jìn)行,在流式細(xì)胞儀進(jìn)行ROS檢測(cè)。
3.5 轉(zhuǎn)染ClC-3 siRNA 細(xì)胞種板貼壁后,將轉(zhuǎn)染試劑放置常溫,使用前輕輕晃勻。用無血清和抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋轉(zhuǎn)染試劑Lipofectami‐neTM2000和待轉(zhuǎn)染的siRNA至合適體積,將二者混勻成轉(zhuǎn)染復(fù)合體,室溫靜置5 min。用無血清培養(yǎng)液洗孔板中的細(xì)胞2~3次,在每孔加入2 mL培養(yǎng)液,把siRNA和轉(zhuǎn)染試劑形成的轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻地加入6孔板內(nèi),每孔400μL,6 h后更換為含血清培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后完成轉(zhuǎn)染。除ClC-3 siRNA轉(zhuǎn)染組外,另外設(shè)置陰性對(duì)照(negative control,NC)siRNA組。ClC-3 siRNA正義鏈為5'-CAAUGGAUUUCCU‐GUCAUATT-3',反義鏈為5'-UAUGACAGGAAAUC‐CAUUGTA-3';NC siRNA正 義 鏈 為5'-UUCUCC‐GAACGUGUCACGUTT-3',反 義 鏈 為5'-ACGUGA‐CACGUUCGGAGAATT-3'。
3.6 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集CNE-2Z細(xì)胞,PBS洗凈后加入合適的RIPA細(xì)胞裂解液,4℃冰上裂解30 min,再用高速冷凍離心機(jī)以12 000 r/min離心15 min。提取上清的蛋白溶液,用BCA法進(jìn)行蛋白定量。制備10%的SDS-PAG,加入樣品蛋白后,首先80 V電泳至Marker彼此分開,然后轉(zhuǎn)換成120 V。其次把蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉2 h。再以1∶800稀釋的ClC-3Ⅰ抗,4℃過夜孵育,TBST洗滌后,以1∶3 000稀釋的山羊抗兔辣根過氧化物酶IgG常溫孵育2 h。最后洗凈PVDF膜,利用凝膠成像系統(tǒng)顯影,采用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行圖像分析,測(cè)定灰度值。以GAPDH為內(nèi)參照,計(jì)算相對(duì)比值。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上,數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。用單因素方差分析(one-way ANO‐VA)檢驗(yàn)均數(shù)差異顯著性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
如圖1A所示,順鉑抑制CNE-2Z細(xì)胞生長(zhǎng),隨著順鉑的濃度增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞活力逐漸降低,24 h和48 h時(shí)的IC50值分別為11.76μmol/L和5.05μmol/L。凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1B所示,5μmol/L順鉑組24 h和48 h凋亡率分別為(16.49±2.37)%和(42.27±4.83)%;10μmol/L順鉑組24 h和48 h凋亡率分別為(44.68±4.80)%和(84.98±5.19)%。表明順鉑誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞的凋亡作用存在時(shí)間和濃度依賴性。
為了探討氯通道在順鉑誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞凋亡中的作用,我們觀察了氯通道阻斷劑DIDS對(duì)順鉑誘導(dǎo)的凋亡的影響。結(jié)果顯示,氯通道阻斷劑DIDS(100μmol/L)可顯著抑制順鉑誘導(dǎo)的CNE-2Z細(xì)胞凋亡,如圖1C所示,DIDS+Cisp組24 h細(xì)胞凋亡率為(29.69±3.57)%,與Cisp組凋亡率(40.36±3.14)%相比,凋亡率顯著降低(P<0.05)。兩組細(xì)胞48 h的凋亡率分別為(86.93±5.85)%和(41.29±5.71)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與對(duì)照(control,Ctrl)組相比,DIDS組的細(xì)胞凋亡率沒有明顯改變(P>0.05)。以上結(jié)果表明,氯通道阻斷劑可抑制順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,提示氯通道在一定程度上參與了順鉑誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞的凋亡。
為進(jìn)一步研究參與順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的氯通道類型,我們觀察了順鉑作用后ClC-3氯通道表達(dá)的變化。結(jié)果如圖2A所示,順鉑可促進(jìn)ClC-3蛋白的表達(dá),與對(duì)照組相比,差異有顯著性(P<0.05)。我們進(jìn)一步用ClC-3 siRNA下調(diào)細(xì)胞ClC-3的表達(dá),觀察細(xì)胞凋亡的變化。由圖2B可以看出,ClC-3 siRNA可顯著下調(diào)ClC-3表達(dá)(P<0.01)。與Cisp組相比,ClC-3 siRNA+Cisp組凋亡率下降,順鉑作用細(xì)胞24 h的時(shí)候凋亡抑制率為32%(P<0.01),見圖2C。結(jié)果提示ClC-3氯通道參與了順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
為了研究ROS在順鉑誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞凋亡中的作用,我們用多功能微孔板檢測(cè)儀實(shí)時(shí)檢測(cè)了順鉑對(duì)ROS的影響,結(jié)果如圖3A所示,順鉑作用后在很短暫時(shí)間內(nèi)就誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞產(chǎn)生ROS,作用30 min左右時(shí)ROS比加藥前提高約65%(P<0.01),達(dá)到一個(gè)較穩(wěn)定的水平。氯通道阻斷劑DIDS對(duì)順鉑誘導(dǎo)的ROS提高沒有影響。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明,抗氧化劑L-NAC(1 mmol/L)幾乎完全抑制順鉑所致的ROS升高(圖3B),并且使細(xì)胞細(xì)胞凋亡率從(43.53±3.15)%明 顯 下 調(diào) 至(18.57±2.57)%(P<0.01),見圖3C。上述結(jié)果提示,順鉑通過刺激CNE-2Z細(xì)胞生成ROS而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
在上述結(jié)果基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步探討ROS、ClC-3在順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的相關(guān)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,用抗氧化劑L-NAC抑制細(xì)胞產(chǎn)生ROS后,順鉑誘導(dǎo)的ClC-3蛋白表達(dá)被抑制(圖4A)。10μmol/L順鉑作用細(xì)胞24 h后,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的ROS水平,結(jié)果顯示,ClC-3 siRNA+Cisp組的ROS水平與順鉑組相比無顯著性差異(P>0.05),ClC-3 siRNA組和無序siRNA組之間ROS水平也無顯著性差異(P>0.05),表明下調(diào)ClC-3蛋白表達(dá)水平不影響ROS水平,提示ROS在ClC-3的上游發(fā)揮作用。以上結(jié)果提示,ROS調(diào)控ClC-3介導(dǎo)的順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
Figure 1.Cisplatin-induced apoptosis of CNE-2Z cells was inhibited by chloride channel blockers(DIDS).MTT assay was used to determine the viability of cells treated with cisplatin.A:viability curve after treatment with cisplatin for 24 h and 48 h;B:the apoptosis induced by cisplatin was detected by Annexin V-FITC/PI double staining assay;C:the inhibitory effects of the chloride channel blocker,DIDS(100μmol/L),on cisplatin-induced apoptosis for 24 h and 48 h.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05 vs Cisp group.圖1 氯通道阻斷劑DIDS抑制順鉑誘導(dǎo)的CNE-2Z細(xì)胞凋亡
細(xì)胞凋亡異常在腫瘤以及許多疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。多種抗腫瘤藥物通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而起到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。凋亡誘導(dǎo)劑可激活細(xì)胞膜氯通道,伴隨水的外流而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡性容積減小,促發(fā)細(xì)胞凋亡[6-8]。氯通道是機(jī)體體內(nèi)最常見的陰離子通道,介導(dǎo)細(xì)胞膜內(nèi)外氯離子及其他多種陰離子的流動(dòng),廣泛參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、自噬以及細(xì)胞器酸化等多種細(xì)胞生理過程。我們前文報(bào)道,紫杉醇和阿霉素可能通過激活氯通道而發(fā)揮抗腫瘤作用[9-10]。順鉑是一種常用的化療藥物,順鉑可以激活氯電流,該電流對(duì)容積變化敏感[11]。氯通道的類型較多,參與順鉑抗腫瘤作用的氯通道類型及其作用機(jī)制目前尚不清楚,本文探討了ClC-3氯通道在順鉑誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞凋亡中的作用。
Figure 2.Inhibition of ClC-3 protein expression suppressed the apoptosis induced by cisplatin.A:the representative band of ClC-3 and control protein(GAPDH)after treatment with cisplatin for 24 h and the intensity ratio of ClC-3 band to the standard band GAPDH;B:ClC-3 expression after treatment with negative siRNA and ClC-3 siRNA;C:down regulating ClC-3 in‐hibited cisplatin-induced apoptosis.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs 0μmol/L group;△△P<0.01 vs Ctrl group;##P<0.01 vs Cisp group.圖2 抑制ClC-3蛋白表達(dá)可降低順鉑誘導(dǎo)的CNE-2Z細(xì)胞凋亡
本研究結(jié)果表明,順鉑時(shí)間和濃度依賴性抑制CNE-2Z細(xì)胞生長(zhǎng),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,該作用可被氯通道阻斷劑所抑制,表明氯通道參與了順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。氯通道有多種類型,包括囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)器(CFTR)、電壓門控氯通道(ClC)、細(xì)胞容積調(diào)節(jié)性氯通道(VRAC)以及配體門控性氯通道。ClC-3是ClC電壓門控氯通道家族的一員。ClC-3氯通道由CLCN3基因編碼[12],廣泛分布在各種器官與細(xì)胞中[13-14],尤其在腫瘤細(xì)胞中具有較高活性[15]。ClC-3在質(zhì)膜、細(xì)胞核和細(xì)胞器上都有表達(dá),在細(xì)胞的增殖、遷移和耐藥等中起重要作用[16-18]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),ClC-3可能是紫杉醇和蟾蜍二烯羥酸等多種抗腫瘤藥物作用的靶點(diǎn)之一,ClC-3的過表達(dá)是胃癌患者預(yù)后不佳的生物標(biāo)志,XRCC5調(diào)控ClC-3在胃癌中的表達(dá)和功能,ClC-3在胃癌中主要生物學(xué)功能是參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移,PI3K/Akt信號(hào)通路為其下游主要信號(hào)通路[19]。蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯激活細(xì)胞ClC-3氯通道,同時(shí)抑制PIK3/Akt/mTOR,導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[20]。H2O2促進(jìn)原來不易進(jìn)入細(xì)胞的熒光染料進(jìn)入細(xì)胞,而氯通道阻斷劑可阻抑細(xì)胞攝取熒光染料[7]。文獻(xiàn)報(bào)道,抑制ClC-3表達(dá)對(duì)順鉑誘導(dǎo)的人卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥株SKOV3/DDP細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用[21],推測(cè)可能與該通道參與調(diào)節(jié)藥物跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn),提高耐藥細(xì)胞內(nèi)藥物濃度和細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性有關(guān)?;熕幬镒仙即伎缮险{(diào)ClC-3蛋白的表達(dá),參與細(xì)胞凋亡[9]。高糖在誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡的同時(shí),ClC-3表達(dá)也上調(diào)[22]。ClC-3蛋白還參與CNE-2Z細(xì)胞的自噬[23]。本研究發(fā)現(xiàn),順鉑促進(jìn)CNE-2Z細(xì)胞ClC-3蛋白表達(dá),ClC-3 siRNA下調(diào)細(xì)胞ClC-3的表達(dá)可使細(xì)胞凋亡率明顯下降,提示ClC-3可能是順鉑致凋亡作用的靶點(diǎn)之一。
Figure 3.The antioxidant L-NACsuppressed cisplatin-induced apoptosis.A:the levels of ROSunder different treatments.The level of ROSincreased after the stimulation with cisplatin.B:the antioxidant L-NACinhibited the Cisp-induced release of ROS.C:the inhibitory effect of L-NACon Cisp-induced apoptosis for 24 h.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs Ctrl group;##P<0.01 vs Cisp group.圖3 抗氧化劑L-NAC抑制順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制復(fù)雜,caspase途徑、p53、死亡結(jié)構(gòu)域家族、Bcl家族和三磷酸鳥苷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多條凋亡通路參與順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。順鉑還可通過增加細(xì)胞胞內(nèi)的氧化自由基提高其活性以及下調(diào)細(xì)胞中抗氧化酶類活性,從而對(duì)細(xì)胞造成氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本文結(jié)果顯示,無論用氯通道阻斷劑還是利用siRNA干擾ClC-3氯通道的表達(dá),都只能部分抑制順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡效應(yīng),表明除了氯通道以外,還存在其他的作用靶點(diǎn)參與順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
Figure 4.Cisplatin-induced ClC-3 protein expression was inhibited by L-NAC.A:the ClC-3 protein expression under different treat‐ments;B:the ROSlevel detected by flow cytometry under the indicated conditions.After treatment with cisplatin,the ROSlevel in CNE-2Z cells was significantly increased but had little change in cells which transfected with CLC-3 siRNA.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs Cisp group;##P<0.01 vs Ctrl group;△△P<0.01 vs NCsiRNA group;▲▲P<0.01 vs ClC-3 siRNA group.圖4 順鉑誘導(dǎo)的ClC-3蛋白表達(dá)上調(diào)被L-NAC抑制
高濃度的活性氧會(huì)引起氧化應(yīng)激反應(yīng)并直接損傷細(xì)胞,觸發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡?;钚匝跖c氯通道有密切的關(guān)系,ROS在ClC-3內(nèi)部二硫鍵的形成和半胱氨酸硫代陰離子的修飾中發(fā)揮了重要作用,對(duì)ClC-3的表達(dá)和功能至關(guān)重要[24]。H2O2激活氯通道,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,提示活性氧可能是調(diào)控氯通道開放的重要因素[7]。活性氧能激活VSOR氯通道,引起調(diào)節(jié)性細(xì)胞容積回縮[25]??谇击[狀細(xì)胞可以通過ROSAMPK通路而影響順鉑對(duì)細(xì)胞的自噬以及凋亡作用[26],欖香烯能通過該途徑增強(qiáng)順鉑對(duì)膀胱癌細(xì)胞的凋亡作用[26]。唑來膦酸通過升高細(xì)胞內(nèi)ROS含量,激活氯電流,誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞發(fā)生凋亡[4]。LNAC是一種有效的抗氧化劑,具有干擾自由基生成和清除自由基的功能。我們前文報(bào)道[23],鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞在無血清培養(yǎng)液處理下,產(chǎn)生活性氧ROS,并上調(diào)ClC-3蛋白表達(dá)。本研究結(jié)果表明,順鉑促使CNE-2Z細(xì)胞ROS升高和ClC-3蛋白表達(dá)上調(diào),抗氧化劑L-NAC非常有效地阻斷這些作用,使細(xì)胞凋亡率明顯下降。而下調(diào)ClC-3表達(dá)水平并不能改變ROS的水平,以上結(jié)果提示,ROS可能在ClC-3的上游發(fā)揮作用,順鉑通過提升CNE-2Z細(xì)胞ROS水平,上調(diào)ClC-3氯通道蛋白而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。