魏寒梅，劉 潔

(1 廣州華夏職業(yè)學(xué)院衛(wèi)生健康學(xué)院，廣東 廣州 510935；2 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 510007)

阿爾茲海默癥(AD)是一種常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，是僅次于心血管疾病、癌癥和腦卒中的第四大致死疾病。石杉?jí)A甲(Huperzine A，HupA)，是從中國(guó)民間草藥千層塔中分離得到的新型石松類生物堿單體，作為膽堿酯酶抑制劑常被用于臨床治療AD[1]。蝦青素(Astaxantin，AXT)，一種極具潛力的類胡蘿卜素，具有清除自由基、延緩衰老、降低脂質(zhì)過(guò)氧化等多種生物活性，近年來(lái)在醫(yī)藥領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[2]。我們前期工作發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)給藥相比，聯(lián)合應(yīng)用能顯著提高對(duì)AD模型的保護(hù)作用[3]。然而由于血腦屏障(Blood-Brain Barrier, BBB)能阻礙肽類、多數(shù)極性小分子、大分子藥物入腦，成為了AD等神經(jīng)退行性疾病和其他腦部疾病治療中的一大障礙[4]。脂質(zhì)體(Lipsomes)作為一種新興的制劑類型，一直是納米制劑領(lǐng)域的重點(diǎn)研究方向之一，具有可修飾靶向性、生物利用度高、刺激性小、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)[5-7]。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)脂質(zhì)體同時(shí)包封石杉?jí)A甲和蝦青素，以包封率為指標(biāo)，對(duì)復(fù)方脂質(zhì)體制備的處方工藝影響因素進(jìn)行考察與優(yōu)化，為后期的研發(fā)工作奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

AUW120D型電子天平，日本島津公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；JY92型細(xì)胞超聲破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；LC-20A型高效液相色譜儀，日本島津公司；RE311型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本雅馬拓公司；ZS90型激光納米粒度儀，英國(guó)馬爾文公司；FEI Tecnai G2 Spirit型透射電子顯微鏡，美國(guó)FEI公司。

大豆卵磷脂(純度>98%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；膽固醇(純度>95%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡聚糖凝膠-G50，北京化學(xué)試劑公司；石杉?jí)A甲原料藥(含量>98%)，浙江萬(wàn)邦藥業(yè)有限公司；蝦青素原料藥(含量>98%)，四川省維克奇生物科技有限公司；蝦青素對(duì)照品(HPLC≥98%)，四川省維克奇生物科技有限公司；石杉?jí)A甲對(duì)照品(HPLC≥98%)，四川省維克奇生物科技有限公司；其他試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄膜—超聲法制備復(fù)方石杉?jí)A甲-蝦青素脂質(zhì)體[8-9]

分別稱取大豆磷脂、膽固醇、石杉?jí)A甲和蝦青素適量，加氯仿20 mL 溶解，在40 ℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行旋蒸，出現(xiàn)均勻薄膜后，加入適量pH 6.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，至形成均勻乳液，冰水浴探頭超聲后過(guò)0.45 μm微孔濾膜，既得。

2.2 包封率的測(cè)定

2.2.1 色譜條件

石杉?jí)A甲色譜條件：Agilent C8色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.02 mol/L磷酸二氫鉀(pH值為3.90)-乙腈 (86:14)； 檢測(cè)波長(zhǎng)：313 nm； 流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。

蝦青素色譜條件： Symmetry C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm, Waters, USA)；流動(dòng)相：甲醇-水(89:11)；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃ 檢測(cè)波長(zhǎng)：476 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

石杉?jí)A甲對(duì)照品溶液：精密稱定10.12 mg，置于20 mL量瓶?jī)?nèi)，用80%(v/v)甲醇溶液溶解后并稀釋至刻度，配制成濃度為506 μg/mL的儲(chǔ)備液。

蝦青素對(duì)照品溶液：精密稱取5 mg蝦青素于100 mL容量瓶中，加6 mL二氯甲烷超聲輔助溶解，色譜甲醇定容至100 mL，得到濃度為50 μg/mL 的蝦青素儲(chǔ)備液。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密量取石杉?jí)A甲-蝦青素復(fù)方脂質(zhì)體 1 mL置于50 mL量瓶中，加適量 80%(v/v)甲醇溶液，45 kHz 超聲20 min使其破乳完全，取出放至室溫后，用80%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，離心取上清液過(guò)濾，備用。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

石杉?jí)A甲：分別精密移取儲(chǔ)備液適量，用80%(v/v)甲醇稀釋成濃度為5.06、10.12、25.30、40.48、50.60 μg/mL的系列質(zhì)量濃度的溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μL。以峰面積(A)對(duì)樣品質(zhì)量濃度(C,μg/mL)作線性回歸，得回歸方程 A=28.379 C-4.9862(r=0.9999，n=5)。表明石杉?jí)A甲在5.06～50.60 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

蝦青素：精密吸取 0.2、1、2、3、4、5 mL上述儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，得到濃度為1、5、10、15、20、25 μg/mL 的蝦青素待測(cè)液，按“色譜條件”項(xiàng)下進(jìn)樣，記錄蝦青素的峰面積。以蝦青素的濃度為橫坐標(biāo)(C)，以樣品峰面積為縱坐標(biāo)(A)，進(jìn)行線性回歸分析，得到蝦青素在濃度為1～25 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=203912X-49894(n=3，r=0.9998)，結(jié)果表明，蝦青素在1～25 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn)

石杉?jí)A甲：取上述石杉?jí)A甲系列溶液中5.06 μg/m L、25.30 μg/m L、40.48 μg/m L的溶液各五份，通過(guò)高效液相色譜儀進(jìn)樣分析測(cè)定記錄其峰面積，分別在日內(nèi)和日間重復(fù)測(cè)定，準(zhǔn)確考察日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果日內(nèi)、間變異系數(shù)在2.0%以內(nèi)，精密度符合實(shí)驗(yàn)要求。

蝦青素：取上述蝦青素系列溶液中0.05、0.2、1、5、25 μg/mL 五種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾后，按“色譜條件”項(xiàng)下進(jìn)樣測(cè)定，于一日內(nèi)連續(xù)測(cè)五次，以計(jì)算日內(nèi)精密度，同樣按“色譜條件”項(xiàng)下進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)測(cè)定三日，以計(jì)算日間精密度。結(jié)果日內(nèi)、間變異系數(shù)在2.0%以內(nèi)，精密度符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取六份脂質(zhì)體樣品溶液，按照2.2.3項(xiàng)下進(jìn)行供試品制備，結(jié)果石杉?jí)A甲、蝦青素的含量RSD值均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 回收率試驗(yàn)

石杉?jí)A甲：配制低，中，高3個(gè)濃度的石杉?jí)A甲80%甲醇溶液，精密移取上述溶液各1 mL，置于20 mL量瓶中，使得石杉?jí)A甲濃度為20.05，25.30，30.00 μg/mL。然后向其各加入處方量的空白脂質(zhì)體，按供試品制備項(xiàng)下方法制備溶液。結(jié)果回收率分別為98.59%±1.35%、98.21%±1.29%、99.94%±1.35%。

蝦青素：分別精密量取份空白脂質(zhì)體混懸液至量瓶中,分別加入三個(gè)濃度的蝦青素對(duì)照品溶液,加甲醇定容至刻度,分別進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,換算成實(shí)際測(cè)定濃度,計(jì)算方法回收率。結(jié)果回收率分別為97.70%±1.07%、100.42%±1.28%、99.38%±1.07%。

2.2.8 復(fù)方石杉?jí)A甲-蝦青素脂質(zhì)體包封率的測(cè)定[10]

精密移取石杉?jí)A甲-蝦青素脂質(zhì)體混懸液0.2 mL, 上樣于SepHadex-G50柱,PBS洗脫,流速1 mL/min,室溫下層析。用25 mL量瓶收集5-15管的洗脫液，加甲醇定容至刻度破乳，HPLC法分別測(cè)定石杉?jí)A甲、蝦青素的峰面積,代入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算藥物濃度并計(jì)算包裹在脂質(zhì)體中的石杉?jí)A甲、蝦青素含量。

精密量取復(fù)方脂質(zhì)體混懸液0.2 mL于10 mL量瓶中,甲醇定容至刻度,超聲5 min破乳。即包封率=W包/W總* 100%。

2.3 單因素優(yōu)化制備工藝

2.3.1 水相介質(zhì)pH 值對(duì)包封率的影響

暫定其余四項(xiàng)條件為：大豆磷脂濃度為 8 mg/mL；磷脂與膽固醇質(zhì)量比為3:1；藥脂比為1:15；石杉?jí)A甲與蝦青素的質(zhì)量比為5:1；考察PBS的pH值為3.0，4.0，5.0和6.0時(shí)對(duì)復(fù)方脂質(zhì)體包封率的影響。石杉?jí)A甲包封率分別為50.50%±1.67%、53.22%±2.35%、55.97%±0.73%、57.16%±1.28%，蝦青素包封率分別為39.24%±1.21%、40.76%±1.68%、43.68%±1.55%、48.69%±1.16%。結(jié)果表明：pH在6.0時(shí)兩個(gè)藥物的包封率均為最高，但pH的改變對(duì)包封率的改變影響不大。

2.3.2 大豆磷脂濃度對(duì)包封率的影響

固定PBS緩沖液pH值為6.0，磷脂與膽固醇質(zhì)量比為3:1；藥脂比為1:15；石杉?jí)A甲與蝦青素的質(zhì)量比為5:1，考察大豆磷脂濃度分別為 4，8，10，12 mg/mL對(duì)復(fù)方脂質(zhì)體包封率的影響。石杉?jí)A甲包封率分別為51.63%±0.54%、54.66%±2.02%、49.84%±1.09%、49.21%±0.62%，蝦青素包封率分別為37.31%±1.13%、47.22%±1.79%、49.17%±1.66%、40.89%±1.37%。結(jié)果表明：石杉?jí)A甲在大豆磷脂濃度為8 mg/mL時(shí)，包封率較高；蝦青素在大豆磷脂濃度為10 mg/mL時(shí)，包封率較高。考慮到磷脂濃度對(duì)石杉?jí)A甲的影響較大，因此選擇8 mg/mL進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.3.3 磷脂與膽固醇的質(zhì)量比對(duì)包封率的影響

固定PBS緩沖液pH值為6.0，藥脂比為1:15；石杉?jí)A甲與蝦青素的質(zhì)量比為5:1，大豆磷脂濃度分別為8 mg/mL，考察磷脂與膽固醇投料量質(zhì)量比分別為 2:1，3:1，4:1，5:1，6:1時(shí)對(duì)復(fù)方脂質(zhì)體包封率的影響。石杉?jí)A甲包封率分別為52.02%±1.49%、58.83%±0.98%、55.75%±1.73%、54.64%±0.79%，蝦青素包封率分別為47.37%±2.33%、53.65%±1.46%、51.18%±1.17%、48.91%±1.58%。結(jié)果表明：磷脂與膽固醇的質(zhì)量比在3:1時(shí)，兩藥的包封率較高。

2.3.4 藥脂比對(duì)包封率的影響

固定PBS緩沖液pH值為6.0，磷脂與膽固醇質(zhì)量比為3:1；石杉?jí)A甲與蝦青素的質(zhì)量比為5:1，大豆磷脂濃度分別為8 mg/mL，考察石杉?jí)A甲-磷脂藥脂比分別為1:10，1:15，1:20，1:25時(shí)對(duì)復(fù)方脂質(zhì)體包封率的影響。石杉?jí)A甲包封率分別為56.92%±1.65%、65.67%±2.33%、54.86%±0.69%、50.98%±1.43%，蝦青素包封率分別為41.71%±1.04%、55.85%±2.15%、44.67%±0.92%、42.39%±1.78%。結(jié)果表明：藥脂比為1:15時(shí)，包封率較高。當(dāng)投藥量較低時(shí)，由于投入的少量藥物大多在脂質(zhì)體的間隙游離，故包封率不高；當(dāng)投藥量較高時(shí)，由于超過(guò)了脂質(zhì)體的承載范圍，所以包封率不高。

2.3.5 石杉?jí)A甲與蝦青素的質(zhì)量比對(duì)包封率的影響

固定 PBS 緩沖液pH值為6.0，磷脂與膽固醇質(zhì)量比為3:1；藥脂比為1:15，大豆磷脂濃度分別為8 mg/mL，考察石杉?jí)A甲與蝦青素的質(zhì)量比1:1，3:1，5:1，7:1時(shí)對(duì)復(fù)方脂質(zhì)體包封率的影響。石杉?jí)A甲包封率分別為56.52%±1.03%、65.11%±1.06%、63.44%±1.82%、57.36%±0.93%，蝦青素包封率分別為41.54%±0.46%、48.48%±1.15%、45.92%±1.67%、43.27%±0.85%。結(jié)果表明：石蝦比在3:1時(shí)包封率最高。

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化脂質(zhì)體處方

2.4.1 因素與水平的選擇

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以包封率為指標(biāo)，排除影響不大的pH值因素，對(duì)處方工藝中的脂固比、藥脂比、磷脂濃度(mg/mL)、石-蝦比4個(gè)因素進(jìn)行篩選，以期得到包封率高、穩(wěn)定性好的復(fù)方脂質(zhì)體。

2.4.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)單因素結(jié)果選擇恰當(dāng)?shù)乃剑肔9(34)正交試驗(yàn)法優(yōu)化工藝處方，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表1，表2。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表2

以石杉?jí)A甲包封率為參考指標(biāo)：各因素重要性的程度為A>B>C>D，最優(yōu)組合為A2B2C2D2;以蝦青素包封率為參考指標(biāo)：各因素重要性程度為A>C>B>D，最優(yōu)組合為A2B3C2D1。因?yàn)槭級(jí)A甲的藥物含量占主要地位，所以選擇A2B2C2D2作為最優(yōu)方案。

2.5 驗(yàn)證性試驗(yàn)

按照正交試驗(yàn)給出的方案制備3批復(fù)方脂質(zhì)體樣品，測(cè)定包封率。測(cè)得石杉?jí)A甲包封率為65.35%±1.30%(n=3)、蝦青素包封率為50.42%±2.77%(n=3)。

2.6 脂質(zhì)體的形態(tài)學(xué)考察及粒徑電位測(cè)定

2.6.1 形態(tài)學(xué)考察

將滴有脂質(zhì)體稀釋液的銅網(wǎng)放在染液滴里(4%硅鎢酸溶液)約30 s，用濾紙吸干多余染液，自然揮干，用透射電子顯微鏡觀察并拍攝照片。

圖1 脂質(zhì)體透射電鏡照片(標(biāo)尺=100 nm)

2.6.2 粒徑電位的測(cè)定

脂質(zhì)體粒徑分布及大小通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定前將樣品經(jīng)過(guò)葡聚糖G-50凝膠柱去除游離藥，將樣品溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后放入相應(yīng)的樣品管后，置于馬爾文激光粒度儀中，分別測(cè)定脂質(zhì)體的粒徑大小。測(cè)得粒徑156.22 nm±3.71 nm (n=3)，多分散系數(shù)(PDI)為0.24±0.02 (n=3)。15日內(nèi)復(fù)方脂質(zhì)體的粒徑、PDI穩(wěn)定性見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 石杉?jí)A甲-蝦青素脂質(zhì)體的粒徑穩(wěn)定性

圖3 石杉?jí)A甲-蝦青素脂質(zhì)體的多分散系數(shù)穩(wěn)定性

3 結(jié) 論

石杉?jí)A甲、蝦青素均是脂溶性藥物，根據(jù)脂質(zhì)體的制備方法和特點(diǎn)，選擇了簡(jiǎn)便易行，有成熟工藝的薄膜分散-探頭超聲法進(jìn)行制備，能夠得到較高的包封率。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上運(yùn)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化制備工藝，結(jié)果表明磷脂濃度是影響包封率較大的因素，可能是與脂質(zhì)體的穩(wěn)定性有關(guān)。磷脂濃度過(guò)高，形成的脂質(zhì)體容易聚集，使藥物泄漏。此外，藥脂比是影響脂質(zhì)體包封率的主要因素。藥脂比越小(當(dāng)藥物含量一定時(shí)，脂質(zhì)含量越高時(shí))，藥物的包封率越高?？梢?jiàn)，脂質(zhì)膜材的比例會(huì)影響到藥物的包封率。但是減小藥脂比，脂質(zhì)體載藥量也將減小，并且藥脂比對(duì)于脂質(zhì)體在體內(nèi)外的釋藥特性也有影響。因此，選擇合適的藥脂比需要綜合考慮各種因素。此外，膽固醇起到調(diào)節(jié)磷脂流動(dòng)性的作用，磷脂與膽固醇的比例控制在2～7比較好[11]。